頭孢拉定膠囊微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

高 菲

(大連市第三人民醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116033)

微生物限度檢查是評(píng)價(jià)原料藥、輔料及非最終滅菌制劑受到微生物污染程度的方法[1]，其可確保生產(chǎn)企業(yè)所用的原料藥、輔料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)器具、生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)操作人員的衛(wèi)生狀況符合法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，微生物限度檢查主要包括總需氧菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)檢查，并需對(duì)控制菌進(jìn)行專(zhuān)屬性檢查[3-4]。然而，工作環(huán)境、樣品性質(zhì)及試驗(yàn)方法均會(huì)影響檢查方法的準(zhǔn)確性[5]。因此，行微生物限度檢查前的首要任務(wù)是進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以確保所選擇檢查方法對(duì)藥品適合；尤其對(duì)于含有抑菌劑的藥品，其成分可能會(huì)在微生物限度檢查時(shí)抑制藥品中的微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致檢測(cè)方法不準(zhǔn)確[6-7]。本研究按照《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)“1105”“1106”的相關(guān)規(guī)定，對(duì)頭孢拉定膠囊微生物限度檢查方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)，以確保在實(shí)際檢驗(yàn)條件下，檢驗(yàn)用物品(包括供試品、稀釋液、淋洗液、培養(yǎng)基及檢驗(yàn)器具等)和操作程序?qū)赡艽嬖诘奈⑸锷L(zhǎng)不會(huì)造成不良影響，檢測(cè)方法準(zhǔn)確、有效并可重現(xiàn)。頭孢拉定膠囊是β-內(nèi)酰胺類(lèi)廣譜抗菌藥物，對(duì)于細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌作用[8]。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]，本研究采用平皿法及稀釋法檢測(cè)總需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)，采用薄膜過(guò)濾法檢測(cè)控制菌，以確認(rèn)頭孢拉定膠囊在規(guī)定的檢驗(yàn)量和檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌活性或其抑菌活性被充分消除到可以忽略不計(jì)，得到的檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

1 材料

1.1 儀器

ZHJH-C1112C型超凈化工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；XG1.DWS-1.2B型蒸汽滅菌柜(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)；HR40-ⅡA2型生物安全柜(上海恒勤儀器設(shè)備有限公司)；BL-610型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SHH-250 L型生化培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；MJX-250C型霉菌培養(yǎng)箱(20～25 ℃，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；MJX-250C型霉菌培養(yǎng)箱(30～35 ℃，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.2 藥品

頭孢拉定膠囊(批號(hào)：46170402、46170403和46170404)，購(gòu)自上海新亞藥業(yè)閔行有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)用菌種

白色念珠菌[工作菌種號(hào)：CMCC(F)98001]、金黃色葡萄球菌[工作菌種號(hào)：CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌[工作菌種號(hào)：CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[工作菌種號(hào)：CMCC(B)63501]、黑曲霉[工作菌種號(hào)：CMCC(F)98003]及大腸埃希菌[工作菌種號(hào)：CMCC(B)44103]，均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

1.4 培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào)：150321)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：150824)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：150521)；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：150224)；麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)：150824)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：150907)；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨(批號(hào)：150123)。上述培養(yǎng)基均來(lái)源于北京三藥科技發(fā)展有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 驗(yàn)證依據(jù)

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典：四部》(2015年版)“1105”“1106”的相關(guān)規(guī)定。

2.2 菌液的制備

在新鮮的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌，在30～35 ℃條件下持續(xù)培養(yǎng)18～24 h；在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中接種白色念珠菌，在20～25 ℃條件下持續(xù)培養(yǎng)24～48 h；在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物，在20～25 ℃條件下持續(xù)培養(yǎng)5～7 d，加入無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，洗脫孢子，使用帶有刻度標(biāo)記的無(wú)菌吸管吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)；將上述6種細(xì)菌培養(yǎng)物種加入無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，配制成含菌數(shù)<100 cfu/ml的微生物混懸液。在室溫(25 ℃)下保存的菌液需在2 h內(nèi)使用，在2～8 ℃保存的菌液需在24 h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液保存在2～8 ℃，可在1周內(nèi)使用[10]。

2.3 總需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)(平皿法)

2.3.1 供試液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取頭孢拉定膠囊10 g，加入pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，置于45 ℃恒溫水浴中振搖使其溶解，制成1∶10的供試液。

2.3.2 試驗(yàn)組操作過(guò)程：分別移取5份供試品溶液，各9.9 ml，分別加入試驗(yàn)菌液(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌)各0.1 ml，搖勻，每份樣品溶液中含菌數(shù)<100 cfu/ml。分別從5份試驗(yàn)菌試管中吸取1 ml至平皿中，加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(溫度為30～45 ℃)15～20 ml，混勻，凝固，用于需氧菌總數(shù)測(cè)定。另外，分別從真菌(白色念珠菌、黑曲霉菌)試驗(yàn)菌試管中吸取1 ml至平皿中，并加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(溫度為30～45 ℃)15～20 ml，混勻，凝固，用于霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定[11]。每種試驗(yàn)菌平行操作3次，取平均值。

2.3.3 菌液對(duì)照組操作過(guò)程：吸取pH為7.0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 ml，共2份，分別加入與試驗(yàn)組相同的菌液后混勻。其他操作同試驗(yàn)組。

2.3.4 供試品對(duì)照組操作過(guò)程：分別吸取1∶10供試液1 ml至4個(gè)平皿，其中2個(gè)平皿傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另2個(gè)平皿傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻。

2.3.5 培養(yǎng)及判斷標(biāo)準(zhǔn)：待所有試驗(yàn)用平皿凝固后，將所有總需氧菌平皿倒置，于30～35 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d；霉菌和酵母菌平皿倒置，于20～25 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，每日觀察并記錄結(jié)果。重復(fù)操作，直至做完所有待驗(yàn)證的3批供試品。各菌株回收率=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液對(duì)照組平均菌落數(shù)。在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，若各菌株回收率在0.5～2范圍內(nèi)，則該適用性試驗(yàn)結(jié)果滿(mǎn)足要求[12]。

2.4 需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)(培養(yǎng)基稀釋法)

取1∶10 供試液清液分別注入5個(gè)平皿中，每個(gè)平皿0.2 ml，同時(shí)加入含菌數(shù)≤100 cfu的試驗(yàn)菌(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌)，立即注入溫度≤45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基15～20 ml，混勻，凝固，用于需氧菌總數(shù)測(cè)定[13-14]。其菌落數(shù)及回收率計(jì)算方法同平皿法。

2.5 大腸埃希菌方法適用性試驗(yàn)(薄膜過(guò)濾法)

2.5.1 試驗(yàn)組操作過(guò)程：取“2.3.1”項(xiàng)下供試液10 ml，加入無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH=7.0)100 ml，混勻，過(guò)濾。濾膜用無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(pH=7.0)100 ml沖洗，重復(fù)沖洗3次，并在最后1次沖洗液中加入<100 cfu/ml的大腸埃希菌液。將帶有腸埃希菌的濾膜接入到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml中，30～35 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h。取上述培養(yǎng)物1 ml接種至麥康凱肉湯培養(yǎng)基100 ml中，42～44 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，取麥康凱肉湯培養(yǎng)物劃線并接種到麥康凱瓊脂平板上，30～35 ℃條件下培養(yǎng)18～72 h[15-16]。每日觀察并記錄結(jié)果。

2.5.2 陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組操作過(guò)程：陽(yáng)性對(duì)照組除不加樣品外，其余操作同試驗(yàn)組。陰性對(duì)照組取稀釋液10 ml代替樣品，不加大腸埃希菌，其余操作同試驗(yàn)組。

2.5.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)：若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，陽(yáng)性對(duì)照組檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，則該方法適用性試驗(yàn)結(jié)果滿(mǎn)足要求。

2.6 菌液的制備結(jié)果

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌均制成含菌數(shù)<100 cfu/ml的菌液，見(jiàn)表1。

表1 菌液制備及菌落計(jì)數(shù)Tab 1 Preparation of bacterial suspension and colony counting

2.7 菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定結(jié)果(平皿法)

在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均<0.5，未達(dá)到要求；白色念珠菌、黑曲霉菌菌落回收率>0.7，符合規(guī)定，見(jiàn)表2。

表2 菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定結(jié)果(平皿法)Tab 2 Colony count and recovery results (plate method)

2.8 菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定結(jié)果(培養(yǎng)基稀釋法)

在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，常規(guī)平皿法回收率達(dá)不到要求，而通過(guò)培養(yǎng)基稀釋法(1∶50)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率均>0.7，達(dá)到要求，見(jiàn)表3。

表3 菌落計(jì)數(shù)及回收率測(cè)定結(jié)果(培養(yǎng)基稀釋法)Tab 3 Colony count and recovery results (medium dilution method)

2.9 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

陽(yáng)性對(duì)照組和樣品試驗(yàn)組大腸埃希菌對(duì)照菌均檢出，而陰性對(duì)照組未檢出，表明該方法有效，見(jiàn)表4。

表4 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Verification results of Escherichia coli test method

注：“+”為大腸埃希菌對(duì)照菌檢出；“-”為大腸埃希菌對(duì)照菌未檢出

Note: “+” indicates the detection of Escherichia coli control bacteria; “-” indicates the Escherichia coli is not detected

3 討論

微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證是確認(rèn)供試品在所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用，以保證供試品污染的微生物能被充分檢驗(yàn)出來(lái)[17]。本研究通過(guò)對(duì)頭孢拉定膠囊微生物限度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，最終確認(rèn)了該藥日常微生物限度的檢測(cè)方法。檢驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：需氧菌總數(shù)不得超過(guò)200 cfu/g；霉菌和酵母菌數(shù)不得超過(guò)40 cfu/g；大腸埃希菌每1 g不得檢出。檢驗(yàn)結(jié)果若符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定則說(shuō)明該批次頭孢拉定膠囊符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)要求，可以對(duì)外銷(xiāo)售，消費(fèi)者可以安全服用；若不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則說(shuō)明該批次藥品受到微生物污染，應(yīng)立即銷(xiāo)毀，防止外售。

頭孢拉定屬于第1代半合成頭孢菌素，具有較高的水溶性，對(duì)金黃色葡萄球菌及其他多重耐藥菌具有廣譜抗菌作用。本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)比了采用同稀釋級(jí)別的培養(yǎng)液稀釋法和薄膜過(guò)濾法考察金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的回收率。采用培養(yǎng)液稀釋法人工污染3種細(xì)菌的回收率均為0；而培養(yǎng)液稀釋法通過(guò)濾膜，其對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的平均回收率要高于采用薄膜過(guò)濾法，說(shuō)明培養(yǎng)液稀釋法適用于金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的檢測(cè)。