MiR-125b對(duì)心肌梗死后成纖維細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制研究

沈志方，許學(xué)升，孫繼蘭

在我國(guó)，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。珻HD）尤其是急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，甚至呈逐年上升趨勢(shì)[1]。大量研究表明，心肌和細(xì)胞外基質(zhì)因適應(yīng)不良變化而致心室病理性重構(gòu)是心肌梗死進(jìn)展的重要病理過(guò)程[2]。在心室重構(gòu)的過(guò)程中往往會(huì)積累較多的促炎因子和血管活性因子，促使心臟成纖維細(xì)胞（CFs）的增殖和活化，從而導(dǎo)致心肌過(guò)度纖維化[3]。因此抑制CFs活化和心室重構(gòu)，減輕心肌纖維化的發(fā)生具有十分重要的臨床意義。近些年，微小核糖核酸（miRNAs）在心血管疾病診斷和治療領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力，參與機(jī)體多種生理病理調(diào)控過(guò)程，包括動(dòng)脈粥樣硬化板塊的形成、心肌梗死后血管再生、心室重構(gòu)等[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b在靜止期成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖[6]。目前關(guān)于miR-125b對(duì)心肌梗死后成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為具體的調(diào)控作用及可能的作用機(jī)制探討尚少。本研究通過(guò)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)/下調(diào)成人心臟成纖維細(xì)胞（HCF-a）中miR-125b的表達(dá)水平，探討miR-125b對(duì)HCF-a膠原合成的影響以及可能的作用機(jī)制，為冠心病患者提供新的治療選擇。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源成人HCF-a細(xì)胞購(gòu)自American Type Culture Collection公司。

1.2 主要試劑miR-125b模擬物由上海生工生物工程有限公司合成并提供；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自中國(guó)博士德生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒，購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物公司；抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Opti-MEM培養(yǎng)基、心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA細(xì)胞消化液（0.25%），購(gòu)自北京鈕因華信科技發(fā)展有限公司；FBS胎牛血清和鏈霉素-青霉素雙抗，購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。Trizol，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；DEPC，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；30%H2O2，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水，購(gòu)自安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

1.3 主要儀器GTR16-2型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，購(gòu)自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)MJ Research公司；UV-8000紫外分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精密儀器儀表公司；多功能酶標(biāo)儀，購(gòu)自日本Bio-Rad公司；CX41倒置光學(xué)顯微鏡和OLS4100激光共聚焦顯微鏡，購(gòu)自日本奧林巴斯醫(yī)療公司；電子分析天平，購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司；Amersham電泳儀，購(gòu)自瑞典Bioscience公司；恒溫水浴搖床和YCZ-40D型轉(zhuǎn)移電泳槽，購(gòu)自北京六一儀器廠；FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)，美國(guó)ProteinSimple公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)將HCF-a細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24～48 h更換培養(yǎng)液，48 h傳代一次。

1.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染提前1 d在相應(yīng)備行轉(zhuǎn)染的6孔板上接種5×108個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24～48 h后，融合率達(dá)到50%～60%，在不同2 ml無(wú)菌EP管中分別加入適量生理鹽水，然后按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說(shuō)明書，在EP管中分別加入5 μl miR-125 b模擬物和250 μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，混勻，室溫放置10 min；另外在5 ul脂質(zhì)體Lipofectamine 2000溶液中加入250 μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)液，振蕩混勻后，室溫放置10 min；將上述兩種溶液吹打混勻，室溫放置30 min；將脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合液滴加至孔板細(xì)胞表面，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。提取細(xì)胞RNA及蛋白，驗(yàn)證目的基因表達(dá)情況及轉(zhuǎn)染效率。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組分為空白對(duì)照組和miR-125b模擬物轉(zhuǎn)染組。

1.4.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性將HCF-a細(xì)胞（2×105個(gè)/孔）單層接種到96孔板中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每組設(shè)置8個(gè)平行孔，每隔24 h選擇6個(gè)重復(fù)孔加入20 μl MTT，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄除上清液，每孔加入200 μl DMSO，置于振動(dòng)器上震動(dòng)5 min，置于顯微鏡下觀察無(wú)紫色結(jié)晶物。將96孔板放置于450酶標(biāo)儀上，檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，參比波長(zhǎng)為450 nm處的吸光光度值（OD值），計(jì)算平均值。

1.4.5 遷徙與侵襲實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞置入離心管中，離心，棄上清；加入無(wú)血清的DMEM重懸；調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103個(gè)/ml。將100 μl HCF-a細(xì)胞（5×104個(gè)/孔）單層接種到24孔板中由聚碳酸酯膜嵌套的transwell小室中，外部小室中放入600 μl含有10%FBS的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育12 h；將侵襲小室內(nèi)部用4%多聚甲醛固定30 min，再用PBS進(jìn)行清洗；然后用0.1%的結(jié)晶紫將外部小室進(jìn)行染色30 min，顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算遷移率。

1.4.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集細(xì)胞調(diào)整至1×106/ml，采用PBS清洗細(xì)胞兩次，加入500 μl binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 ul碘化丙啶，混勻，避光孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.7 提取總RNA①收集細(xì)胞1×1010個(gè)，置于EP管中；②加入1 ml預(yù)冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；③加入200 μl氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；④12 000 rpm離心，取上清；⑤加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；⑥12 000 rpm離心，棄上清；⑦加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 rpm離心，棄上清；⑧將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；⑨加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用凝膠電泳檢測(cè)RNA分子量；采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

1.4.8 RNA逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.9 實(shí)時(shí)定量PCR將20 μl反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴60 min，85℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 μl進(jìn)行PCR。冰浴中配制20 μl PCR反應(yīng)體系，95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，循環(huán)45次。引物序列如下： Col-Ⅰ（上游引物：5’-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3’；下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’）；Col-Ⅲ（上游引物：5’-CAGCTTTGAG GTTCGTGTTTGT-3’；下游引物：5’-ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA -3’）；α-S M A（上游引物：5’-C A G C T T T G A G G T T C G T G T T T G T-3’；下游引物：5’- A T G C T C T T C T T T T T T G C G G A A A-3’）； TGF-β1（上游引物：5’-GTG TGGAGCAACATCTGGCCTCTA-3’；下游引物：5’- TTGGTTCAGCCACTGCCGAT-3’）；β-actin（上游引物：5’-TGGC GATGGCAGTGTCTTAG-3’；下游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’）。

1.4.10 Western blot①提取蛋白樣品；②蛋白樣品凝膠電泳；③轉(zhuǎn)膜；④封閉；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦顯影；⑧采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)膜上的蛋白表達(dá)條帶，采用FluorChem FC3凝膠成像數(shù)碼分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以積分光密度（IOD）表示灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)非正態(tài)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞增殖活性的影響經(jīng)MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-125b模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞系生長(zhǎng)速度明顯高于空白對(duì)照組，尤其是96 h之后，兩組細(xì)胞的OD值逐漸出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表1，圖1）。

表1 不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞增殖活性的影響

圖1 不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞膠原合成能力的影響經(jīng)PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)HCF-a細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA和蛋白水平均有明顯上調(diào)作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表2，圖2）。

2.3 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞活化能力的影響α-SMA是肌成纖維細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物。經(jīng)PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)HCF-a細(xì)胞α-SMA mRNA和蛋白水平均有明顯上調(diào)作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表3，圖2）。

2.4 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響與空白對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-125b可明顯提高HCF-a細(xì)胞體外遷移能力，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖3）。

2.5 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，miR-125b過(guò)表達(dá)可明顯抑制HCF-a細(xì)胞的凋亡，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表4）。

2.6 miR-125b對(duì)TGF-β1通路的調(diào)控作用經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，miR-125b過(guò)表達(dá)可明顯促進(jìn)TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平（P＜0.05）；經(jīng)western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)HCF-a細(xì)胞Smad2/Smad3蛋白磷酸化水平均有明顯上調(diào)作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表5、圖4～5）。

3 討論

心肌梗死會(huì)引發(fā)心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)代償性活化，從而促使大量膠原蛋白分泌，損傷心肌功能，造成心室重構(gòu)、心肌纖維化等病理進(jìn)程，最終導(dǎo)致心力衰竭[7]。非梗死區(qū)心肌纖維化是引發(fā)進(jìn)展性心室重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此如何調(diào)控心肌細(xì)胞成纖維化是防止心力衰竭的重要研究方向[8]。

圖2 miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)HCF-a細(xì)胞膠原Ⅰ、膠原Ⅲ和α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)的影響

表2 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞膠原Ⅰ和膠原Ⅲ合成能力的影響

表3 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)的影響

圖3 過(guò)表達(dá)miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞遷徙能力的影響

表4 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞凋亡率的影響

表5 miR-125b對(duì)HCF-a細(xì)胞TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)的影響

圖4 miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)HCF-a細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

圖5 miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)HCF-a細(xì)胞p-Smad2/Smad3蛋白表達(dá)的影響

MicroRNAs作為內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3’端非編碼區(qū)，編碼區(qū)或5’非編碼區(qū)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，抑制或降解靶mRNA的翻譯，從而參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化等多種病理生理過(guò)程[9]。有研究顯示，miR-125b可以調(diào)控CFs細(xì)胞的增殖、活化和凋亡，但是可能的作用機(jī)制尚不清楚[10]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）與成纖維細(xì)胞活化密切相關(guān)，其中TGF-β1是重要的亞型分子之一，可以通過(guò)抑制膠原酶的分泌和細(xì)胞外間質(zhì)成分的降解，促使CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11,12]；miR-125b是否也參與了對(duì)TGF-β1的調(diào)控是我們研究的目的。本項(xiàng)研究中，選擇穩(wěn)定性良好的人成纖維細(xì)胞HCF-a，分離子成年人心房組織，實(shí)驗(yàn)差異較小。CFs屬于合成膠原的非心肌細(xì)胞，同時(shí)也是分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要細(xì)胞，CFs的增殖和轉(zhuǎn)化是參與心肌纖維化和心室重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。本項(xiàng)研究首先體外將miR-125b模擬物轉(zhuǎn)染至HCF-a細(xì)胞，對(duì)比空白對(duì)照組和miR-125b過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖、膠原合成能力、分化、轉(zhuǎn)移能力和凋亡的影響。結(jié)果顯示，miR-125b過(guò)表達(dá)可促使HCF-a細(xì)胞增殖、膠原Ⅰ和Ⅲ的合成、活化相關(guān)標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)、轉(zhuǎn)移，另外，miR-125b也參與成纖維細(xì)胞的凋亡。Ghosh等研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可能與內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程密切相關(guān)。其中TGF-β1/Smad通路是參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要途徑，CFs和肌成纖維細(xì)胞是分泌TGF-β1的主要細(xì)胞，TGF-β1大量聚集又會(huì)反饋性促使CFs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而導(dǎo)致心肌纖維化，甚至引發(fā)心力衰竭。Smad2/Smad3是與TGF-β1信號(hào)傳遞密切相關(guān)的特異性底物蛋白，通過(guò)RT-PCR和western blot方法探討miR-125b對(duì)TGF-β1基因及TGF-β1通路下游核心調(diào)控蛋白Smad2/Smad3磷酸化的影響，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-125b可明顯上調(diào)TGF-β1 mRNA和p-Smad2/Smad3蛋白的表達(dá)，從而提示TGF-β1通路可能是miR-125b參與調(diào)控成纖維細(xì)胞一系列生物學(xué)行為的作用靶途徑。但其關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)或者靶基因仍然需要進(jìn)一步研究探討。

總之，抑制TGF-β1/Smad通路引起的心肌纖維化，是治療心肌梗死后進(jìn)展至心力衰竭的關(guān)鍵。隨著對(duì)mi RNAs研究的深入，越來(lái)越多的mi RNAs被發(fā)現(xiàn)參與心臟成纖維細(xì)胞的增殖、活化、凋亡等生理病理過(guò)程，這將為mi RNAs用于臨床心血管疾病抗心衰治療提供理論基礎(chǔ)。綜上所述，本項(xiàng)研究證實(shí)miR-125b可以通過(guò)上調(diào)TGF-β1 基因和特異性底物蛋白Smad2/Smad3的磷酸化參與促使心臟成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此miR-125b可作為心肌纖維化的干預(yù)靶點(diǎn)，為后續(xù)心血管疾病的治療提供了新的研究和治療方向。