酶水解法釋放甘薯結(jié)合酚

高陽，馮悅，呂姝錦，蘇佳怡，馮穎*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161；2.遼寧現(xiàn)代服務(wù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 沈陽 110164；3.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北 唐山 063000）

多酚具有較強的抗氧化作用[1-2]，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對富含多酚類物質(zhì)的食物攝入量及一些慢性退行病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系進行研究，并揭示了它們的負相關(guān)關(guān)系[3-5]，有關(guān)多酚的研究越來越多。植物多酚可分為游離酚和結(jié)合酚[6]。游離酚在細胞質(zhì)中游離，溶解性好，可直接用水或有機溶劑提??；而結(jié)合酚則由于與蛋白質(zhì)、糖類、纖維素等通過氫鍵、疏水相互作用、共價鍵等方式結(jié)合[7]，不能用有機溶劑直接提取，只能通過加酶酶解或加強酸強堿溶液水解才能釋放出來，所以常被忽略。這使多酚整體上存在著提取率和利用率不高的問題[8-9]。近年來，關(guān)于植物結(jié)合酚水解釋放的工藝研究逐漸受到關(guān)注[10-13]，其中堿水解法可以同時釋放通過糖苷鍵和酯鍵結(jié)合的多酚，酸水解主要通過破壞糖苷鍵釋放結(jié)合酚[8]。與堿水解和酸水解法相比，酶水解法不使用腐蝕性的強酸強堿，提取條件更加溫和有效[14]。張金宏等[15]比較了3種水解方式對蘋果渣中結(jié)合酚類物質(zhì)的提取效果，表明單寧酶法水解得到的沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸及根皮素提取率最高；98%阿魏酸在燕麥中以結(jié)合態(tài)存在；Bei等[16]研究表明纖維素酶可使燕麥中更多的結(jié)合酚水解釋放；陳東方等[17]采用纖維素酶水解處理燕麥粉，阿魏酸含量提高了24倍；呂俊麗等[18]通過對莜麥多酚淀粉酶和纖維素酶復(fù)合酶解提取進行研究，其多酚得率顯著高于微波輔助提取法。

甘薯富含鉀、鐵、硒等多種微量元素，以及豐富的多酚物質(zhì)[19-21]。相較于其他植物，還含有豐富的淀粉、果膠、纖維素、蛋白質(zhì)等，這些物質(zhì)都可能與酚類物質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致其處于結(jié)合態(tài)。我國的甘薯產(chǎn)量始終穩(wěn)居世界首位[22]。如能將甘薯的結(jié)合酚進一步提取并加以研究利用，對我國甘薯資源的綜合加工利用將起到有力的推動作用。

本研究在選取適宜甘薯結(jié)合酚釋放的水解酶基礎(chǔ)上，對甘薯結(jié)合酚進行復(fù)合酶水解釋放。確定其最適反應(yīng)條件，旨在獲得令甘薯結(jié)合酚水解釋放的最佳酶水解條件，為生產(chǎn)制備甘薯結(jié)合酚以及進一步研究利用等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“遼薯20”甘薯品種：遼寧省農(nóng)科院提供；無水乙醇、乙酸、甲醇、乙酸乙酯、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、福林酚試劑、氫氧化鈉、磷酸、乙酸鈉（均為分析純）：沈陽化學(xué)試劑廠。

果膠酶（500 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg～3 500U/mg）、纖維素酶（50U/mg）、胰蛋白酶（3 000 U/mg～3 500 U/mg）：北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；中性蛋白酶（100 U/mg）、α-淀粉酶（枯草桿菌中提?。? 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（MP2002）、pH計（PB-10型）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH.B11.420-BS）：上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；循環(huán)水真空泵[SHZ-D(Ⅲ)型]：邦西儀器科技(上海)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠；冷凍離心機（GR21G）：日立有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6型）：國華電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料處理

參照譚暢[23]的方法處理甘薯：將甘薯洗凈、削皮并切成約1 cm3的塊狀，冷凍干燥后用粉碎機粉碎，過60目篩。根據(jù)蘇佳怡[24]的方法處理甘薯粉。稱取甘薯粉50 g，加入400 mL 60%乙醇溶液，在50℃下水浴2 h提取游離酚，在4℃、8 000 r/min條件下離心25 min，收集棄去上清液的濾渣，按上述條件反復(fù)提取3次～4次，提取后的濾渣置于40℃烘箱中干燥至恒重，粉碎后密封并置于4℃冰箱中備用。

1.3.2 提取結(jié)合酚

參照馮悅等[25]的方法提取結(jié)合酚。稱取1.3.1中收集的干燥薯渣粉2 g，加入酶溶液，在37℃下于水浴鍋中水解，水解結(jié)束后在4℃、10 000 r/min條件下離心20 min，取上清液并將pH值中和至7，加入等體積的乙酸乙酯多次萃取，合并萃取液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，后取50%甲醇溶液超聲溶解并定容至10 mL，密封保存在-20℃冰箱中以進行結(jié)合酚含量的測定。

1.3.3 水解酶的篩選

以液料比 20 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g,分別加入不同酶液，在其最適pH值和溫度條件下作用相同時間，通過檢測不同水解酶作用下結(jié)合酚的提取量，確定適宜的水解酶進行復(fù)合。各酶反應(yīng)具體條件如表1所示。

表1 單一酶水解試驗設(shè)計Table 1 Experimental design for single enzymolysis

1.3.4 復(fù)合酶水解結(jié)合酚單因素試驗

分別以pH值、水解溫度、液料比、水解酶用量、水解時間為考察對象，設(shè)計單因素試驗，對不同條件下甘薯結(jié)合酚提取量進行研究。

在液料比 20 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g、水解溫度50℃、水解時間20 h的條件下，考察pH值（3、4、5、6、7）對結(jié)合酚提取量的影響。

在液料比 20 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g、pH6、水解時間 20 h 的條件下，考察水解溫度（45、50、55、60、65℃）對結(jié)合酚提取量的影響。

在水解時間20 h、加酶量500 U/g、pH6、水解溫度55 ℃的條件下，考察液料比[5 ∶1、10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1（mL/g）]對結(jié)合酚提取量的影響。

在液料比 10 ∶1（mL/g）、加酶量 500 U/g、pH6、溫度 55 ℃的條件下，考察水解時間（5、10、15、20、25 h）對結(jié)合酚提取量的影響。

在液料比 10∶1（mL/g）、水解溫度 55℃、水解時間 20 h、pH5的條件下，依次考察加入 300、400、500、600、700 U/g的中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、α-淀粉酶后結(jié)合酚的提取量，探究不同加酶量對甘薯結(jié)合酚提取量的影響。

1.3.5 復(fù)合酶水解的響應(yīng)面試驗

復(fù)合酶水解釋放甘薯結(jié)合酚的響應(yīng)面試驗設(shè)計（re sponse surface methodology，RSM）優(yōu)化采用 Design-Expert10軟件，篩選出液料比、pH值、水解溫度、水解時間4個條件進行響應(yīng)面試驗，響應(yīng)面因素與水平見表2。

表2 復(fù)合酶水解響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Factors and levels used in response surface methodology for compound enzymolysis

1.3.6 多酚含量測定

參考Grace等[26]的方法并稍加改動。準確稱取10 mg沒食子酸，加蒸餾水定容到10 mL，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸標準溶液于10 mL離心管中，加蒸餾水定容，充分混勻。分別吸取0.5 mL于10 mL離心管中，蒸餾水定容到5 mL，加入0.5 mL福林酚試劑，加入0.5 mol/L碳酸鈉溶液1 mL，混勻。避光靜置1 h，于725 nm下測定吸光度。

取對應(yīng)樣液0.5 mL，按照上述多酚含量測定方法進行測定，參照標準曲線計算其甘薯多酚提取量。提取量計算公式如下。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 10.0軟件對3個水平的響應(yīng)面進行試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)處理及模型建立，且所有試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗結(jié)果平均值。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水解酶作用下的結(jié)合酚提取量

不同水解酶作用下的結(jié)合酚提取量見圖1。

圖1 不同水解酶作用下的結(jié)合酚提取量Fig.1 Effect of different enzymolysis on the yield of bound phenol

由圖1可知，不同水解酶作用下的結(jié)合酚提取量不同。在所考察的6種酶中，以α-淀粉酶作用下的結(jié)合酚提取量最多，其次為果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶作用相當，而胃蛋白酶作用下的結(jié)合酚提取量相對較少。說明甘薯中結(jié)合酚主要是以與淀粉、果膠呈結(jié)合態(tài)形式存在，另有少部分以與纖維素和蛋白質(zhì)結(jié)合形式存在。試驗進一步選取α-淀粉酶、果膠酶、中性蛋白酶和纖維素酶進行復(fù)合，對甘薯結(jié)合態(tài)多酚進行水解釋放。

2.2 復(fù)合酶水解單因素試驗

2.2.1 pH值對結(jié)合酚提取量的影響

pH值對結(jié)合酚提取量的影響見圖2。

圖2 pH值對結(jié)合酚提取量的影響Fig.2 Effect of pH on the yield of bound phenol

由圖2可知，pH值由4升至6，結(jié)合酚提取量明顯增加，pH值為6時達到最大。pH值增加到7時，結(jié)合酚提取量迅速降低。說明pH 5～6的弱酸性條件下復(fù)合酶活力強，有利于其將結(jié)合酚釋放出來，而強酸和中性條件下復(fù)合酶活力受到抑制，不利于其發(fā)揮作用。

2.2.2 水解溫度對結(jié)合酚提取量的影響

總之，早期限制性液體復(fù)蘇可以明顯改善重癥急性胰腺炎患者的胃腸功能障礙，降低腹內(nèi)高壓的發(fā)生率，提高機體的免疫功能，從而改善患者的預(yù)后情況，值得臨床推廣。

水解溫度對結(jié)合酚提取量的影響見圖3。

圖3 水解溫度對結(jié)合酚提取量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the yield of bound phenol

由圖3可知，在45℃～65℃時，隨著水解溫度的升高，結(jié)合酚提取量升高，水解溫度達到55℃時，結(jié)合酚提取量最大，說明55℃為復(fù)合酶最適作用溫度。水解溫度繼續(xù)升高，結(jié)合酚提取量緩慢下降，可能是水解溫度升高酶活受到抑制，高溫條件下導(dǎo)致釋放出的結(jié)合酚結(jié)構(gòu)被破壞。

2.2.3 液料比對結(jié)合酚提取量的影響

液料比對結(jié)合酚提取量的影響見圖4。

由圖4可知，隨著液料比由5∶1（mL/g）增加到10∶1（mL/g），結(jié)合酚提取量增加迅速，表明液料比的增加促進了酶對結(jié)合酚的水解釋放。當溶液體積繼續(xù)增加，結(jié)合酚提取量反而減少，可能是由于液體體積的增加，增大了與空氣之間的接觸面積從而使釋放出的結(jié)合酚氧化，因此選擇液料比10∶1（mL/g）進行后續(xù)試驗。

2.2.4 水解時間對結(jié)合酚提取量的影響

水解時間對結(jié)合酚提取量的影響見圖5。

由圖5可知，當水解時間不斷延長，結(jié)合酚提取量迅速增加，水解15 h后，結(jié)合酚提取量趨于平緩，可能因為溶液中結(jié)合酚溶解量已達飽和，水解20 h后，結(jié)合酚提取量略有下降，可能是水解時間的延長使釋放出的高濃度的結(jié)合酚與氧氣接觸機會增大，導(dǎo)致氧化而發(fā)生含量下降。

2.2.5 不同酶種類和用量對結(jié)合酚提取量的影響

不同酶種類和用量對結(jié)合酚提取量的影響見圖6～圖9。

圖7 纖維素酶用量對結(jié)合酚提取量的影響Fig.7 Effect of cellulase dosage on the yield of bound phenol

圖8 α-淀粉酶用量對結(jié)合酚提取量的影響Fig.8 Effect of α-amylase dosage on the yield of bound phenol

圖9 果膠酶用量對結(jié)合酚提取量的影響Fig.9 Effect of pectinase dosage on the yield of bound phenol

共價鍵與食品基質(zhì)相結(jié)合是食品中結(jié)合酚的結(jié)合方式。其中，與多酚結(jié)合的細胞壁物質(zhì)主要包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠[10]，因此，加入相應(yīng)酶類對這些細胞壁物質(zhì)進行水解，可分解細胞壁組織，使得與其結(jié)合的多酚釋放出來。而淀粉酶的水解作用則可使淀粉鏈伸展，破壞其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)并水解糖苷鍵，促使與淀粉結(jié)合的多酚有效釋放[20]。由圖6～圖9可知，當各酶加酶量為果膠酶600 U/g、纖維素酶600 U/g、α-淀粉酶400 U/g和中性蛋白酶600 U/g時，該復(fù)合酶配比能使酶解作用發(fā)揮到最大。繼續(xù)增加各酶量，結(jié)合酚提取量不再增加，說明水解作用基本趨于飽和。同時，加酶量增加，也會使釋放的淀粉、蛋白質(zhì)這樣的大分子增加，導(dǎo)致溶液黏度增加，反而不利于結(jié)合酚的提取，導(dǎo)致提取量迅速下降。

2.3 甘薯結(jié)合酚提取響應(yīng)面試驗及結(jié)果分析

2.3.1 響應(yīng)模型的建立與分析

響應(yīng)面分析設(shè)計及試驗結(jié)果見表3。方差分析見表4。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

采用Design-Expert 10軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得響應(yīng)值結(jié)合酚提取量（Y）對各因素真實值的二次回歸模型方程為Y=0.13+0.030A+0.006 417B+0.000 75C+0.001 083D+0.004 5AB+0.000AC-0.002 25AD+0.000BC-0.002 25BD-0.025A2-0.00185B2-0.004 1C2-0.002 35D2。

表3 響應(yīng)面分析設(shè)計及試驗結(jié)果Table 3 Program and experimental results of RSM

由表4可知，變量模型P<0.01，達到極顯著水平，回歸方程失擬項P=0.224 5，差異不顯著，R2=0.882 6，表明88.26%的數(shù)據(jù)可以用此方程解釋。方差分析結(jié)果表明，方程中A、A2對結(jié)合酚提取量的影響極顯著，B對結(jié)合酚提取量的影響顯著，各因素交互項對響應(yīng)值的影響不顯著。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析

各因素交互作用對結(jié)合酚提取量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖見圖10。

圖10 各因素交互作用對結(jié)合酚提取量影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.10 Responsive surfaces and contour maps for each factor interaction effect on the amount of bound phenol extraction

由圖10可知，隨溶液體積的增加，結(jié)合酚提取量表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢；隨水解時間的延長，呈現(xiàn)逐漸增加后趨于平緩的趨勢；隨水解溫度的升高，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢；隨水解溫度的升高，呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。由此可見，各因素之間交互作用對結(jié)合酚提取量的影響不大。

2.3.3 驗證試驗

以響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)結(jié)合實際操作調(diào)整參數(shù)，即液料比 15 ∶1（mL/g）、水解時間 16 h、水解溫度53℃、pH值為6，進行復(fù)合酶水解法釋放甘薯結(jié)合酚，實際測得結(jié)合酚提取量為（0.140±0.002）g/100 g，達到預(yù)測值（0.143 g/100 g）的97.55%，說明了回歸模型的可靠性。該條件下結(jié)合酚提取量是單一纖維素酶、單一中性蛋白酶作用下提取量的2.63倍，單一果膠酶作用下提取量的2.11倍，單一α-淀粉酶作用下提取量的1.42倍。

3 結(jié)論

以α-淀粉酶（用量400U/g）、果膠酶（用量600U/g）、纖維素酶（用量600 U/g）、中性蛋白酶（用量600 U/g）4種酶復(fù)合對甘薯結(jié)合酚進行水解釋放，最佳工藝條件為液料比 15∶1（mL/g）、水解時間 16 h、水解溫度 53℃、pH6，此時結(jié)合酚提取量為0.140 g/100 g，達到預(yù)測值0.143 g/100 g的97.55%，說明了該工藝的可行性。該工藝所得結(jié)合酚提取量是僅使用單種酶類進行水解所得結(jié)合酚提取量的1.42倍～2.63倍，由此可見，運用酶解法提取甘薯結(jié)合酚，復(fù)合酶水解釋放的效果優(yōu)于單一酶的效果。