p38MAPK信號(hào)通路的抑制減輕缺氧復(fù)氧環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡

李越凡，徐丹，李婷，朱為勇

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球范圍內(nèi)超過720萬人死于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。鋰?yán)重危害著人類的生命健康。心肌梗死后最為有效方法是恢復(fù)心肌血液流通，冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)、溶栓等是目前常用的恢復(fù)心肌缺血再灌注的有效方法[1]。當(dāng)心肌缺血再灌注后常會(huì)出現(xiàn)心肌組織損傷加重、心力衰竭等現(xiàn)象，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡，這稱為心肌缺血再灌注損傷。氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞大量凋亡等是其發(fā)生的主要原因[2-5]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)過程，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)通路之一，p38MAPK是MAPK的成員之一，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、死亡、遷移等多種生物學(xué)特性中有廣泛的調(diào)控作用[6-9]。有研究表明，p38MAPK在心肌梗死組織中過度激活，其磷酸化水平升高，致細(xì)胞炎癥因子聚集，使心肌細(xì)胞凋亡增加[10,11]。之前的研究表明，15 μmol/L的p38MAPK特異性抑制劑SB203580（SB）能夠特異性的抑制p38MAPK磷酸化[12,13]。本研究通過體外構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，探討p38MAPK信號(hào)通路抑制劑對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響，以期為靶向抑制p38MAPK信號(hào)通路治療心肌缺血再灌注損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料心肌細(xì)胞H9C2購自中科院上海細(xì)胞庫。活性氧（ROS）含量檢測(cè)試劑盒（DCFH-DA法）購自于碧云天生物技術(shù)研究所；超氧化物歧化酶（SOD）含量檢測(cè)試劑盒（黃嘌呤氧化法）購自于為上海紀(jì)寧生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）含量試劑盒（二硝基苯肼顯色法）購自于南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒（硫代巴比妥酸比色法）購自于南京森貝伽生物科技有限公司；p38MAPK多克隆抗體、p-p38MAPK多克隆抗體、β肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體、Cleaved Caspase-3多克隆抗體均購自于美國Abcam；p38MAPK特異性抑制劑SB203580、胰蛋白酶均購自美國Sigma；胎牛血清購自于美國Gibco。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)將保存在液氮中的H9C2細(xì)胞取出，放置于37℃水浴中，觀察細(xì)胞融化后，用細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的DMEM）懸浮細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，棄上清液，用5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度超過85%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，用0.25%的胰蛋白酶在37℃消化細(xì)胞2 min，1000 r/min離心10 min，棄上清液，用5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，按照1:3的比例種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建：H9C2細(xì)胞在37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞密度超過80%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含有胎牛血清的培養(yǎng)液，放在1%O2，94% N2，5%CO2缺氧培養(yǎng)箱中孵育12 h。棄培養(yǎng)液，加入含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃，20%O2，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。H9C2細(xì)胞分為Con組、H/R組、SB203580組。其中Con組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理；H/R組、SB203580組進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，SB203580組細(xì)胞在缺氧復(fù)氧前用15μmol/L的p38MAPK特異性抑制劑SB203580預(yù)處理24 h。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖H9C2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有105個(gè)細(xì)胞，接種到96孔板中，每孔中加入100 μl的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)過夜。按照Con組、H/R組、SB203580組分組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以不加細(xì)胞的孔為空白組，用于調(diào)零。按照3.3中方法處理各組細(xì)胞，待細(xì)胞復(fù)氧后，在每孔中加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，在37℃孵育4 h，吸取培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜溶液150 μl，反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的OD值，分析計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=100%×（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）÷（Con組OD值-空白組OD值）

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡Con組、H/R組、SB203580組細(xì)胞按照3.3中方法處理后，待細(xì)胞復(fù)氧后，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有6×105個(gè)細(xì)胞，收集1 ml細(xì)胞懸浮液，1000 r/min離心10 min，棄上清液，在細(xì)胞沉淀中加200μL結(jié)合緩沖液重懸，依次加入5 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μl碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），放置于室溫避光條件下孵育15 min ，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 LDH、SDH、SOD、ROS含量檢測(cè)Con組、H/R組、SB203580組細(xì)胞按照3.3中方法處理后，待細(xì)胞復(fù)氧后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清液及細(xì)胞，用二硝基苯肼顯色法檢測(cè)上清液中LDH含量，用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞中MDA含量，用黃嘌呤氧化法檢測(cè)細(xì)胞中SOD含量，DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量。檢測(cè)步驟分別參照LDH、MDA、SOD、ROS含量檢測(cè)試劑盒。

1.7 Western blot檢測(cè)p38MAPK、p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3表達(dá)Con組、H/R組、SB203580組細(xì)胞按照3.3中方法處理后，待細(xì)胞復(fù)氧后，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸除后，加入裂解液充分裂解，轉(zhuǎn)移至離心管中，14000 r/min，4℃離心10 min。將蛋白上清液吸取至新的EP管中，用BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品與等體積的2×Loading buffer在100℃煮沸5 min后進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳：每孔加入50 μg變性蛋白，濃縮膠中電壓為80 V，分離膠中電壓為120 V。轉(zhuǎn)膜：90 V電壓，4℃轉(zhuǎn)膜70 min。封閉：5%牛血清白蛋白室溫封閉60 min。一抗孵育：1:800倍稀釋，4℃反應(yīng)過夜。二抗孵育：1:1000倍稀釋，室溫孵育60 min。顯色，凝膠成像分析儀采集圖像，分析蛋白表達(dá)水平。蛋白表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SB203580在缺氧條件下恢復(fù)細(xì)胞增殖Con組、H/R組、SB203580組細(xì)胞存活率依次為：（100.43±8.57）%、（52.49±6.62）%、（75.17±6.37）%。H/R組、SB203580組細(xì)胞存活率均明顯低于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tH/R=7.668，PH/R＜0.01，tSB=4.097，PSB＜0.05）。SB203580組細(xì)胞存活率明顯高于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.276，P＜0.05）（圖1）。

2.2 SB203580在缺氧條件下減少細(xì)胞凋亡Con組、H/R組、SB203580組細(xì)胞凋亡率依次為：（4.41±0.91）%、（33.12±3.47）%、（12.24±2.40）%。H/R組、SB203580組細(xì)胞凋亡率均明顯高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tH/R=13.862，PH/R＜0.01，tSB=5.284，PSB＜0.01）。SB203580組細(xì)胞凋亡率明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.572，P＜0.01）（圖2）。

2.3 SB203580在缺氧條件下恢復(fù)MDA水平Con組、H/R組、SB203580組MDA含量依次為：（0.39±0.67）mmol/L、（2.12±0.14）mmol/L、（1.25±0.07）mmol/L。H/R組、SB203580組MDA含量明顯高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tH/R=20.580，PH/R＜0.01，tSB=18.476，PSB＜0.01）。SB203580組MDA含量明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.406，P＜0.01）（圖3）。

圖2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

圖3 細(xì)胞中MDA含量

2.4 SB203580在缺氧條件下降低細(xì)胞ROS水平，恢復(fù)SOD水平熒光強(qiáng)度越高表示ROS水平越高。Con組、H/R組、SB203580組熒光強(qiáng)度（ROS水平）依次為：78.19±7.17、277.72±24.25、180.78±17.68，SOD含量依次為：（165.36±9.89）U/mL、（89.44±8.79）U/mL、（130.23±8.97）U/mL。H/R、SB203580組ROS含量均明顯高于Con組，SOD含量均明顯低于Con組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tH/R-ROS=13.667，PH/R-ROS＜0.01，tSB-ROS=9.314，PSB-ROS＜0.01，tH/R-SOD=10.961，PH/R-SOD＜0.01，tSB-SOD=4.557，PSB-SOD＜0.05）。SB203580組ROS含量明顯低于H/R組，而SOD含量明顯高于H/R組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tROS=5.595，PROS≤0.01，tSOD=6.280，PSOD＜0.05）（圖4）。

2.5 SB203580在缺氧條件下減少LDH外漏Con組、H/R組、SB203580組LDH含量依次為：（25.39±4.76）U/L、（95.21±6.14）U/L、（58.44±5.56）U/L。H/R組、SB203580組LDH含量均明顯高于Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tH/R=15.566，PH/R＜0.01，tSB=7.821，PSB＜0.01）。SB203580組LDH含量明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.689，P＜0.01）（圖5）。

2.6 SB203580在缺氧條件下降低p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平Con、H/R、SB203580組p38MAPK水平依次為：0.83±0.08、0.82±0.04、0.84±0.06，p-p38MAPK水平依次為：0.12±0.04、0.28±0.02、0.19±0.01，Cleaved Caspase-3水平依次為：0.15±0.03、0.76±0.06、0.35±0.04。H/R、SB203580組p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平均明顯高于Con組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tH/R-p-p38MAPK=6.197，PH/R-p-p38MAPK＜0.01，tSB-p-p38MAPK=2.941，PSB-p-p38MAPK＜0.05，tH/R-Cleaved Caspase-3=15.750，PH/R-Cleaved Caspase-3＜0.01，tSB-CleavedCaspase-3=6.928，PSB-CleavedCaspase-3＜0.01）。SB203580組p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3水平明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（tp-p38MAPK=6.971，Pp-p38MAPK＜0.01，tCleavedCaspase-3=9.848，PCleavedCaspase-3＜0.01）（圖6）。

圖4 細(xì)胞中ROS和SOD含量

圖5 培養(yǎng)液上清中LDH含量

3 討論

心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生與氧化應(yīng)激、鈣離子超載、炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞凋亡等有關(guān)[14]。研究表明，心肌缺血后，恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血液流通時(shí)，動(dòng)脈血會(huì)將氧轉(zhuǎn)運(yùn)至缺血區(qū)，心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，引起氧化應(yīng)激，加重心肌損傷，造成心肌細(xì)胞凋亡[15,16]。p38MAPK信號(hào)通路能夠調(diào)控心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和信號(hào)傳遞過程，參與心肌缺血再灌注、心室重構(gòu)、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生[17-19]。研究表明，p38MAPK在心肌梗死組織中磷酸化水平升高，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑可以改善心肌缺血再灌注損傷[20,21]。p38MAPK信號(hào)通路磷酸化后生成p-p38MAPK發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[22]。

圖6 細(xì)胞中p38MAPK、p-p38MAPK、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)會(huì)伴隨大量的心肌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生與多種細(xì)胞因子的調(diào)控有關(guān)，Caspase蛋白家族是目前公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的凋亡相關(guān)蛋白，其激活后能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[23,24]。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，正常情況下以酶原的形式存在，當(dāng)其活化后形成Cleaved Caspase-3后標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段[25-28]。本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后的心肌細(xì)胞凋亡率大大增加，細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高，而p38MAPK信號(hào)通路抑制劑作用后的心肌細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平降低。提示p38MAPK信號(hào)通路抑制劑能夠部分逆轉(zhuǎn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

正常情況下，細(xì)胞中氧化和抗氧化水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞中氧自由基不能及時(shí)清除而造成氧自由基異常聚集，最終會(huì)引起氧化應(yīng)激[29-32]。低濃度的ROS能夠維持細(xì)胞中正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而ROS異常增多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[33-35]。SOD屬于抗氧化系統(tǒng)的蛋白酶，能夠特異性的清除機(jī)體內(nèi)氧自由基，是氧自由基的天然清除劑[36,37]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，破壞細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞漿內(nèi)的LDH外漏，而MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物[38-40]。本研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞中ROS、MDA水平升高，而細(xì)胞中SOD水平下降，培養(yǎng)液上清液中LDH含量升高，而p38MAPK信號(hào)通路抑制劑處理后能夠部分逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。這提示，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑可以減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷。

綜上所述，p38MAPK信號(hào)通路抑制劑能夠改善缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷，為后續(xù)進(jìn)一步探討p38MAPK信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中的作用奠定了基礎(chǔ)，為靶向p38MAPK信號(hào)通路治療心肌缺血再灌注損傷提供了理論依據(jù)。本研究存在一定的局限性，只探討了p38MAPK信號(hào)通路對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷的作用，后續(xù)試驗(yàn)中會(huì)進(jìn)一步探討其對(duì)心肌缺血再灌注炎癥因子、鈣超載等的影響。