下調(diào)KLF5抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大機(jī)制研究

沈丹鳳，王燕，蔣華

心肌肥大是心肌梗死、心肌缺血、心力衰竭等疾病發(fā)生的危險因素，心肌肥厚與多種細(xì)胞因子有關(guān)，其中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、胰島素樣生長因子、內(nèi)皮素-1、白介素-1等均是目前發(fā)現(xiàn)的與心肌肥厚有關(guān)的細(xì)胞因子[1]，AngⅡ是目前公認(rèn)的與心肌肥厚有關(guān)的內(nèi)分泌因子，也是常用的體外構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型的誘導(dǎo)因子[2]。Krüpple樣因子（krüpple-like factor，KLF）參與調(diào)控細(xì)胞的分化、發(fā)育等過程，屬于轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，其中KLF5蛋白成員參與心室重構(gòu)，并且與心肌肥厚具有密切關(guān)系[3]。在小鼠心肌肥大模型中發(fā)現(xiàn)KLF5 mRNA表達(dá)水平異常升高，KLF5（+/-）小鼠模型經(jīng)腹主動脈結(jié)扎以后，小鼠的心肌肥大發(fā)展程度、心臟體重比均明顯降低，敲除心肌成纖維細(xì)胞中KLF5的表達(dá)后，心肌纖維化和肥大程度減弱[4,5]。本研究旨在研究KLF5對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用及機(jī)制，為以后研究KLF5在心肌肥大發(fā)生中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)按照文獻(xiàn)[6]，取出生3 d內(nèi)的乳鼠，用酒精消毒以后，放在超凈工作臺取出心臟，放于PBS溶液中，洗滌掉血凝塊及紅細(xì)胞后，去除心房組織。剪碎心室，放置于離心管中，加入約8倍體積的0.1%的胰蛋白酶和0.04%的膠原酶Ⅱ，放在37℃的水浴中消化，靜置2 min，吸取消化的細(xì)胞懸浮液，在剩余的組織塊中繼續(xù)添加上述消化液，按照上述方法消化，直到組織消化完全。把收集的所有上清液混合后，1000 g離心10 min，棄上清，在細(xì)胞沉淀中添加10%胎牛血清的DMEM，2000 g離心10 min，200目過濾，用貼壁時間差2 h純化心肌細(xì)胞。收集細(xì)胞，用10%胎牛血清的DMEM按照1×105個細(xì)胞/ml種植到96孔板中，每孔中添加2 ml的溶液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分離的細(xì)胞經(jīng)鑒定為心肌細(xì)胞（α-actin免疫組化）。

1.2 細(xì)胞分組心肌細(xì)胞分為：對照組、模型組、陰性組、干擾組、陰性+AngⅡ組、干擾+AngⅡ組。對照組：不做任何處理，正常培養(yǎng)。模型組：在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加100 nm的AngⅡ。陰性組：心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照。干擾組：心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF5 siRNA。陰性+AngⅡ組：心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照，并在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加100 nm的AngⅡ。干擾+AngⅡ組：心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF5 siRNA，并在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加100 nm的AngⅡ。轉(zhuǎn)染用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000。陰性組、干擾組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的24 h，用定量即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法測定各組細(xì)胞中KLF5表達(dá)，步驟按照1.4和1.5中操作方法。

1.3 主要材料SD乳鼠由上海實驗動物中心提供；KLF5 siRNA、siRNA陰性對照為美國Abbexa產(chǎn)品；膠原酶Ⅱ、AngⅡ、胰蛋白酶為美國Sigma產(chǎn)品；Lipofectamine 2000為美國Invitrogen產(chǎn)品；KLF5一抗為美國Abcam產(chǎn)品；qRT-PCR、cDNA合成試劑均為大連Takara產(chǎn)品；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）抗體為北京博奧森產(chǎn)品；Fluo-2鈣探針為美國Perkin Elmer產(chǎn)品；乳酸脫氫酶（LDH）含量測定試劑盒為上海rongbai產(chǎn)品；丙二醛（MDA）含量測定試劑盒為上海裕信產(chǎn)品；超氧化物歧化酶（SOD）含量測定試劑盒為北京Solarbio產(chǎn)品。

1.5 Western blot檢測AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞中KLF5的表達(dá)對照組、模型組細(xì)胞分別按照上述方法分組處理以后，孵育24 h，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，在冰上孵育30 min。放在4℃的離心機(jī)，12 000 g離心10 min。吸取上清，用Bradford法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳：10%分離膠和5%的濃縮膠電泳，每個泳道添加50 μg蛋白，90 V電泳，直到溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部以后，把凝膠取出，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。半干式轉(zhuǎn)膜：100 mA，4 ℃，轉(zhuǎn)膜時間為60 min。把膜放在5%脫脂奶粉中，于室溫環(huán)境孵育2 h。結(jié)合一抗：用PBST按照1：600稀釋KLF5一抗，4℃孵育12 h。結(jié)合二抗：把膜放在用PBST按照1：3000稀釋的二抗中，在室溫中孵育2 h。化學(xué)發(fā)光以后，用Bio 1D對各條帶進(jìn)行定量分析，β-actin為內(nèi)參。

1.6 心肌細(xì)胞體積測定對照組、模型組、陰性+AngⅡ組、干擾+AngⅡ組按照上述方法分別處理孵育24 h。把細(xì)胞培養(yǎng)液吸除以后，用PBS洗滌3次。收集細(xì)胞，把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到底部為硅化的蓋玻片的細(xì)胞室內(nèi)，用CIAS大恒分析系統(tǒng)測定每個細(xì)胞的直徑，細(xì)胞為圓形，計算細(xì)胞體積，每個孔隨機(jī)選擇4個視野，在每個視野中選15個細(xì)胞。

1.7 心肌細(xì)胞蛋白含量檢測對照組、模型組、陰性+AngⅡ組、干擾+AngⅡ組按照上述方法分別處理孵育24 h。提取細(xì)胞總蛋白，以Bradford方法測定每組心肌細(xì)胞中的總蛋白水平。同時收集各組細(xì)胞，qRT-PCR測定肥大基因心房利鈉肽（ANP） mRNA的水平，步驟同上。引物：ANP F 5，-GCTTCCGGGATGAAAACGTC-3’，R 5，-ACCAATCCATTGCCGACTATG-3’。

1.8 CaN蛋白和靜息狀態(tài)下Ca2+水平檢測對照組、模型組、陰性+AngⅡ組、干擾+AngⅡ組按照上述方法分別處理孵育24 h。收集細(xì)胞，用Western blot方法測定細(xì)胞中CaN蛋白水平，步驟同上，CaN抗體以1：800稀釋。另外收集各組細(xì)胞，用激光共聚焦顯微鏡測定細(xì)胞靜息狀態(tài)下Ca2+水平，步驟為：各組心肌細(xì)胞中添加Fluo-2鈣探針，放在37℃中孵育40 min，將細(xì)胞滴加到載玻片上，上機(jī)檢測，氬激光進(jìn)行掃描，530 nm的發(fā)射波長，480 nm的激發(fā)波長，物鏡放大40倍，1024×1024的掃描密度，用TCS-SP2分析，Ca2+的濃度和熒光強(qiáng)度呈正比。以對照組為1，分析Ca2+水平。

1.9 細(xì)胞中SOD、MDA和培養(yǎng)液中LDH水平檢測對照組、模型組、陰性+AngⅡ組、干擾+AngⅡ組按照上述方法分別處理孵育24 h。取細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞。檢測培養(yǎng)液中LDH水平。檢測細(xì)胞中MDA和SOD的水平。步驟分別參照LDH含量測定試劑盒（二硝基苯肼法），MDA含量測定試劑盒（硫代巴比妥酸法），SOD含量測定試劑盒（黃嘌呤法）。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計分析，計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)用獨立樣本t檢驗，多組差異之間的比較用單因素方差，組間比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞中KLF5的表達(dá)AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞中的KLF5 mRNA水平升高3倍多，并且其表達(dá)的蛋白水平也明顯升高，與正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。KLF5在AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（圖1，表1）。

2.2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF5 siRNA后KLF5的表達(dá)水平心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染KLF5 siRNA后，細(xì)胞中的KLF5 mRNA明顯下調(diào)，并且KLF5蛋白水平也明顯下調(diào)，與沒有轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA control后，心肌細(xì)胞中的KLF5 mRNA以及蛋白水平同沒有轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比較，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2，表2）。

2.3 心肌細(xì)胞體積、細(xì)胞中蛋白含量和細(xì)胞中肥大基因ANP mRNA水平測定結(jié)果心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ作用后，心肌細(xì)胞的體積增加，細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量也增加，細(xì)胞內(nèi)的肥大基因ANP的轉(zhuǎn)錄水平也升高，AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。下調(diào)KLF5后的心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ誘導(dǎo)處理后，細(xì)胞的體積減小，細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量也減小，細(xì)胞內(nèi)的肥大基因ANP的轉(zhuǎn)錄水平也降低（表3）。

區(qū)塊鏈概念剖析及其在物聯(lián)網(wǎng)中的部分應(yīng)用…………………………………………………………田海博 24-6-19

圖1 Western blot法測定AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞中KLF5蛋白表達(dá)影響

表1 AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞中KLF5的表達(dá)（±s）

表1 AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞中KLF5的表達(dá)（±s）

注：KLF5：Krüpple樣因子5；mRNA：信使核糖核酸

組別 K L F 5 m R N A K L F 5 蛋白對照組 1.0 0 0.3 6±0.0 5模型組 3.2 8±0.4 1 0.9 7±0.0 8 P值 0.0 0 1 0.0 0 0

圖1 Western blot法測定AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞中KLF5蛋白表達(dá)影響

表2 各組細(xì)胞中KLF5 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組細(xì)胞中KLF5 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：KLF5：Krüpple樣因子5；mRNA：信使核糖核酸；與對照組相比，aP＜0.05；與陰性組相比，bP＜0.05

組別 K L F 5 m R N A K L F 5 蛋白對照組 1.0 0 0.4 2±0.0 6陰性組 0.9 6±0.1 3 0.4 0±0.0 9干擾組 0.2 6±0.0 5 ab 0.1 8±0.0 3 ab F值 8 0.3 5 1 1 2.6 6 7 P值 0.0 0 0 0.0 0 7

2.4 CaN蛋白和靜息狀態(tài)下Ca2+水平測定結(jié)果心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ作用后，心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下的Ca2+水平升高，細(xì)胞內(nèi)的CaN蛋白水平升高。下調(diào)KLF5后的心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ誘導(dǎo)處理后，心肌細(xì)胞靜息狀態(tài)下的Ca2+水平降低，細(xì)胞內(nèi)的CaN蛋白水平也降低。下調(diào)KLF5降低AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和CaN蛋白水平（圖3，表4）。

2.5 細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA和培養(yǎng)液中LDH水平測定結(jié)果心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ作用后，心肌細(xì)胞內(nèi)的MDA水平升高，SOD水平下降，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平也升高。下調(diào)KLF5后的心肌細(xì)胞經(jīng)過AngⅡ誘導(dǎo)處理后，心肌細(xì)胞中的MDA水平下降，SOD水平升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平降低。下調(diào)KLF5減少AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷（表5）。

表3 各組細(xì)胞體積和細(xì)胞中蛋白含量比較（±s）

表3 各組細(xì)胞體積和細(xì)胞中蛋白含量比較（±s）

注：mRNA：信使核糖核酸；ANP：心房利鈉肽：與對照組相比， aP＜0.05；與模型組相比， bP＜0.05

組別 體積（μm3） 蛋白含量（mg/ml） ANP mRNA對照組 1026.36±112.85 502.31±28.15 1.00模型組 1956.84±125.47a764.19±72.43a 2.36±0.20a陰性+AngⅡ組 1983.26±121.92 771.36±64.96 2.31±0.32b干擾+AngⅡ組 1432.93±102.80b613.29±45.12b 1.53±0.16c F值 46.833 16.357 30.633 P值 0.000 0.001 0.000

圖3 Western blot測定各組心肌細(xì)胞中CaN蛋白水平

表4 各組心肌細(xì)胞CaN蛋白和Ca2+水平比較（±s）

表4 各組心肌細(xì)胞CaN蛋白和Ca2+水平比較（±s）

注：CaN：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；Ca2+：鈣離子；與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

組別 CaN蛋白 Ca2+水平對照組 0.42±0.06 1.00模型組 1.85±0.13a 2.31±0.15a陰性+AngⅡ組 1.82±0.16 2.30±0.17干擾+AngⅡ組 0.75±0.09b 1.64±0.13b F值 119.365 68.818 P值 0.000 0.000

表5 各組細(xì)胞中SOD、MDA和培養(yǎng)液中LDH水平比較（±s）

表5 各組細(xì)胞中SOD、MDA和培養(yǎng)液中LDH水平比較（±s）

注：SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；LDH：乳酸脫氫酶；與對照組相比，aP＜0.05；與模型組相比，bP＜0.05

組別 S O D（U/L） M D A（m m o l/L） L D H（U/L）對照組 4 1.3 2±4.1 8 0.6 4±0.0 5 2 9.1 2±2.6 0模型組 2 6.1 7±1.2 9 a 0.9 2±0.0 9 a 7 4.9 5±6.8 2 a陰性+A n gⅡ組 2 5.3 8±2.4 1 0.9 3±0.1 2 7 3.8 4±7.3 1 b干擾+A n gⅡ組 3 4.0 5±3.8 2 b 0.7 6±0.0 7 b 5 5.0 7±4.9 8 c F值 1 7.0 5 6 7.7 4 3 4 1.9 9 3 P值 0.0 0 1 0.0 1 0 0.0 0 0

3 討論

KLF5基因可特異性的結(jié)合GT和CACCC元件，影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，對細(xì)胞的生長等發(fā)揮調(diào)控作用[7]。研究表明，KLF5通過提高胚胎平滑肌重鏈基因、內(nèi)皮生長因子受體、纖溶酶原激活物抑制劑等基因轉(zhuǎn)錄因子的活性誘導(dǎo)心血管的重塑，其在胚胎平滑肌中表達(dá)上調(diào)，而隨著血管的不斷生長，其表達(dá)含量表達(dá)下調(diào)，當(dāng)血管受到損傷以后，血管組織中的KLF5表達(dá)升高[8-10]。在下調(diào)KLF5表達(dá)后的小鼠中，經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后，小鼠心肌肥厚程度大大減弱，KLF5可能參與AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚，AngⅡ是一種潛在促生長因子，野生型的小鼠在連續(xù)注射14 d以后，小鼠的心臟體積比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)增加，而下調(diào)KLF5可以減弱AngⅡ的這一作用[4,5,11]。

心肌肥厚發(fā)生后，心肌細(xì)胞的體積異常增加，細(xì)胞內(nèi)的蛋白水平也升高[12]。ANP是心肌肥厚的重要指標(biāo)，也是一種肥大基因，其轉(zhuǎn)錄水平升高后標(biāo)志著心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生[13]。本實驗的結(jié)果表明，AngⅡ處理后的心肌細(xì)胞的體積升高，細(xì)胞內(nèi)的肥大基因ANP轉(zhuǎn)錄水平也升高，細(xì)胞內(nèi)總蛋白合成增多，說明AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而下調(diào)KLF5后可以降低心肌細(xì)胞的體積，減少細(xì)胞內(nèi)ANP的轉(zhuǎn)錄，減少心肌細(xì)胞內(nèi)的蛋白含量，說明下調(diào)KLF5可以在體外抑制AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

心肌肥大的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度有關(guān)，AngⅡ可以通過影響動作電位，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)CaN的活化，誘導(dǎo)肥大基因過度表達(dá)[14,15]。CaN是目前發(fā)現(xiàn)的與Ca2+有關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其活化后可通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子的活化，最終影響肥大基因的轉(zhuǎn)錄[16,17]。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中的Ca2+濃度升高，并且CaN蛋白水平也升高，而下調(diào)KLF5可以減弱AngⅡ?qū)a2+濃度的作用，提示下調(diào)KLF5可以通過降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，減少CaN的表達(dá)，發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

研究顯示，心肌細(xì)胞氧化損傷是心肌肥大發(fā)生的重要原因，心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧異常增多在心肌細(xì)胞肥大中扮演著至關(guān)重要的作用[18]。研究顯示，AngⅡ可以增加心肌肥厚過程中MDA的水平，降低SOD的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的LDH外漏，對細(xì)胞造成氧化損傷[19]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物之一，細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡狀態(tài)被打破以后，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，使細(xì)胞內(nèi)的LDH泄漏到細(xì)胞外，檢測MDA、LDH、SOD水平可反映細(xì)胞氧化損傷程度[20-22]。本實驗結(jié)果表明，AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中MDA生成增多，細(xì)胞內(nèi)SOD活性下降，而細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平下降，說明AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，而下調(diào)KLF5后的心肌細(xì)胞MDA生成量減小，SOD活性升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平下降，提示下調(diào)KLF5可以減弱AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷。

KLF5參與心肌肥厚的發(fā)生，在AngⅡ作用后的心肌細(xì)胞中表達(dá)異常上調(diào)。在體外抑制KLF5后，心肌細(xì)胞經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)后，心肌細(xì)胞肥大程度降低，而KLF5的作用機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、CaN蛋白和氧化損傷有關(guān)，其具體的作用機(jī)制還需要在以后的研究中進(jìn)行探討和驗證。