納米明膠硅氧烷的制備及其負載p53基因?qū)Ω伟┮种菩Ч?/h1>
2018-08-24 01:37:16，，，，，
浙江理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版) 2018年5期
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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)
0 引 言
原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性腫瘤，是世界上第五大常見癌癥，也是世界上癌癥死亡率較高的主要疾病之一[1]，在發(fā)展中國家，HCC發(fā)生率超過80%并在男性發(fā)病率中居第二位[2]。目前，治療肝癌有許多方法，包括手術(shù)切除、化療、局部消融和肝移植，但大多患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)展成為晚期不適合手術(shù)，且這些方法也存在顯著的毒性和高復(fù)發(fā)風(fēng)險[3-5]。目前在大多數(shù)國家中仍缺乏有效的治療方法，HCC的死亡率幾乎等于發(fā)病率[6]。因此，開發(fā)一種在提高肝癌患者預(yù)后能力和盡量減少與治療相關(guān)的毒性的治療方法是非常迫切的。
基因治療作為一種新興的治療方法，是依賴某種載體遞送核酸如質(zhì)粒DNA、siRNA和miRNA等進入患者細胞從而達到治療目的[7]，現(xiàn)已被廣泛認(rèn)為是治療許多疾病的有效方法，如心血管[8]、遺傳性疾病[9]、神經(jīng)性疾病[10]、惡性腫瘤[11]以及多基因誘導(dǎo)疾病如血友病[12]和肌肉萎縮癥[13]等。迄今為止，近2600個基因治療臨床試驗已經(jīng)完成并在全球獲得批準(zhǔn)[14]。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及人類基因組工程的完成，人類疾病DNA基因組學(xué)的深入研究，通過基因治療手段來治愈疾病的新模式策略也越來越為人所接受，但選擇一種高效、安全的基因載體和治療基因仍然是成功基因治療的巨大挑戰(zhàn)。
p53蛋白作為腫瘤抑制因子可參與多種細胞反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細胞周期阻滯、細胞凋亡、DNA修復(fù)、自噬、代謝、mRNA翻譯和反饋機制等方面起著重要作用[15]。p53基因的突變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，超過50%的癌癥(包括HCC)是由p53基因突變引起的[16]。用腺病毒作為基因載體重新引入野生型p53基因已經(jīng)達到臨床水平，其中也包括對HCC的治療[17-18]。脂質(zhì)體[15]和陽離子聚合物[19]的非病毒載體也越來越多地被用于p53基因傳遞治療HCC，引入野生型p53誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡而成為癌癥基因治療的一種新手段。
明膠硅氧烷納米顆粒(Gelatin siloxane nanoparticles，GS NPs)具有低毒性、可降解性、表面易吸附、易修飾性以及易重復(fù)合成等優(yōu)點，作為生物材料已被廣泛用于骨組織工程[20]、腦疾病治療[21-22]和基因藥物載體[23-24]等研究。由于GS NPs表面帶有較大量的正電荷，可作為一種潛在的基因載體材料，介導(dǎo)目的基因進入細胞并表達，但對于GS NPs負載治療基因?qū)Π┘毎男Ч麉s鮮有報道。本文采用溶膠-凝膠法探究不同的pH值鹽酸溶液對納米明膠硅氧烷制備的影響及其作為基因載體負載p53基因?qū)Ω伟┘毎囊种菩Ч?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
a) 材料：pEGFP-C1-p53(p53)質(zhì)粒為本實驗室所保存，明膠(100 g，美國BBI公司)，GPSM(3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)、APTMS((3-氨丙基)三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)，F(xiàn)ITC(異硫氰酸熒光素，10 mg，美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒、MTT粉末、PI(碘化丙啶)粉末、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(均購自上海碧云天公司)，LysoTracker Blue DND-22、BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，p53抗體(0.1 mL，美國Novus公司)，β-actin抗體(0.1 mL，美國Affinity公司)，鼠二抗、ECL試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。
b) 儀器：場發(fā)射掃描電鏡(ZEISS-ULTRA55，日本Hitachi公司)，動態(tài)光散射儀(LB-550 V，英國Malvern公司)，數(shù)顯控溫磁力攪拌器(78HW-3，杭州儀表電機有限公司)，凝膠成像儀(GGM/D2，GeneGenius公司)，酶標(biāo)儀(ELx 800，BioTek公司)，激光共聚焦顯微鏡(LSM710 3-channel，德國Zeiss公司)。
1.2 不同pH值條件下納米明膠硅氧烷的制備及表征
首先分別向20.0 mL的pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中加入0.15 g的明膠，40 ℃下加熱溶解，配成明膠溶液為0.75%。再向明膠溶液中分別加入0.20 g GPSM(185 μL)，于60 ℃，500 r/min的磁力恒溫攪拌器上攪拌30 min。然后向反應(yīng)體系中加入0.08 g APTMS(75 μL)，于60 ℃下繼續(xù)攪拌8～10 h。最后停止攪拌，以14000 r/min，20 ℃離心20 min，獲取白色沉淀，超聲分散水洗三遍后，以10.0 mL的ddH2O超聲波重新懸浮，即得到約4 mg/mL GS NPs懸浮液。
用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)對顆粒形貌進行觀察，動態(tài)光散射儀(DLS)分析其粒徑和表面Zeta電位。
1.3 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
選取pH值3.0鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，新鮮制備好的GS NPs重懸超聲分散，濃度為4 mg/mL，分別與pEGFP-C1-p53以10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1和200∶1的質(zhì)量比均勻混合，用ddH2O補齊體系，渦旋15 s，室溫孵育靜置60 min，即得到GS-p53納米復(fù)合物。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測GS-p53復(fù)合物中是否有pDNA溢出，評價納米顆粒對p53的包封效率。
1.4 納米復(fù)合物GS-p53的粒徑和表面Zeta電位分析
取新鮮制備的GS-p53納米復(fù)合物懸液，用ddH2O稀釋后加入1.2 mL至樣品池中，置于動態(tài)光散射儀上測定其粒徑和Zeta電位。
1.5 對p53基因的釋放性
按1.3中方法制備復(fù)合物懸液(質(zhì)量比為200∶1)，分成3等份，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)后，棄上清液，分別超聲重懸于相同體積的50、150 mmol/L和300 mmol/L的NaCl溶液中，并均置于200 r/min，37 ℃的搖床中振蕩30、60 min和120 min后，每組取出等體積的復(fù)合物懸浮液離心分離，進行凝膠電泳檢測上清液中是否有p53溢出。
1.6 納米明膠硅氧烷的生物相容性
本文采用CCK-8試劑盒檢測GS NPs對肝細胞的毒性。納米顆粒的無菌處理：將新鮮制備的GS NPs，14 000 r/min，20 ℃，離心20 min后棄上清，75%酒精超聲重懸至相同濃度，消毒30 min后，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)，用無菌水水洗三次，超聲分散到無血清培養(yǎng)基中，得到1 mg/mL的使用液，使用時根據(jù)實驗濃度要求稀釋。
取對數(shù)生長期的人肝正常細胞L-02以每孔100 μL，細胞密度為1×105個/mL接種于96孔板中，并放置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長良好后更換為含有不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)GS NPs的無血清培養(yǎng)基，其中每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。分別共培養(yǎng)24、48 h和72 h后，吸除舊培養(yǎng)液并用PBS洗兩次，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。避光加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1～2 h后，酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處的各孔吸光值(OD值)，并根據(jù)式(1)計算細胞存活率：
(1)
其中：X為細胞存活率；OD2為實驗組的OD值；OD1為對照組的OD值；OD0為Blank組的OD值。
1.7 GS-p53細胞內(nèi)攝取情況
熒光標(biāo)記的納米顆粒(FITC-GS NPs)的制備：取新鮮制備的GS NPs重懸于pH 值8.0的磷酸緩沖液中配成2～5 mg/mL的濃度。以GS NPs/FITC的比例為300∶1加入FITC溶液，避光室溫振蕩反應(yīng)1～2 h。14,000 r/min，20 ℃離心20 min后，棄上清，ddH2O超聲洗滌三次，得到FITC-GS NPs。熒光標(biāo)記的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物的制備：先將p53用PI進行標(biāo)記，將質(zhì)粒p53與PI以1∶1比例混勻，室溫避光孵育20 min后，即得到PI-p53質(zhì)粒。然后將FITC-GS NPs與PI-p53質(zhì)粒按1.3中的方法混合后離心棄上清(質(zhì)量比為200∶1)，即得到FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物。激光共聚焦樣品制備：取1.0 mL對數(shù)生長期、5×104個/mL的Hep-3b細胞接種于35 mm玻底培養(yǎng)皿(共聚焦專用培養(yǎng)皿)中，待細胞貼壁生長良好后，PBS洗滌兩次，更換為900 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，避光加入100 μL新鮮制備、2 mg/mL的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物懸液，分別共培養(yǎng)6 h和24 h。吸去舊培養(yǎng)液，PBS清洗兩次。更換為1.0 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入50 μL 1 μmol/L LysoTracker Blue(標(biāo)記溶酶體)染色液繼續(xù)孵育2 h。去除舊培養(yǎng)基，PBS洗滌三次，每次清洗3～5 min。加入1.0 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min。去除固定液，PBS洗滌三次。于玻底滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，4 ℃黑暗環(huán)境下短時間保存。所有操作均需避光。激光共聚焦顯微鏡下觀察：綠色代表GS NPs，紅色代表p53質(zhì)粒，藍色代表溶酶體細胞器。
1.8 GS-p53對肝癌細胞的抑制效果
本文采用MTT法檢測GS-p53處理后，肝癌細胞的存活率情況。取生長狀態(tài)良好的肝癌細胞Hep-3b消化計數(shù)后調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培液，加入不同處理組的無血清培養(yǎng)液：裸p53、GS NPs、GS-p53(每孔納米顆粒的終濃度為600 μg/mL，p53濃度3 μg/mL)，繼續(xù)共培養(yǎng)24、48 h后，PBS清洗兩次，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，小心吸除每孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，輕微振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值。計算細胞存活率。
1.9 Western blot檢測p53蛋白表達水平
GFP-p53融合蛋白的收集：取對數(shù)生長期Hep-3b細胞以每孔2.0 mL培養(yǎng)基和2×105個細胞接種于六孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁良好后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，分別加入等量的p53和GS-p53(納米顆粒終濃度為1 mg/mL)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h后，棄盡舊培養(yǎng)液并用PBS清洗兩次，每孔加入100 μL RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min后收集并加入6×loading buffer于100 ℃金屬浴10 min，用于SDS-PAGE電泳或-20 ℃短期保存。
SDS-PAGE電泳：本文采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，按試劑盒操作說明配制SDS-PAGE。每孔加入50 μg蛋白樣品，Maker 5 μL，于80 V電壓下電泳至濃縮膠分離膠分界處時，加大電壓至120 V，電泳約1.5 h。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后以負膠正膜(負極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(甲醇活化20 s，正面朝下)-濾紙-海綿-正極)的順序組裝好并置入電轉(zhuǎn)槽中，加入4 ℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，于冰上轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，時間90 min。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST清洗三次，每次5 min，置于5%脫脂奶粉封閉液中，119 r/min室溫封閉2 h?？贵w孵育并顯影：棄掉封閉液，加入10.0 mL一抗溶液(p53抗體以1∶1000比例稀釋，內(nèi)參β-actin以1∶3000比例稀釋)，119 r/min 4 ℃孵育過夜。TBST清洗四次，每次15 min，加入鼠二抗溶液(以1∶5000比例稀釋)，119 r/min室溫孵育2 h。TBST清洗四次后置于超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光檢測。
2 實驗結(jié)果與分析
2.1 不同pH值條件下的GS NPs制備
為了探究溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中鹽酸溶液pH值的影響，本實驗以不同pH值鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，分別研究pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液條件對GS NPs粒徑、表面Zeta電位和形貌的影響，結(jié)果如表1和圖1所示。表1結(jié)果顯示：pH值2.0鹽酸溶液中，反應(yīng)難以形成乳白色懸濁液即GS NPs；當(dāng)在pH值為3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中，反應(yīng)8～10 h均可得到乳白色懸濁液，因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs過程中，必須在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境中進行，GPSM中環(huán)氧基團才能和明膠的氨基反應(yīng)以形成明膠-GPSM化合物。隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，分散性系數(shù)由0.21增大到0.31，粒徑分布如圖1所示：pH值越小，粒徑分布越均勻，pH值3.0和4.0鹽酸條件下主要分布在200～400 nm，pH值5.0時分布較寬；Zeta電位并未因粒徑分布發(fā)生較大變化，穩(wěn)定在37～40 mV(表1)。以上結(jié)果表明，當(dāng)其他反應(yīng)條件不變時，鹽酸溶液的酸性越弱，制備的GS NPs平均粒徑越大，分布越寬，而對表面組成無較大影響，仍帶正電荷。
表1 不同pH值體系下GS NPs的粒徑、Zeta電位和分散性系數(shù)
注：pH值2.0鹽酸溶液下，未形成乳白色懸濁液即GS NPs。
圖1 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的粒徑分布
圖2為不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的場發(fā)射掃描電鏡圖。圖2(a)-(c)顯示，pH值大于2.0鹽酸環(huán)境下制備的GS NPs呈不規(guī)則的球形形貌，分散性較好，存在一種粒徑均一約50～100 nm的小顆粒。pH值越大，納米顆粒粒徑越大，鹽酸溶液pH值5.0時形成的粒徑約300 nm以上明顯比pH值3.0時大，pH值3.0和pH值4.0時形成的GS NPs粒徑較均一，約250～300 nm間，且pH值3.0下形成的較小顆粒相對于pH值4.0較多，可能導(dǎo)致pH值3.0平均粒徑相對較小。與粒徑DLS結(jié)果綜合分析，pH值3.0鹽酸溶液下制備的GS NPs分散性較好，平均粒徑較小，粒徑分布集中，表面帶有一定的正電位。
圖2 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的FE-SEM圖
2.2 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
為了定性分析GS NPs對pEGFP-C1-p53的包裹能力，對納米復(fù)合物進行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，隨著質(zhì)量比的逐漸增大，條帶亮度逐漸減弱，點樣孔的亮度逐漸增強，表明游離的p53逐漸減少，而在點樣孔中滯留的p53逐漸增多，說明納米顆粒的包裹能力隨著其含量的增加而增強。其中GS NPs在質(zhì)量比為30∶1時，未出現(xiàn)明顯條帶，表明GS NPs以30∶1的質(zhì)量比能很好地包裹住p53。
圖3 GS NPs對pEGFP-C1-p53的包封性檢測
注：泳道ND為裸p53；泳道1～6分別為GS NPs/p53質(zhì)量比為10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1。
2.3 GS-p53的粒徑和表面Zeta電位
對于非病毒基因載體來說，其粒徑和表面電位是影響細胞內(nèi)化效率和進入細胞方式的重要影響因素[25]。通過對GS-p53納米復(fù)合物的粒徑和表面電位分析，分析其最適進入細胞的質(zhì)量比復(fù)合，結(jié)果如圖4所示。圖4表明：GS NPs與p53復(fù)合后，表面電位呈現(xiàn)明顯的下降，其原因是納米顆粒負載p53質(zhì)粒是通過正負電荷靜電吸附作用使pDNA結(jié)合到納米顆粒表面，屏蔽納米顆粒表面的正電荷，導(dǎo)致了其表面電位的下降。GS NPs粒徑明顯呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)復(fù)合物表面電位為0左右，粒徑達到微米以上，說明復(fù)合物呈現(xiàn)明顯的團聚現(xiàn)象，此時質(zhì)量比30∶1，結(jié)合圖3中的GS NPs的包封性，推測其原因可能是當(dāng)質(zhì)量比為30∶1時，GS NPs剛好能最大比包裹住質(zhì)粒p53，從而導(dǎo)致復(fù)合物呈電中性，復(fù)合物間的同種電荷排斥力減弱，而呈現(xiàn)明顯的團聚。由圖4還可知，隨著納米顆粒質(zhì)量比的增加，復(fù)合物表面電位大體呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，最后趨于穩(wěn)定，這表明隨著納米粒子的增多，其吸附能力越強，當(dāng)達到一定包裹比例后，pDNA含量不會顯著影響其表面電位。而當(dāng)復(fù)合物表面電位穩(wěn)定于30 mV左右時，其粒徑仍有一定程度的增大，但總體小于400 nm，表明粒徑的增大主要是由于pDNA結(jié)合到納米顆粒表面引起的。納米顆粒進入細胞主要是由于表面正電荷與細胞膜表面帶負電荷分子的靜電相互作用而使其與膜結(jié)合，因此對于納米顆粒復(fù)合物來說，維持一定的正電荷是很有必要的，且在納米顆粒與p53質(zhì)量比為200∶1的條件下GS-p53具有較小的粒徑和一定的正電位，因此在后續(xù)研究中，GS NPs按此質(zhì)量比條件包裹p53質(zhì)粒，作為納米復(fù)合物。
圖4 以不同質(zhì)量比復(fù)合的GS-p53納米復(fù)合物粒徑和表面電位分析
2.4 GS-p53體外對p53基因的釋放性
圖5為GS-p53納米復(fù)合物在50、150 mmol/L和300 mmol/L NaCl溶液中體外對p53基因的釋放性。圖5顯示：120 min時，隨著NaCl濃度的增加，p53電泳帶的亮度逐漸增加，表明p53釋放量的增加。納米復(fù)合物在300 mmol/L的NaCl溶液中有明顯的p53電泳帶，且隨著振蕩時間的延長，條帶亮度增加，表明對p53的釋放作用增強。其原因可能是鹽溶液環(huán)境中，納米顆粒對p53的靜電作用被鹽離子競爭性破壞，因此隨著鹽濃度的增加和時間的延長，離子競爭效應(yīng)增強，從而導(dǎo)致p53釋放增大。
圖5 GS-p53對p53的釋放性
注：泳道ND為裸p53；泳道1—9分別代表GS-p53納米復(fù)合物在50 mmol/L NaCl溶液中37 ℃恒溫振蕩30、60 min和120 min(泳道1、2、3)，150 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道4、5、6)，300 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道7、8、9)。
2.5 納米明膠硅氧烷的生物相容性
為了進一步研究納米明膠硅氧烷作為基因載體的可行性，對其生物相容性進行檢測，圖6為GS NPs在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同處理時間對肝正常細胞L-02的細胞毒性結(jié)果。圖6顯示：GS NPs對肝細胞的毒性隨濃度的增加和處理時間的延長，細胞生長受抑制比較明顯，表現(xiàn)出輕微的細胞毒性，當(dāng)濃度小于0.6 mg/mL時，其細胞存活率仍達到80%以上，總體而言，所制備的GS NPs具有良好的生物相容性，具備一個基因載體所必有的生物安全性，為其后續(xù)抑癌效果研究奠定基礎(chǔ)。
圖6 GS NPs的生物相容性
2.6 GS-p53細胞內(nèi)攝取研究
為探究納米明膠硅氧烷作為基因載體攜載pDNA進入細胞后在胞內(nèi)的攝取情況，本文通過FITC標(biāo)記GS NPs，PI標(biāo)記p53，共培養(yǎng)6 h和24 h后，對溶酶體進行染色，激光共聚焦觀察，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)共培養(yǎng)6 h時，GS-p53熒光點基本與溶酶體熒光點重疊，表明GS NPs攜載p53進入細胞后首先被溶酶體所吞噬。24 h后，有少量熒光點(見圖7中的Merge圖)單獨存在，表明隨著共培養(yǎng)時間的延長，少部分GS NPs攜載p53開始逃逸出溶酶體的吞噬進入細胞質(zhì)及細胞核中。以上結(jié)果表明GS NPs作為基因載體進入細胞后對溶酶體的逃逸情況存在一定的時間依懶性。
圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察GS-p53進入Hep-3b細胞后細胞內(nèi)攝取情況
2.7 GS-p53對肝癌細胞的抑制效果
圖8為納米顆粒終濃度為600 μg/mL(p53終濃度為3 μg/mL)的不同處理組對肝癌細胞Hep-3b分別處理24 h和48 h的抑制效果。從圖8中可以看出GS NPs對肝癌細胞具有較好的生物相容性，其細胞存活率達到80%以上。GS NPs攜載p53后對肝癌細胞Hep-3b具有較顯著的抑制效果；相對于裸p53質(zhì)粒，GS-p53表現(xiàn)出極顯著的抑制作用，具有統(tǒng)計學(xué)意義。在培養(yǎng)24 h和48 h后，加入GS-p53納米復(fù)合物組細胞存活率分別為69.7%和63.3%，說明隨著處理時間的延長，肝癌細胞的存活率有所降低，在48 h時表現(xiàn)出更強的抑制作用。推測可能是隨著時間的延長，更多的GS NPs攜載p53逃逸出溶酶體的吞噬，從而進行下一步轉(zhuǎn)染的原因。
圖8 GS-p53對肝癌細胞Hep-3b的抑制效果
注：**表示p<0.01，對GS組和GS-p53組進行統(tǒng)計學(xué)分析；***表示p<0.001，對pEGFP-C1-p53組和GS-p53組進行統(tǒng)計學(xué)分析。
2.8 Western blot檢測p53蛋白的表達水平
本文以β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白，用Western blot檢測GFP-p53融合蛋白的表達情況，結(jié)果如圖9所示，由圖9可知，內(nèi)參β-actin蛋白表達水平基本一致，而GFP-p53呈現(xiàn)不同的表達，說明在上樣量相同的情況下，對于肝癌細胞Hep-3b，裸p53沒有融合蛋白的表達，而在有載體GS NPs的介導(dǎo)下，Hep-3b細胞內(nèi)能成功表達融合蛋白。因此，GS NPs作為一種基因載體可成功攜載p53進入肝癌細胞Hep-3b轉(zhuǎn)染并使GFP-p53融合蛋白表達，從而促進肝癌細胞凋亡，達到一定的抑制效果。
圖9 Hep-3b細胞p53蛋白表達檢測
3 結(jié) 論
本文采用溶膠-凝膠法制備納米明膠硅氧烷，探討反應(yīng)中不同pH值鹽酸溶液的影響，并對其進行表征分析；通過凝膠電泳實驗檢測其對pDNA的負載率及釋放性；CCK-8法檢測其生物相容性；激光共聚焦觀察納米復(fù)合物進入細胞后在胞內(nèi)的攝取情況；MTT法和Western blot實驗綜合評估其負載p53基因?qū)Ω伟┘毎囊种菩Ч?。主要結(jié)論如下：
a) 采用溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中，必須是在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境下，反應(yīng)才能進行從而合成GS NPs；隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，粒徑分布變寬，但其形貌不會產(chǎn)生較大影響，仍呈無規(guī)則球狀顆粒，分散性較好，且表面帶有一定的正電荷。GS NPs是以pH值3.0的鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)條件下獲得，其粒徑約250 nm左右、表面Zeta電位38 mV。
b) GS NPs在30∶1時可有效負載p53，但作為基因載體其在200∶1的質(zhì)量比時合成的納米復(fù)合物GS-p53粒徑較小，表面帶有一定的正電位，最適合細胞膜的胞吞作用。此外，GS NPs在鹽溶液條件下可實現(xiàn)對p53的釋放。
c) GS NPs對人正常肝細胞L-02的毒性較低，具有良好的生物相容性。攜載p53進入細胞后少部分納米復(fù)合物可逃逸出溶酶體的吞噬，從而進行轉(zhuǎn)染使GFP-p53融合蛋白在肝癌細胞Hep-3b內(nèi)成功表達，促進肝癌細胞的凋亡，對肝癌細胞具有顯著的抑制效果。
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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)
0 引 言
原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種高度惡性腫瘤，是世界上第五大常見癌癥，也是世界上癌癥死亡率較高的主要疾病之一[1]，在發(fā)展中國家，HCC發(fā)生率超過80%并在男性發(fā)病率中居第二位[2]。目前，治療肝癌有許多方法，包括手術(shù)切除、化療、局部消融和肝移植，但大多患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)展成為晚期不適合手術(shù)，且這些方法也存在顯著的毒性和高復(fù)發(fā)風(fēng)險[3-5]。目前在大多數(shù)國家中仍缺乏有效的治療方法，HCC的死亡率幾乎等于發(fā)病率[6]。因此，開發(fā)一種在提高肝癌患者預(yù)后能力和盡量減少與治療相關(guān)的毒性的治療方法是非常迫切的。
基因治療作為一種新興的治療方法，是依賴某種載體遞送核酸如質(zhì)粒DNA、siRNA和miRNA等進入患者細胞從而達到治療目的[7]，現(xiàn)已被廣泛認(rèn)為是治療許多疾病的有效方法，如心血管[8]、遺傳性疾病[9]、神經(jīng)性疾病[10]、惡性腫瘤[11]以及多基因誘導(dǎo)疾病如血友病[12]和肌肉萎縮癥[13]等。迄今為止，近2600個基因治療臨床試驗已經(jīng)完成并在全球獲得批準(zhǔn)[14]。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及人類基因組工程的完成，人類疾病DNA基因組學(xué)的深入研究，通過基因治療手段來治愈疾病的新模式策略也越來越為人所接受，但選擇一種高效、安全的基因載體和治療基因仍然是成功基因治療的巨大挑戰(zhàn)。
p53蛋白作為腫瘤抑制因子可參與多種細胞反應(yīng)，在調(diào)節(jié)細胞周期阻滯、細胞凋亡、DNA修復(fù)、自噬、代謝、mRNA翻譯和反饋機制等方面起著重要作用[15]。p53基因的突變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，超過50%的癌癥(包括HCC)是由p53基因突變引起的[16]。用腺病毒作為基因載體重新引入野生型p53基因已經(jīng)達到臨床水平，其中也包括對HCC的治療[17-18]。脂質(zhì)體[15]和陽離子聚合物[19]的非病毒載體也越來越多地被用于p53基因傳遞治療HCC，引入野生型p53誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡而成為癌癥基因治療的一種新手段。
明膠硅氧烷納米顆粒(Gelatin siloxane nanoparticles，GS NPs)具有低毒性、可降解性、表面易吸附、易修飾性以及易重復(fù)合成等優(yōu)點，作為生物材料已被廣泛用于骨組織工程[20]、腦疾病治療[21-22]和基因藥物載體[23-24]等研究。由于GS NPs表面帶有較大量的正電荷，可作為一種潛在的基因載體材料，介導(dǎo)目的基因進入細胞并表達，但對于GS NPs負載治療基因?qū)Π┘毎男Ч麉s鮮有報道。本文采用溶膠-凝膠法探究不同的pH值鹽酸溶液對納米明膠硅氧烷制備的影響及其作為基因載體負載p53基因?qū)Ω伟┘毎囊种菩Ч?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
a) 材料：pEGFP-C1-p53(p53)質(zhì)粒為本實驗室所保存，明膠(100 g，美國BBI公司)，GPSM(3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)、APTMS((3-氨丙基)三甲氧基硅烷，分析純，美國ACROS ORGANICS公司)，F(xiàn)ITC(異硫氰酸熒光素，10 mg，美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒、MTT粉末、PI(碘化丙啶)粉末、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(均購自上海碧云天公司)，LysoTracker Blue DND-22、BCA試劑盒(美國Thermo Fisher公司)，p53抗體(0.1 mL，美國Novus公司)，β-actin抗體(0.1 mL，美國Affinity公司)，鼠二抗、ECL試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。
b) 儀器：場發(fā)射掃描電鏡(ZEISS-ULTRA55，日本Hitachi公司)，動態(tài)光散射儀(LB-550 V，英國Malvern公司)，數(shù)顯控溫磁力攪拌器(78HW-3，杭州儀表電機有限公司)，凝膠成像儀(GGM/D2，GeneGenius公司)，酶標(biāo)儀(ELx 800，BioTek公司)，激光共聚焦顯微鏡(LSM710 3-channel，德國Zeiss公司)。
1.2 不同pH值條件下納米明膠硅氧烷的制備及表征
首先分別向20.0 mL的pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中加入0.15 g的明膠，40 ℃下加熱溶解，配成明膠溶液為0.75%。再向明膠溶液中分別加入0.20 g GPSM(185 μL)，于60 ℃，500 r/min的磁力恒溫攪拌器上攪拌30 min。然后向反應(yīng)體系中加入0.08 g APTMS(75 μL)，于60 ℃下繼續(xù)攪拌8～10 h。最后停止攪拌，以14000 r/min，20 ℃離心20 min，獲取白色沉淀，超聲分散水洗三遍后，以10.0 mL的ddH2O超聲波重新懸浮，即得到約4 mg/mL GS NPs懸浮液。
用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)對顆粒形貌進行觀察，動態(tài)光散射儀(DLS)分析其粒徑和表面Zeta電位。
1.3 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
選取pH值3.0鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，新鮮制備好的GS NPs重懸超聲分散，濃度為4 mg/mL，分別與pEGFP-C1-p53以10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1和200∶1的質(zhì)量比均勻混合，用ddH2O補齊體系，渦旋15 s，室溫孵育靜置60 min，即得到GS-p53納米復(fù)合物。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測GS-p53復(fù)合物中是否有pDNA溢出，評價納米顆粒對p53的包封效率。
1.4 納米復(fù)合物GS-p53的粒徑和表面Zeta電位分析
取新鮮制備的GS-p53納米復(fù)合物懸液，用ddH2O稀釋后加入1.2 mL至樣品池中，置于動態(tài)光散射儀上測定其粒徑和Zeta電位。
1.5 對p53基因的釋放性
按1.3中方法制備復(fù)合物懸液(質(zhì)量比為200∶1)，分成3等份，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)后，棄上清液，分別超聲重懸于相同體積的50、150 mmol/L和300 mmol/L的NaCl溶液中，并均置于200 r/min，37 ℃的搖床中振蕩30、60 min和120 min后，每組取出等體積的復(fù)合物懸浮液離心分離，進行凝膠電泳檢測上清液中是否有p53溢出。
1.6 納米明膠硅氧烷的生物相容性
本文采用CCK-8試劑盒檢測GS NPs對肝細胞的毒性。納米顆粒的無菌處理：將新鮮制備的GS NPs，14 000 r/min，20 ℃，離心20 min后棄上清，75%酒精超聲重懸至相同濃度，消毒30 min后，離心分離(14 000 r/min，20 ℃，20 min)，用無菌水水洗三次，超聲分散到無血清培養(yǎng)基中，得到1 mg/mL的使用液，使用時根據(jù)實驗濃度要求稀釋。
取對數(shù)生長期的人肝正常細胞L-02以每孔100 μL，細胞密度為1×105個/mL接種于96孔板中，并放置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長良好后更換為含有不同濃度(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)GS NPs的無血清培養(yǎng)基，其中每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。分別共培養(yǎng)24、48 h和72 h后，吸除舊培養(yǎng)液并用PBS洗兩次，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基。避光加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1～2 h后，酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處的各孔吸光值(OD值)，并根據(jù)式(1)計算細胞存活率：
(1)
其中：X為細胞存活率；OD2為實驗組的OD值；OD1為對照組的OD值；OD0為Blank組的OD值。
1.7 GS-p53細胞內(nèi)攝取情況
熒光標(biāo)記的納米顆粒(FITC-GS NPs)的制備：取新鮮制備的GS NPs重懸于pH 值8.0的磷酸緩沖液中配成2～5 mg/mL的濃度。以GS NPs/FITC的比例為300∶1加入FITC溶液，避光室溫振蕩反應(yīng)1～2 h。14,000 r/min，20 ℃離心20 min后，棄上清，ddH2O超聲洗滌三次，得到FITC-GS NPs。熒光標(biāo)記的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物的制備：先將p53用PI進行標(biāo)記，將質(zhì)粒p53與PI以1∶1比例混勻，室溫避光孵育20 min后，即得到PI-p53質(zhì)粒。然后將FITC-GS NPs與PI-p53質(zhì)粒按1.3中的方法混合后離心棄上清(質(zhì)量比為200∶1)，即得到FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物。激光共聚焦樣品制備：取1.0 mL對數(shù)生長期、5×104個/mL的Hep-3b細胞接種于35 mm玻底培養(yǎng)皿(共聚焦專用培養(yǎng)皿)中，待細胞貼壁生長良好后，PBS洗滌兩次，更換為900 μL無血清DMEM培養(yǎng)基，避光加入100 μL新鮮制備、2 mg/mL的FITC-GS/p53-PI納米復(fù)合物懸液，分別共培養(yǎng)6 h和24 h。吸去舊培養(yǎng)液，PBS清洗兩次。更換為1.0 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基，加入50 μL 1 μmol/L LysoTracker Blue(標(biāo)記溶酶體)染色液繼續(xù)孵育2 h。去除舊培養(yǎng)基，PBS洗滌三次，每次清洗3～5 min。加入1.0 mL 4%多聚甲醛室溫固定15 min。去除固定液，PBS洗滌三次。于玻底滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，4 ℃黑暗環(huán)境下短時間保存。所有操作均需避光。激光共聚焦顯微鏡下觀察：綠色代表GS NPs，紅色代表p53質(zhì)粒，藍色代表溶酶體細胞器。
1.8 GS-p53對肝癌細胞的抑制效果
本文采用MTT法檢測GS-p53處理后，肝癌細胞的存活率情況。取生長狀態(tài)良好的肝癌細胞Hep-3b消化計數(shù)后調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，棄掉舊培液，加入不同處理組的無血清培養(yǎng)液：裸p53、GS NPs、GS-p53(每孔納米顆粒的終濃度為600 μg/mL，p53濃度3 μg/mL)，繼續(xù)共培養(yǎng)24、48 h后，PBS清洗兩次，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，小心吸除每孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，輕微振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光值。計算細胞存活率。
1.9 Western blot檢測p53蛋白表達水平
GFP-p53融合蛋白的收集：取對數(shù)生長期Hep-3b細胞以每孔2.0 mL培養(yǎng)基和2×105個細胞接種于六孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁良好后，更換為無血清DMEM培養(yǎng)基，分別加入等量的p53和GS-p53(納米顆粒終濃度為1 mg/mL)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h后，棄盡舊培養(yǎng)液并用PBS清洗兩次，每孔加入100 μL RIPA裂解液，冰上充分裂解30 min后收集并加入6×loading buffer于100 ℃金屬浴10 min，用于SDS-PAGE電泳或-20 ℃短期保存。
SDS-PAGE電泳：本文采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，按試劑盒操作說明配制SDS-PAGE。每孔加入50 μg蛋白樣品，Maker 5 μL，于80 V電壓下電泳至濃縮膠分離膠分界處時，加大電壓至120 V，電泳約1.5 h。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后以負膠正膜(負極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜(甲醇活化20 s，正面朝下)-濾紙-海綿-正極)的順序組裝好并置入電轉(zhuǎn)槽中，加入4 ℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，于冰上轉(zhuǎn)膜，電壓100 V，時間90 min。封閉：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，TBST清洗三次，每次5 min，置于5%脫脂奶粉封閉液中，119 r/min室溫封閉2 h?？贵w孵育并顯影：棄掉封閉液，加入10.0 mL一抗溶液(p53抗體以1∶1000比例稀釋，內(nèi)參β-actin以1∶3000比例稀釋)，119 r/min 4 ℃孵育過夜。TBST清洗四次，每次15 min，加入鼠二抗溶液(以1∶5000比例稀釋)，119 r/min室溫孵育2 h。TBST清洗四次后置于超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光檢測。
2 實驗結(jié)果與分析
2.1 不同pH值條件下的GS NPs制備
為了探究溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中鹽酸溶液pH值的影響，本實驗以不同pH值鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)，分別研究pH值2.0、3.0、4.0和5.0鹽酸溶液條件對GS NPs粒徑、表面Zeta電位和形貌的影響，結(jié)果如表1和圖1所示。表1結(jié)果顯示：pH值2.0鹽酸溶液中，反應(yīng)難以形成乳白色懸濁液即GS NPs；當(dāng)在pH值為3.0、4.0和5.0鹽酸溶液中，反應(yīng)8～10 h均可得到乳白色懸濁液，因此采用溶膠-凝膠法合成GS NPs過程中，必須在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境中進行，GPSM中環(huán)氧基團才能和明膠的氨基反應(yīng)以形成明膠-GPSM化合物。隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，分散性系數(shù)由0.21增大到0.31，粒徑分布如圖1所示：pH值越小，粒徑分布越均勻，pH值3.0和4.0鹽酸條件下主要分布在200～400 nm，pH值5.0時分布較寬；Zeta電位并未因粒徑分布發(fā)生較大變化，穩(wěn)定在37～40 mV(表1)。以上結(jié)果表明，當(dāng)其他反應(yīng)條件不變時，鹽酸溶液的酸性越弱，制備的GS NPs平均粒徑越大，分布越寬，而對表面組成無較大影響，仍帶正電荷。
表1 不同pH值體系下GS NPs的粒徑、Zeta電位和分散性系數(shù)
注：pH值2.0鹽酸溶液下，未形成乳白色懸濁液即GS NPs。
圖1 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的粒徑分布
圖2為不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的場發(fā)射掃描電鏡圖。圖2(a)-(c)顯示，pH值大于2.0鹽酸環(huán)境下制備的GS NPs呈不規(guī)則的球形形貌，分散性較好，存在一種粒徑均一約50～100 nm的小顆粒。pH值越大，納米顆粒粒徑越大，鹽酸溶液pH值5.0時形成的粒徑約300 nm以上明顯比pH值3.0時大，pH值3.0和pH值4.0時形成的GS NPs粒徑較均一，約250～300 nm間，且pH值3.0下形成的較小顆粒相對于pH值4.0較多，可能導(dǎo)致pH值3.0平均粒徑相對較小。與粒徑DLS結(jié)果綜合分析，pH值3.0鹽酸溶液下制備的GS NPs分散性較好，平均粒徑較小，粒徑分布集中，表面帶有一定的正電位。
圖2 不同pH值鹽酸溶液下GS NPs的FE-SEM圖
2.2 納米明膠硅氧烷對p53基因的包封性
為了定性分析GS NPs對pEGFP-C1-p53的包裹能力，對納米復(fù)合物進行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，隨著質(zhì)量比的逐漸增大，條帶亮度逐漸減弱，點樣孔的亮度逐漸增強，表明游離的p53逐漸減少，而在點樣孔中滯留的p53逐漸增多，說明納米顆粒的包裹能力隨著其含量的增加而增強。其中GS NPs在質(zhì)量比為30∶1時，未出現(xiàn)明顯條帶，表明GS NPs以30∶1的質(zhì)量比能很好地包裹住p53。
圖3 GS NPs對pEGFP-C1-p53的包封性檢測
注：泳道ND為裸p53；泳道1～6分別為GS NPs/p53質(zhì)量比為10∶1、30∶1、50∶1、100∶1、150∶1、200∶1。
2.3 GS-p53的粒徑和表面Zeta電位
對于非病毒基因載體來說，其粒徑和表面電位是影響細胞內(nèi)化效率和進入細胞方式的重要影響因素[25]。通過對GS-p53納米復(fù)合物的粒徑和表面電位分析，分析其最適進入細胞的質(zhì)量比復(fù)合，結(jié)果如圖4所示。圖4表明：GS NPs與p53復(fù)合后，表面電位呈現(xiàn)明顯的下降，其原因是納米顆粒負載p53質(zhì)粒是通過正負電荷靜電吸附作用使pDNA結(jié)合到納米顆粒表面，屏蔽納米顆粒表面的正電荷，導(dǎo)致了其表面電位的下降。GS NPs粒徑明顯呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當(dāng)復(fù)合物表面電位為0左右，粒徑達到微米以上，說明復(fù)合物呈現(xiàn)明顯的團聚現(xiàn)象，此時質(zhì)量比30∶1，結(jié)合圖3中的GS NPs的包封性，推測其原因可能是當(dāng)質(zhì)量比為30∶1時，GS NPs剛好能最大比包裹住質(zhì)粒p53，從而導(dǎo)致復(fù)合物呈電中性，復(fù)合物間的同種電荷排斥力減弱，而呈現(xiàn)明顯的團聚。由圖4還可知，隨著納米顆粒質(zhì)量比的增加，復(fù)合物表面電位大體呈現(xiàn)逐漸增大趨勢，最后趨于穩(wěn)定，這表明隨著納米粒子的增多，其吸附能力越強，當(dāng)達到一定包裹比例后，pDNA含量不會顯著影響其表面電位。而當(dāng)復(fù)合物表面電位穩(wěn)定于30 mV左右時，其粒徑仍有一定程度的增大，但總體小于400 nm，表明粒徑的增大主要是由于pDNA結(jié)合到納米顆粒表面引起的。納米顆粒進入細胞主要是由于表面正電荷與細胞膜表面帶負電荷分子的靜電相互作用而使其與膜結(jié)合，因此對于納米顆粒復(fù)合物來說，維持一定的正電荷是很有必要的，且在納米顆粒與p53質(zhì)量比為200∶1的條件下GS-p53具有較小的粒徑和一定的正電位，因此在后續(xù)研究中，GS NPs按此質(zhì)量比條件包裹p53質(zhì)粒，作為納米復(fù)合物。
圖4 以不同質(zhì)量比復(fù)合的GS-p53納米復(fù)合物粒徑和表面電位分析
2.4 GS-p53體外對p53基因的釋放性
圖5為GS-p53納米復(fù)合物在50、150 mmol/L和300 mmol/L NaCl溶液中體外對p53基因的釋放性。圖5顯示：120 min時，隨著NaCl濃度的增加，p53電泳帶的亮度逐漸增加，表明p53釋放量的增加。納米復(fù)合物在300 mmol/L的NaCl溶液中有明顯的p53電泳帶，且隨著振蕩時間的延長，條帶亮度增加，表明對p53的釋放作用增強。其原因可能是鹽溶液環(huán)境中，納米顆粒對p53的靜電作用被鹽離子競爭性破壞，因此隨著鹽濃度的增加和時間的延長，離子競爭效應(yīng)增強，從而導(dǎo)致p53釋放增大。
圖5 GS-p53對p53的釋放性
注：泳道ND為裸p53；泳道1—9分別代表GS-p53納米復(fù)合物在50 mmol/L NaCl溶液中37 ℃恒溫振蕩30、60 min和120 min(泳道1、2、3)，150 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道4、5、6)，300 mmol/L NaCl溶液中37 ℃振蕩30、60 min和120 min(泳道7、8、9)。
2.5 納米明膠硅氧烷的生物相容性
為了進一步研究納米明膠硅氧烷作為基因載體的可行性，對其生物相容性進行檢測，圖6為GS NPs在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同處理時間對肝正常細胞L-02的細胞毒性結(jié)果。圖6顯示：GS NPs對肝細胞的毒性隨濃度的增加和處理時間的延長，細胞生長受抑制比較明顯，表現(xiàn)出輕微的細胞毒性，當(dāng)濃度小于0.6 mg/mL時，其細胞存活率仍達到80%以上，總體而言，所制備的GS NPs具有良好的生物相容性，具備一個基因載體所必有的生物安全性，為其后續(xù)抑癌效果研究奠定基礎(chǔ)。
圖6 GS NPs的生物相容性
2.6 GS-p53細胞內(nèi)攝取研究
為探究納米明膠硅氧烷作為基因載體攜載pDNA進入細胞后在胞內(nèi)的攝取情況，本文通過FITC標(biāo)記GS NPs，PI標(biāo)記p53，共培養(yǎng)6 h和24 h后，對溶酶體進行染色，激光共聚焦觀察，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)共培養(yǎng)6 h時，GS-p53熒光點基本與溶酶體熒光點重疊，表明GS NPs攜載p53進入細胞后首先被溶酶體所吞噬。24 h后，有少量熒光點(見圖7中的Merge圖)單獨存在，表明隨著共培養(yǎng)時間的延長，少部分GS NPs攜載p53開始逃逸出溶酶體的吞噬進入細胞質(zhì)及細胞核中。以上結(jié)果表明GS NPs作為基因載體進入細胞后對溶酶體的逃逸情況存在一定的時間依懶性。
圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察GS-p53進入Hep-3b細胞后細胞內(nèi)攝取情況
2.7 GS-p53對肝癌細胞的抑制效果
圖8為納米顆粒終濃度為600 μg/mL(p53終濃度為3 μg/mL)的不同處理組對肝癌細胞Hep-3b分別處理24 h和48 h的抑制效果。從圖8中可以看出GS NPs對肝癌細胞具有較好的生物相容性，其細胞存活率達到80%以上。GS NPs攜載p53后對肝癌細胞Hep-3b具有較顯著的抑制效果；相對于裸p53質(zhì)粒，GS-p53表現(xiàn)出極顯著的抑制作用，具有統(tǒng)計學(xué)意義。在培養(yǎng)24 h和48 h后，加入GS-p53納米復(fù)合物組細胞存活率分別為69.7%和63.3%，說明隨著處理時間的延長，肝癌細胞的存活率有所降低，在48 h時表現(xiàn)出更強的抑制作用。推測可能是隨著時間的延長，更多的GS NPs攜載p53逃逸出溶酶體的吞噬，從而進行下一步轉(zhuǎn)染的原因。
圖8 GS-p53對肝癌細胞Hep-3b的抑制效果
注：**表示p<0.01，對GS組和GS-p53組進行統(tǒng)計學(xué)分析；***表示p<0.001，對pEGFP-C1-p53組和GS-p53組進行統(tǒng)計學(xué)分析。
2.8 Western blot檢測p53蛋白的表達水平
本文以β-actin蛋白為內(nèi)參蛋白，用Western blot檢測GFP-p53融合蛋白的表達情況，結(jié)果如圖9所示，由圖9可知，內(nèi)參β-actin蛋白表達水平基本一致，而GFP-p53呈現(xiàn)不同的表達，說明在上樣量相同的情況下，對于肝癌細胞Hep-3b，裸p53沒有融合蛋白的表達，而在有載體GS NPs的介導(dǎo)下，Hep-3b細胞內(nèi)能成功表達融合蛋白。因此，GS NPs作為一種基因載體可成功攜載p53進入肝癌細胞Hep-3b轉(zhuǎn)染并使GFP-p53融合蛋白表達，從而促進肝癌細胞凋亡，達到一定的抑制效果。
圖9 Hep-3b細胞p53蛋白表達檢測
3 結(jié) 論
本文采用溶膠-凝膠法制備納米明膠硅氧烷，探討反應(yīng)中不同pH值鹽酸溶液的影響，并對其進行表征分析；通過凝膠電泳實驗檢測其對pDNA的負載率及釋放性；CCK-8法檢測其生物相容性；激光共聚焦觀察納米復(fù)合物進入細胞后在胞內(nèi)的攝取情況；MTT法和Western blot實驗綜合評估其負載p53基因?qū)Ω伟┘毎囊种菩Ч?。主要結(jié)論如下：
a) 采用溶膠-凝膠法制備GS NPs過程中，必須是在pH值大于2.0的弱酸環(huán)境下，反應(yīng)才能進行從而合成GS NPs；隨著pH值的增大，納米顆粒的平均粒徑由255 nm增大到316 nm，粒徑分布變寬，但其形貌不會產(chǎn)生較大影響，仍呈無規(guī)則球狀顆粒，分散性較好，且表面帶有一定的正電荷。GS NPs是以pH值3.0的鹽酸溶液為反應(yīng)基礎(chǔ)條件下獲得，其粒徑約250 nm左右、表面Zeta電位38 mV。
b) GS NPs在30∶1時可有效負載p53，但作為基因載體其在200∶1的質(zhì)量比時合成的納米復(fù)合物GS-p53粒徑較小，表面帶有一定的正電位，最適合細胞膜的胞吞作用。此外，GS NPs在鹽溶液條件下可實現(xiàn)對p53的釋放。
c) GS NPs對人正常肝細胞L-02的毒性較低，具有良好的生物相容性。攜載p53進入細胞后少部分納米復(fù)合物可逃逸出溶酶體的吞噬，從而進行轉(zhuǎn)染使GFP-p53融合蛋白在肝癌細胞Hep-3b內(nèi)成功表達，促進肝癌細胞的凋亡，對肝癌細胞具有顯著的抑制效果。
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