酶解蝦皮用于料酒生產(chǎn)的研究

劉姍，楊柳*，何述棟，孫漢巨，姚升飛，徐尚英

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，合肥 230009；2.安徽海神黃酒集團(tuán)有限公司，安徽 廬江 231561)

烹飪黃酒(即料酒)以粳米為主要原料，經(jīng)過(guò)麥曲、酒曲中多種微生物的糖化、發(fā)酵釀制而成。料酒中所含的氨基酸態(tài)氮能使烹飪的菜肴口味更鮮美，適量的乙醇能使肉類中有腥膻味道的蛋白和胺類揮發(fā)掉且不破壞肉的蛋白和酯類，酯類物質(zhì)能增加菜肴的香味[1]。料酒中氨基酸態(tài)氮含量與其鮮味之間相關(guān)[2]。近年來(lái)，為適應(yīng)各種烹調(diào)要求，蔥姜料酒、葛根料酒和五香料酒等諸多類型的調(diào)味料酒被相繼開發(fā)出來(lái)[3-5]。隨著消費(fèi)者認(rèn)知的日益理性，安全、健康的釀造料酒新產(chǎn)品勢(shì)必受到消費(fèi)者的青睞。

蝦皮主要是以毛蝦為主，經(jīng)過(guò)蒸煮、晾曬、烘干等工序加工而成的一種食用干制品。蝦皮中蛋白含量可高達(dá)40%，還富含鈣、鉀、碘、鎂、磷等礦物質(zhì)及有“超級(jí)維生素E”美譽(yù)的蝦青素[6-8]。蝦皮氨基酸中谷氨酸含量最高，賦予了蝦皮濃郁的鮮香味[9]。目前市場(chǎng)上的蝦味調(diào)味品主要是蝦醬、蝦粉等[10]，關(guān)于蝦皮料酒的研究很少。蝦皮溶解度低，不宜直接添加至料酒中。本研究通過(guò)對(duì)蝦皮進(jìn)行酶解，將蝦皮酶解液作為輔料用于料酒發(fā)酵生產(chǎn)，開發(fā)出一款蝦皮料酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦皮：家樂(lè)福超市；甲醛、NaOH、無(wú)水乙醇、亞鐵氰化鉀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水合茚三酮(99.9%)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；釀酒曲(紹興風(fēng)味)和安琪釀酒高活性干酵母(黃酒專用)：安琪酵母股份有限公司；堿性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶(1×105U/g)：南寧東恒華道生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；752N型分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；S-4330D氨基酸分析儀 德國(guó)Sykam(賽卡姆)公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝦皮酶解工藝優(yōu)化

蝦皮→烘干→粉碎→酶解→滅酶→離心(5000 r/min,10 min)→蝦皮酶解液。

單因素試驗(yàn)：分別考察蛋白酶種類(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶)、酶添加量(0，200，400，800，1000 U/g，以每1 g蝦皮干重計(jì))、酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)、pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、酶解時(shí)間(1，1.5，2，2.5 h)和料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20 (g/mL)]對(duì)蝦皮酶解效果的影響，以其中一個(gè)因素為單因素變量，其他條件一定的前提下，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶添加量、酶解時(shí)間和料液比為研究對(duì)象，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，用L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)研究不同條件下的蝦皮酶解效果。

1.3.2 料酒制備

取一定量的粳米，加入同等質(zhì)量自來(lái)水(水質(zhì)要求符合GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》)，25 ℃浸泡48 h，瀝去水，取60 g浸泡后粳米(干重約40.0 g)分裝于250 mL三角瓶中，加入40 mL自來(lái)水，包扎封口后，置于滅菌鍋中，在0.05 MPa下保溫15 min進(jìn)行蒸飯。向冷卻至28 ℃左右的米飯中加入0.08 g釀酒曲、0.08 g釀酒高活性干酵母和40 mL無(wú)菌水混合并攪拌均勻。在28 ℃下保溫培養(yǎng)，每隔4 h攪拌1次，培養(yǎng)5天后在18 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)14天，得到成熟料酒發(fā)酵醪，將醪液離心，上清液即為料酒原酒液。

1.3.3 蝦皮酶解液添加時(shí)間對(duì)料酒發(fā)酵的影響

在料酒發(fā)酵過(guò)程中，向米醪中添加蝦皮酶解液，添加量為2.0%，添加時(shí)間分別為0，24，48，72，96 h，待料酒發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定料酒原酒液中的總糖含量、酒精度、氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.4 蝦皮酶解液添加量對(duì)料酒發(fā)酵的影響

將蝦皮酶解液添加到米醪中，添加量分別為0，1.0%，2.0%，4.0% (酶解前蝦皮干重占總物料干重的百分?jǐn)?shù))，待發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定料酒原酒液中的總糖含量、酒精度、氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.5 添加蝦皮酶解液對(duì)料酒中游離氨基酸的影響

將蝦皮酶解液以2.0%的添加量添加到米醪中進(jìn)行料酒發(fā)酵，待發(fā)酵結(jié)束后，利用S-4330D氨基酸分析儀測(cè)定料酒原酒液中游離氨基酸的種類和含量。

1.4 感官評(píng)價(jià)

請(qǐng)10名食品專業(yè)人員作評(píng)定員，彼此獨(dú)立對(duì)蝦皮料酒樣品進(jìn)行感官評(píng)定，互不影響，以保證結(jié)果準(zhǔn)確。對(duì)蝦皮料酒的感官評(píng)定，主要針對(duì)色澤、香氣、口味和風(fēng)格4個(gè)方面。每個(gè)屬性的評(píng)定均采用5分制，每個(gè)屬性的質(zhì)量等級(jí)如下：優(yōu)(4～5)、良好(3～4)、中(2～3)、差(1～2)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算，得出產(chǎn)品的總體感官質(zhì)量等級(jí)。

1.5 分析方法

1.5.1 酒精度的測(cè)定

蒸餾法[11]。

1.5.2 總糖含量的測(cè)定

亞鐵氰化鉀滴定法。

1.5.3 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

酶解液或發(fā)酵醪經(jīng)離心(5000 r/min，10 min)，上清液中氨基酸態(tài)氮含量參照GB/T 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[12]。

料酒中游離氨基酸的測(cè)定參照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》[13]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，應(yīng)用Excel軟件作圖，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用單因素方差分析中的Duncan法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦皮酶解條件的研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)

根據(jù)相關(guān)蝦皮酶解文獻(xiàn)的報(bào)道[14]，選取對(duì)蝦皮酶解影響顯著的幾個(gè)主要因素如蛋白酶種類、酶添加量、酶解時(shí)間、pH值、溫度和料液比等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為測(cè)定指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白酶種類、中性蛋白酶添加量、初始溶液pH、酶解時(shí)間、酶解溫度和料液比對(duì)蝦皮酶解的影響

注：圖1(a)中1為對(duì)照組；2為木瓜蛋白酶；3為中性蛋白酶；4為堿性蛋白酶。

由圖中1中(a)可知，中性蛋白酶對(duì)蝦皮的酶解效果最好。因?yàn)槲r皮獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，用中性蛋白酶破壞其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)從而使細(xì)胞內(nèi)的呈味核苷酸和氨基酸等風(fēng)味成分得到釋放。由圖1(b)可知，氨基酸態(tài)氮含量隨著中性蛋白酶添加量的增加而增大，當(dāng)添加量大于800 U/g(蝦皮干重)時(shí)氨基酸態(tài)氮含量增加不明顯。由圖1(c)和圖1(e)可知，初始溶液pH和酶解溫度在中性蛋白酶最適酶解條件下效果最佳，分別為pH 7.0，50 ℃。由圖1(d)可知，酶解時(shí)間為2 h時(shí)氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最大值0.930 g/L。由圖1(f)可知，隨著料液比的增加，氨基酸態(tài)氮的含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)氨基酸態(tài)氮的含量達(dá)到最大值0.932 g/L，因?yàn)殡S著料液比的增加，對(duì)酶的稀釋度越來(lái)越大，酶的實(shí)際作用效果降低。

表1 蝦皮酶解顯著性分析結(jié)果Table 1 Significance analysis results of dried shrimp enzymolysis

注：顯著性差異用“*”表示；置信水平為0.95。

對(duì)影響蝦皮酶解的5個(gè)因素做顯著性分析，由表1可知，中性蛋白酶添加量、酶解時(shí)間、料液比對(duì)蝦皮酶解影響顯著，酶解溫度和pH影響不顯著。因?yàn)閜H值和酶解溫度均在中性蛋白酶最適范圍內(nèi)效果最佳，屬于酶的特征參數(shù)，較為確定。

2.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上選取對(duì)蝦皮酶解影響顯著的3個(gè)因素：酶添加量(400，800，1000 U/g)、酶解時(shí)間(1.5，2，2.5 h)、料液比(1∶5，1∶10，1∶15)作為正交試驗(yàn)的因素，每個(gè)因素分別取3個(gè)水平。試驗(yàn)以氨基酸態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

（1）政策文件方面：黨和國(guó)家領(lǐng)導(dǎo)人高度重視質(zhì)量信用建設(shè)工作，多次在重要場(chǎng)合、重要會(huì)議上強(qiáng)調(diào)，要堅(jiān)持以質(zhì)量第一為價(jià)值導(dǎo)向、牢固樹立質(zhì)量第一的強(qiáng)烈意識(shí)，并相繼出臺(tái)了多項(xiàng)政策性文件指導(dǎo)質(zhì)量誠(chéng)信體系建設(shè)，包括《征信業(yè)管理?xiàng)l例》《中共中央 國(guó)務(wù)院關(guān)于開展質(zhì)量提升行動(dòng)的指導(dǎo)意見(jiàn)》《質(zhì)量發(fā)展綱要（2011-2020年）》《社會(huì)信用體系建設(shè)規(guī)劃綱要（2014-2020年）》以及《企業(yè)質(zhì)量信用評(píng)價(jià)工作方案》等。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

由表2可知，在影響中性蛋白酶酶解蝦皮的諸多因素中，各因素作用的主次順序?yàn)锽>A>C，即料液比的影響最大，酶添加量次之，酶解時(shí)間的影響最小，誤差的影響則更小，可以忽略；最優(yōu)酶解提取條件組合為A2B2C2。取最優(yōu)條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，氨基酸態(tài)氮含量為0.935 g/L，且所得酶解物鮮味濃郁。因此確定蝦皮的最佳酶解條件為中性蛋白酶添加量800 U/g(蝦皮干重)、料液比1∶10 (g/mL)、50 ℃、pH 7.0條件下酶解2 h。

2.2 蝦皮酶解液的添加時(shí)間對(duì)料酒發(fā)酵的影響

將蝦皮酶解液以2.0%添加量，添加到米醪中進(jìn)行發(fā)酵，研究在不同發(fā)酵時(shí)間添加對(duì)料酒酒精度和氨基酸態(tài)氮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蝦皮酶解液的添加時(shí)間對(duì)料酒發(fā)酵的影響Table 3 Effects of dried shrimp hydrolysate addition time on cooking wine fermentation

注：n=3, P<0.05。

由表3可知，在發(fā)酵72 h時(shí)添加蝦皮酶解液，料酒發(fā)酵效果最佳，料酒中酒精度、總糖和氨基酸態(tài)氮的含量符合QB/T 2745-2005《烹飪黃酒》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且其中氨基酸態(tài)氮已達(dá)到優(yōu)級(jí)烹飪黃酒要求(不低于0.4 g/L)。在發(fā)酵0，24，48 h時(shí)向米醪中添加蝦皮酶解液，其中大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被發(fā)酵醪中霉菌、酵母菌等微生物生長(zhǎng)繁殖所消耗，致使發(fā)酵前期酒精度上升過(guò)快，抑制了具有糖化作用的霉菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)酶，從而不利于發(fā)酵后期酒精度的積累，也使得氨基酸態(tài)氮含量較低[15]；在發(fā)酵96 h時(shí)添加，發(fā)酵已接近尾聲，添加蝦皮酶解液，達(dá)不到共發(fā)酵的作用，造成料酒中殘余較多的氨基酸態(tài)氮和糖，同時(shí)酒精度也較低，不利于料酒后發(fā)酵的貯藏。因此，確定蝦皮酶解液的添加時(shí)間為72 h。

2.3 蝦皮酶解液的添加量對(duì)料酒發(fā)酵的影響

將蝦皮酶解液添加到米醪中，研究不同添加量對(duì)料酒發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 蝦皮酶解液的添加量對(duì)料酒發(fā)酵的影響Table 4 Effects of dried shrimp hydrolysate content on cooking wine fermentation

注：n=3, P<0.05。

由表4可知，蝦皮酶解液的添加量對(duì)料酒氨基酸態(tài)氮和總糖含量影響顯著，且酒精度和氨基酸態(tài)氮含量與酶解液的添加量成正相關(guān)。酶解液添加量為2.0%時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量為(0.463±0.019) g/L，較對(duì)照增加了237.96%，因?yàn)槲r皮酶解液中含有大量的含氮類物質(zhì)，致使料酒中氨基酸態(tài)氮含量較高，同時(shí)也為酵母生長(zhǎng)提供了營(yíng)養(yǎng)，以至于提高料酒的酒精度，降低醪液中的總糖含量。而且制備的料酒中氨基酸態(tài)氮的含量符合QB/T 2745-2005優(yōu)級(jí)烹飪黃酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。因此，選擇蝦皮酶解液的添加量為2.0%。

2.4 添加蝦皮酶解液對(duì)料酒中游離氨基酸的影響

氨基酸不僅是料酒中主要的營(yíng)養(yǎng)成分，還是料酒的主要呈味物質(zhì)，它的種類和含量與料酒的風(fēng)味及感官品質(zhì)有著密不可分的聯(lián)系。探究了添加蝦皮酶解液對(duì)料酒中游離氨基酸種類和含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 添加蝦皮酶解液對(duì)料酒中氨基酸組成的影響Table 5 Effects of dried shrimp hydrolysate on amino acidcomposition in cooking wine g/L

注：ND表示未檢測(cè)到。

根據(jù)不同種氨基酸對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)可將氨基酸分為4類[16]：甜味氨基酸(絲氨酸Ser、丙氨酸Ala、蘇氨酸Thr、甘氨酸Gly、半胱氨酸Cys、蛋氨酸Met)、鮮味氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)、苦味氨基酸(精氨酸Arg、組氨酸His、纈氨酸Val、苯丙氨酸Phe、異亮氨酸Lle、亮氨酸Leu、賴氨酸Lys)、澀味氨基酸(酪氨酸Tyr)。

料酒中自身含有多種氨基酸。其中不乏一些人體必需的氨基酸，例如甲硫氨酸、纈氨酸和亮氨酸等。由表5可知，添加蝦皮酶解物有利于增加料酒中呈味氨基酸的種類和含量。從氨基酸的種類來(lái)看，增加了半胱氨酸；從氨基酸的含量來(lái)看，游離氨基酸總量為4.345 g/L，較對(duì)照增加了517.19%。其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等多種氨基酸的含量增加明顯，甜味和鮮味氨基酸含量之和與苦味和澀味氨基酸含量之和的比值相較于對(duì)照增加了101.18%，使得制備的料酒風(fēng)味更加鮮美，既有料酒本身的酒香，又具有蝦皮的鮮香，兩者相得益彰。說(shuō)明添加蝦皮酶解液進(jìn)行料酒發(fā)酵可以增加料酒中氨基酸的含量并改善料酒的風(fēng)味。

2.5 產(chǎn)品感官指標(biāo)

2.5.1 外觀

橙黃色，清亮透明，有光澤，瓶底有微量聚集物。

2.5.2 香氣

具有黃酒特有的濃郁醇香和蝦皮的鮮香，無(wú)異香。

2.5.3 口味

醇和，鮮美，無(wú)異味。

2.5.4 風(fēng)格

酒體協(xié)調(diào)，具有烹飪黃酒的典型風(fēng)格。

3 結(jié)論

本文開發(fā)了一款新型調(diào)味料酒，在料酒發(fā)酵過(guò)程中添加蝦皮酶解液，制備得到的料酒中氨基酸態(tài)氮含量較高且游離氨基酸種類和含量豐富。蝦皮中含有大量的蛋白質(zhì)和多種氨基酸，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了蝦皮的最佳酶解條件，蝦皮在中性蛋白酶添加量800 U/g(蝦皮干重)、料液比1∶10 g/mL、50 ℃、pH 7.0條件下酶解2 h效果最佳，蝦皮酶解液中氨基酸態(tài)氮含量最高。傳統(tǒng)方法制備的料酒中氨基酸態(tài)氮主要來(lái)源于原料粳米中蛋白質(zhì)分解和酵母等微生物的自溶。將蝦皮酶解液以輔料的形式添加到米醪中，增加了發(fā)酵環(huán)境中的氨基酸態(tài)氮含量，使得制備的料酒中氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸含量大幅提高。蝦皮酶解液中含有蝦青素和多肽類物質(zhì)，料酒的抗氧化能力還有待進(jìn)一步研究。