超高壓提取玫瑰花色苷及穩(wěn)定性研究

張唯，嚴成*，張曦，金葉青，段旻燕，吳映川

(1.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽 621010；2.麗江程海沁香玫瑰莊園有限公司，云南 麗江 674100；3.麗江永勝森源食品有限公司，云南 麗江 674200)

玫瑰(RosarugosaThunb)，是薔薇科薔薇屬植物，是重要的香料植物[1]。我國的玫瑰資源大部分利用于天然香料玫瑰精油的提取上，然而玫瑰花中的花青素、多糖、黃酮類等物質(zhì)是值得去探索研究的[2-8]。花色苷是廣泛存在于植物中的一種活性成分，是一種功能性著色劑，具有改善視覺、抗肥胖癥、抗糖尿病、抗癌癥、抗心血管疾病等生理功效[9-13]。玫瑰花色苷顏色艷麗、香氣馥郁，且含有生理功效，玫瑰花色苷的綜合開發(fā)利用具有廣闊的應(yīng)用價值。

常用的花色苷提取方法包括有機溶劑提取法[14-16]、酶提取法[17,18]、微波輔助提取法[19,20]、超聲波輔助提取法[21,22]、高壓脈沖電場法等[23,24]。超高壓輔助提取法[25]，因其有效成分提取率高，且保留其生理活性，降低能耗，工藝操作簡單且安全等特點[26]，廣泛應(yīng)用于中藥材的提取。

本試驗采用超高壓法提取玫瑰花色苷，以檸檬酸濃度、壓力、保壓時間、料液比為主要因素，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝；同時探討了各因素對玫瑰花色苷的穩(wěn)定性影響，旨在為玫瑰花色苷的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

法國墨紅玫瑰：麗江程海沁香玫瑰莊園有限公司；檸檬酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫、氯化鉀、硝酸鋁、亞硫酸鈉：均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 鞏義市瑞力儀器設(shè)備有限公司；高速粉碎機 陜西盛安醫(yī)療器械有限公司；UV1901型紫外可見分光光度計 四川億科實驗設(shè)備有限公司；便攜式pH計 上海平軒科學(xué)儀器有限公司；臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-2恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；HPP.L2-800/1型食品超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司；DZ-280/2SD小型多功能真空封裝機 溫州卓越機電源頭廠家。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰花預(yù)處理

玫瑰花經(jīng)挑選除雜，粉碎過80目篩，得玫瑰花干粉。

1.3.2 玫瑰花色苷提取工藝流程

玫瑰花粉→稱重(1.00 g)→提取劑溶解→超高壓提取→離心→取上清液→稀釋→測定吸光值。

1.3.3 玫瑰花色苷含量的測定

采用消光系數(shù)法測定玫瑰花色苷含量[27]。將離心得到的花色苷粗提液，在紫外分光光度計300～700 nm范圍內(nèi)掃描，確定玫瑰花色苷的最大吸收波長。根據(jù)下列計算玫瑰花色苷提取量：

花色苷提取量(mg/100 g)=[(A×V)/(98.2×M)]×100。

式中：A為吸光值；V為定容體積(mL)×稀釋倍數(shù)；M為樣品重量(g)；98.2為花色苷平均消光系數(shù)。

1.3.4 單因素試驗

分別以不同的提取劑濃度、壓力、保壓時間和料液比為單因素，以玫瑰花色苷提取量為指標，考察各因素對玫瑰花色苷提取量的影響。

1.3.4.1 提取劑濃度對花色苷提取量的影響

在壓力為200 MPa、保壓時間為9 min、料液比為1∶25(g/mL)的條件下，檸檬酸濃度分別為0.5%，1%，5%，10%，15%，20%時，考察提取劑濃度對花色苷提取量的影響。

1.3.4.2 壓力對花色苷提取量的影響

在檸檬酸濃度為5%、保壓時間為9 min、液料比為1∶25(g/mL)的條件下，壓力分別為50，100，200，300，400，500 MPa時，考察壓力對花色苷提取量的影響。

1.3.4.3 保壓時間對花色苷提取量的影響

在檸檬酸濃度為5%、壓力為200 MPa、料液比為1∶25(g/mL)的條件下，保壓時間分別為3，6，9，12，15，18 min時，考察保壓時間對花色苷提取量的影響。

1.3.4.4 料液比對花色苷提取量的影響

在檸檬酸濃度為5%、壓力為200 MPa、保壓時間為9 min時，料液比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g/mL)時，考察料液比對花色苷提取量的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，建立Box-Behnken 中心組合試驗，見表 1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Response surface experimental design

1.3.6 玫瑰花色苷穩(wěn)定性試驗

1.3.6.1 pH對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

將提取液稀釋適宜倍數(shù)后，加入鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液制成pH 1.0～8.0的花色苷溶液，待溶液顏色穩(wěn)定后，測定其吸光值。

1.3.6.2 溫度對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

將稀釋相同倍數(shù)的花色苷溶液，分別置于20，40，60，80，100 ℃水浴鍋中，每隔1 h測定其吸光值。

1.3.6.3 常見金屬離子對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

配制離子濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L的Na+，K+，Ca2+，Cu2+，Zn2+，F(xiàn)e2+，Mg2+，Al3+，F(xiàn)e3+的花色苷溶液，室內(nèi)避光靜置，每隔1 h測定其吸光值。

1.3.6.4 氧化劑和還原劑對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

分別配制質(zhì)量分數(shù)為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的亞硫酸鈉的花色苷溶液和體積分數(shù)為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1%的過氧化氫的花色苷溶液，以不加亞硫酸鈉和過氧化氫的花色苷溶液做對照，室溫避光靜置，每隔1 h測定其吸光值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用軟件Origin 8.5和Design-Expert 8.0.6.1進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰花色苷的最大吸收波長

圖1 玫瑰花色苷溶液最大吸收光譜圖Fig.1 The maximum absorption spectrum of rose anthocyanins solution

玫瑰花色苷提取液在300～700 nm的吸收光譜圖見圖1，在514 nm波長處有最大吸收峰。因此，選用 514 nm為玫瑰花色苷的最大吸收波長。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取劑濃度對玫瑰花色苷提取量的影響

圖2 檸檬酸濃度對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on anthocyanins extraction

由圖2可知，在提取過程中檸檬酸濃度對花色苷提取量影響較大，隨著檸檬酸濃度的增大花色苷提取量呈現(xiàn)先增加后緩慢降低的趨勢。檸檬酸濃度達到10%時，花色苷pH值為1.58，提取量達到最高值，為943.24 mg/100 g。當檸檬酸濃度大于10%后，提取量降低。故選擇10%檸檬酸溶液的濃度為最佳提取溶劑。

2.2.2 超高壓壓力對玫瑰花色苷提取量的影響

圖3 壓力對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of pressure on anthocyanins extraction

由圖3可知，在提取過程中花色苷提取量呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢。超高壓壓力在300 MPa時提取量最高，達到856.78 mg/100 g。當壓力大于300 MPa后，提取量降低，這是因為在壓力為300 MPa時，花色苷已經(jīng)基本達到了溶解平衡狀態(tài)，再提升壓力，可能會使其他雜質(zhì)釋放出來。故選擇壓力300 MPa時為最佳提取壓力。

2.2.3 保壓時間對玫瑰花色苷提取量的影響

圖4 保壓時間對花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of dwell time on anthocyanins extraction

由圖4可知，花色苷提取量隨著時間的延長呈現(xiàn)出先增加后緩慢下降的變化趨勢。在保壓時間為9 min時提取量達到最高，為803.86 mg/100 g。再增加保壓時間，花色苷提取量開始緩慢下降，表明在9 min時花色苷已基本達到溶出的平衡狀態(tài)，而時間延長會增加能耗和使花色苷產(chǎn)生降解。故選擇的最佳保壓時間為9 min。

2.2.4 料液比對玫瑰花色苷提取量的影響

圖5 料液比對花色苷提取量的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on anthocyanins extraction

由圖5可知，花色苷提取量隨料液比的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的明顯變化趨勢。在料液比為1∶25(g/mL)時，花色苷提取量達到最高值945.14 mg/100 g，若繼續(xù)增大料液比，花色苷提取量反而降低。從提取效果和溶劑成本的角度綜合考慮，選用1∶25(g/mL)為最佳料液比。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表 2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

續(xù) 表

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到超高壓提取條件與玫瑰花色苷提取量間的多項式回歸方程：

Y=871.25+112.55A+8.61B-37.11C+17.37D-45.96AB-18.41AC+3.97AD-53.94BC+92.89BD+11.25CD-70.33A2+1.73B2+44.08C2-44.57D2。

對回歸方程進行了顯著性檢驗分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Regression equation analysis of variance

續(xù) 表

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01)；“*”表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，花色苷提取率試驗設(shè)計該模型整體呈極顯著(P<0.0001)，能夠正確反映玫瑰花色苷提取量(Y)與檸檬酸濃度(A)、壓力(B)、保壓時間(C)及料液比(D)之間的關(guān)系；失擬項不顯著(P=0.4008>0.05)；一次項A，C，D和二次項A2，C2，D2對響應(yīng)值的影響均極顯著(P<0.01)，交互項AB，AC，BC，BD極顯著(P<0.01)。該試驗?zāi)Ｐ蚏2=0.9952，RAdj2=0.9905，表明此模型可以解釋99.05%響應(yīng)值Y的真實變化，試驗誤差小，表明模型的選擇是合理的。各單因素對響應(yīng)值Y的影響大小順序為A>C>D>B。

2.3.2 兩因素間的交互作用分析

由表3 可知，AB，AC，BC和BD的交互作用呈極顯著，其響應(yīng)曲面圖見圖6。由圖6中2個參數(shù)響應(yīng)面的陡峭曲面程度可知，在固定檸檬酸濃度和保壓時間在零水平時，料液比和壓力交互作用最顯著(圖6中a)，其次依次是壓力和保壓時間(圖6中b)、壓力和檸檬酸濃度(圖6中c)、保壓時間和檸檬酸濃度(圖6中d)。

圖6 兩因素交互作用對花色苷提取量的影響Fig.6 Response surface plots of variable parameters on anthocyanins extraction

2.3.3 最佳工藝條件

對試驗結(jié)果進行工藝優(yōu)化，得到最佳試驗條件為：檸檬酸濃度13.2%，提取壓力400 MPa，保壓時間6 min，料液比為1∶25(g/mL)；在此條件下進行驗證，花色苷提取量為1089.42 mg/100 g，與預(yù)測值相近，說明用Box-Behnken響應(yīng)面法能較好地反映超高壓條件下玫瑰花色苷的提取量。

2.4 玫瑰花色苷穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.4.1 pH對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

圖7 pH對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of rose anthocyanins

由圖7可知，在玫瑰花色苷溶液pH值為1～8的條件下，為pH值在1～3范圍時，吸光值變化不明顯，當pH值為4時，吸光值開始呈現(xiàn)下降趨勢，在pH值達到5以后，吸光值開始顯著下降。玫瑰花色苷在pH值為1～3的條件下穩(wěn)定性較好，更適合花色苷的加工與儲藏。

2.4.2 溫度對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

圖8 溫度對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on the stability of rose anthocyanins

由圖8可知，玫瑰花色苷在20～60 ℃范圍時，在溫度升高和時間延長的同時，花色苷溶液的顏色和吸光值沒有顯著的變化，從 80 ℃開始，吸光值變化較為明顯，溶液顏色變成淺粉色，到了100 ℃時變化則更加大，溶液幾乎變成無色。因此玫瑰花色苷不宜在高溫的環(huán)境下保存和使用，而在60 ℃內(nèi)熱穩(wěn)定性良好。

2.4.3 常見金屬離子對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

圖9 金屬離子對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of mental ions on the stability of rose anthocyanins

由圖9可知，Na+，K+對花色苷無顯著變化，隨著離子濃度的增加與時間的延長吸光值略有增加，溶液顏色變成淺紅色，Al3+，Ca2+，Cu2+對花色苷有顯著增色效應(yīng)，吸光值明顯增加，顏色變?yōu)轷r艷的玫瑰紅色。Zn2+的吸光值與溶液顏色幾乎無變化，Mg2+和Fe3+能夠破壞花色苷的結(jié)構(gòu)，使其降解，而含有Fe3+的溶液顏色變?yōu)榘稻G色。因此，應(yīng)避免花色苷與Mg2+和Fe3+的接觸。

2.4.4 氧化劑和還原劑對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

(a)不同濃度過氧化氫對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響

(b)不同濃度亞硫酸鈉對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響圖10 氧化劑和還原劑對玫瑰花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effects of oxidant and reducing agent on the stability of rose anthocyanins

由圖10可知，H2O2和Na2SO3對花色苷的穩(wěn)定性影響極大。加入Na2SO3溶液的吸光度急劇下降，顏色馬上變?yōu)闊o色，加入H2O2溶液的破壞速度相對要遲緩，但加入H2O2濃度較高的溶液4 h后也變?yōu)闊o色。因此，玫瑰花色苷在生產(chǎn)加工和貯藏的過程中應(yīng)避免與氧化劑和還原劑的接觸。

3 結(jié)論

本文用響應(yīng)面法對玫瑰花色苷的超高壓提取條件進行優(yōu)化，并且研究了玫瑰花色苷的穩(wěn)定性。優(yōu)化得到花色苷的最佳提取工藝參數(shù)為：檸檬酸濃度13.2%，壓力400 MPa，保壓時間6 min，液料比1∶25(g/mL)，此條件下玫瑰花色苷提取量為1089.42 mg/100 g，與常用花色苷提取方法相比，提高了69.52%。穩(wěn)定性研究的結(jié)果表明：玫瑰花色苷在pH為1～3的條件下比較穩(wěn)定，60 ℃內(nèi)的穩(wěn)定性良好；氧化劑和還原劑會顯著加快花色苷的降解，Zn2+，Na+，K+對花色苷無顯著變化，Mg2+，F(xiàn)e3+能夠破壞花色苷的結(jié)構(gòu)，使其降解，Al3+，Ca2+，Cu2+對花色苷有顯著增色效應(yīng)。因此，對玫瑰花色苷的開發(fā)利用，研制出高附加值產(chǎn)品，將會帶動玫瑰產(chǎn)業(yè)的快速可持續(xù)發(fā)展。