超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定辣條中的5種罌粟堿

花露,葉平,陸杰,黃銀波,馬紅,王愛霞

(泰州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 泰州 225300)

調(diào)味面制品俗稱“辣條”，近年來受到大家的熱烈追捧，網(wǎng)絡(luò)上甚至出現(xiàn) “吃根辣條壓壓驚”的流行語。青少年兒童特別是中小學(xué)生是主要消費(fèi)群體[1]。近期有關(guān)火鍋底料、調(diào)味料中檢出罌粟堿的新聞報(bào)道層出不窮。周圍不少家長(zhǎng)反映孩子特別喜歡吃辣條，吃了還要吃，不免讓人擔(dān)心不法商家為了達(dá)到讓顧客上癮的目的，向其中添加違禁品罌粟殼。罌粟殼為植物罌粟干燥成熟的果殼，主要成分為罌粟堿、那可丁、嗎啡、蒂巴因、可待因，具有斂肺、澀腸、止痛的功效[2]。但若經(jīng)常大量食用含罌粟堿的食品可能會(huì)造成人體消化系統(tǒng)、精神系統(tǒng)的損傷，危害消費(fèi)者的身體健康。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局、衛(wèi)生部以及公安部的相關(guān)法規(guī)都明令禁止在食品中非法添加罌粟殼。

目前測(cè)定罌粟堿的方法尚無國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)報(bào)道的檢測(cè)方法主要有薄層色譜分析法[3,4]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[5,6]、示波極譜法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9,10]、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[11-19]。辣條屬于調(diào)味面制品，其中添加了各種調(diào)味料、防腐劑、色素等，成分復(fù)雜，對(duì)微量生物堿的準(zhǔn)確測(cè)定有很大干擾，但是辣條中罌粟堿的檢測(cè)還暫未有人報(bào)道，因此建立辣條中罌粟堿的測(cè)定方法十分有必要。因此，本研究建立了辣條中5種罌粟堿(嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析檢測(cè)方法，供相關(guān)監(jiān)管部門進(jìn)行參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(UPLC-Quattro Premier XE)、色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) 美國(guó)Waters公司；離心機(jī) 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司；超聲器 Elmasonic S100H公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；固相萃取柱MCX(150 mg/6 mL) 上海安譜公司。

罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：來自上海安譜公司。

實(shí)驗(yàn)室超純水：由Milli-Q純水設(shè)備制備；甲醇、乙腈、正己烷、HPLC級(jí)試劑，Dikma公司；乙酸、乙酸銨：HPLC級(jí)試劑，上海安譜公司；氨水、鹽酸：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)樣品：從泰州市蘇果、大潤(rùn)發(fā)等5家超市、5家農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及郊區(qū)中小學(xué)周邊的商店隨機(jī)購買辣條樣品共計(jì)30份，標(biāo)簽標(biāo)示中不含有罌粟殼生物堿。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A為10 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 5.5)，B為0.1%乙酸乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫表

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：正離子模式(ESI+);離子化方式：電噴霧電離；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：500 L/h;錐孔反吹氣流量：50 L/h，質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取

稱取2 g(精確至0.01 g)均質(zhì)樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸，振搖混勻，超聲提取10 min，然后于離心機(jī)5000 r/min離心5 min，將上清液收集于另一50 mL具塞離心管中，再加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸重復(fù)上述步驟，合并2次上清液，加入10 mL正己烷渦旋30 s，然后于5000 r/min離心5 min，棄去正己烷層待凈化。

1.3.2 凈化

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化固相萃取柱，將提取液以2～3 mL/min的速度載入已活化好的MCX小柱，用5 mL水和50%(V/V)甲醇淋洗，棄去全部流出液，減壓抽干5 min以上。然后用8 mL 5%(V/V)氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，氮?dú)獯蹈珊鬁?zhǔn)確加入甲醇溶解并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

以0.1%乙酸水-乙腈為流動(dòng)相，考察了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)3種不同的高效液相色譜柱對(duì)各組分分離效果的影響。結(jié)果表明：在ACQUITY UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱上得到的分離效果和峰形較好。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

以HSS T3為色譜柱，以0.1%乙酸水為流動(dòng)相A，考察了乙腈和0.1%乙酸乙腈作為流動(dòng)相B對(duì)色譜行為的影響，見圖1和圖2。

圖1 0.1%乙酸水-乙腈總離子流圖

圖2 0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈總離子流圖

對(duì)比發(fā)現(xiàn)圖2中嗎啡和可待因的峰形得到明顯改善，因此以0.1%乙酸乙腈作為流動(dòng)相B 。結(jié)合文獻(xiàn)[12,13]，乙酸銨可以作為流動(dòng)相之一，我們通過改變乙酸銨的酸堿度來考察對(duì)色譜行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH 3.5,4.5,5.5時(shí)各組分的保留時(shí)間和靈敏度都有較大差別，結(jié)果見圖3～圖5。

圖3 乙酸銨pH 3.5的總離子流圖

圖4 乙酸銨pH 4.5的總離子流圖

圖5 乙酸銨pH 5.5的總離子流圖

由圖3可知，乙酸銨pH 3.5時(shí)，5種物質(zhì)未得到較好的分離，對(duì)比圖4和圖5發(fā)現(xiàn)，乙酸銨pH 5.5時(shí)，5種物質(zhì)的分離效果較好，并且嗎啡、可待因、那可丁的靈敏度都有較大提高。這可能與生物堿的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，生物堿大多是氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，具有一定的堿性，在水中難溶，只有酸化成鹽后才易溶于水，然后在堿性條件下溶于有機(jī)溶劑。因此，待測(cè)物在色譜柱上的保留程度受流動(dòng)相pH的影響較大，并且會(huì)影響到離子化效率。根據(jù)水中弱堿性化合物解離平衡方程可以得出，目標(biāo)物的離子化程度與pH值有關(guān)，其pH值必須小于其pKa值2個(gè)單位才可以保證目標(biāo)物完全離子化，而這5種目標(biāo)物的pKa范圍為6.24～8.21。因此，各化合物的色譜峰在pH值為5.5時(shí)達(dá)到較好的分離效果是符合該理論的。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取方法的選擇

辣條屬于調(diào)味面制品，其中添加了各種調(diào)味料、防腐劑、色素、動(dòng)植物油脂等，成分復(fù)雜，樣品均勻性差。由于罌粟堿、可待因、蒂巴因、那可丁為堿性有機(jī)化合物，嗎啡為兩性有機(jī)物，它們都能與酸作用形成鹽溶于水，與堿結(jié)合溶于有機(jī)試劑。所以，本實(shí)驗(yàn)考察了同一辣條基質(zhì)空白加相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，不同的提取試劑下5種目標(biāo)物的回收率情況。提取試劑分為兩組，第一組分別選取20 mL 0.1 mol/L HCl溶液、乙腈-HCl(1∶1)、乙腈-水(1∶1)為提取液；第二組選取20 mL 2.5%氨化甲醇、5%氨化甲醇、10%氨化甲醇為提取液；以同一種辣條加標(biāo)作為平行樣，以上6種試劑作為提取液。第一組試驗(yàn)中樣品經(jīng)提取液提取后，通過固相萃取柱進(jìn)行凈化，有機(jī)溶劑洗脫后濃縮上樣；第二組試驗(yàn)經(jīng)氨化甲醇提取后，通過正己烷去除油脂，直接濃縮上樣。進(jìn)樣檢測(cè)后得到的各個(gè)峰面積比見表3。

表3 不同提取液條件下峰面積比對(duì)

由表3可知，第一組使用0.1 mol/L HCl溶液提取時(shí)，各目標(biāo)物質(zhì)均有最大的響應(yīng)峰面積；第二組使用5%氨化甲醇為提取液時(shí)，各目標(biāo)物質(zhì)均有最大的響應(yīng)峰面積；而第一組和第二組進(jìn)行縱向比較，結(jié)果表明：酸性條件下5種目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)峰面積更大一些。原因可能是面制品有較強(qiáng)的吸水性，在水相中分散更加均勻，而且目標(biāo)化合物蒂巴因、罌粟堿、可待因和那可丁呈堿性，嗎啡是兩性化合物，在酸性水溶液條件下很容易形成溶于水的鹽類，提取效率較高。因此，本研究選用稀鹽酸溶液(0.1 mol/L)作為樣品的提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

罌粟堿的凈化方法主要有液液萃取法、QuEChERS法和固相萃取法。液液萃取法操作繁瑣并且消耗大量的有機(jī)溶劑，不適合高通量檢測(cè)，因此本文比較了QuEChERS法和3種不同固相萃取柱對(duì)5種生物堿的凈化效果。樣品經(jīng)5%氨化甲醇提取后，經(jīng)QuEChERS凈化后直接上樣測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)單，但基質(zhì)干擾物多，凈化效果不好，回收率低。另外，我們還考察了3種固相萃取柱富集凈化5種生物堿的效果，基于生物堿在酸性提取液中呈陽離子狀態(tài)，樣品經(jīng)稀鹽酸提取后，分別過MCX、WCX、HLB柱，分析結(jié)果見圖6。

圖6 不同固相萃取柱對(duì)5種生物堿回收率的影響

由圖6可知，提取液經(jīng)MCX柱吸附、洗脫后取得較好的回收率。因此，我們選用MCX固相柱作為SPE凈化柱。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的消除

一般采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析檢測(cè)時(shí)會(huì)有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，日常檢測(cè)可以通過添加同位素內(nèi)標(biāo)以及配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來減小基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性帶來的影響。由于同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴，不適用高通量檢測(cè)，因此我們采用配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來減小基質(zhì)效應(yīng)。我們比較了標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)響應(yīng)差別，結(jié)果表明：基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中5種生物堿的信號(hào)都有一定程度的抑制，因此配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線來進(jìn)行定量計(jì)算是十分必要的。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限

我們以空白基質(zhì)提取液來配制工作曲線，其中嗎啡和可待因濃度為5，25，50，100，250，500 μg/L，蒂巴因、罌粟堿、那可丁濃度為1，5，10，20，50，100 μg/L。以對(duì)照品的濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)，化合物的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到表4中各個(gè)生物堿的線性回歸方程，用于計(jì)算實(shí)際樣品中待測(cè)物的濃度。我們以信噪比(RSN)等于3的原則分別得到5種化合物的檢出限，由信噪比(RSN)等于10的原則分別得到5種化合物的定量限，結(jié)果見表4。

表4 5種生物堿的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和方法定量限

2.5 回收率及精密度

向2 g均質(zhì)空白辣條樣品中添加高、中、低5種生物堿的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其中嗎啡、可待因的添加濃度為2.5，12.5，50 μg/kg，蒂巴因、罌粟堿、那可丁的添加濃度為0.5，2.5，10 μg/kg，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行樣。回收率及標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表5。

表5 5種生物堿的回收率與精密度測(cè)試結(jié)果(n=6)

2.6 實(shí)際樣品分析

采用試驗(yàn)方法對(duì)市售的30份調(diào)味面制品(即辣條)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：30批次辣條樣品中未檢出5種罌粟堿成分，這說明目前辣條的生產(chǎn)廠商并無惡意添加罌粟堿的行為。但是隨著近幾年辣條成功走出國(guó)門，成為五毛零食界的奇跡，我們的監(jiān)管部門更需要加大力度對(duì)其進(jìn)行強(qiáng)有力的監(jiān)管，使得這個(gè)奇跡繼續(xù)延續(xù)下去，保持辣條產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

3 結(jié)論

本研究建立了調(diào)味面制品(俗稱“辣條”)中5種罌粟堿(嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析檢測(cè)法。采用酸溶液超聲提取，固相萃取小柱富集凈化，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。該方法檢出限在0.05～0.5 μg/kg之間，平均回收率為70.2%～103.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～8.5%。方法簡(jiǎn)便快速，精確度、準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，可滿足辣條中5種生物堿成分同時(shí)測(cè)定的要求，為辣條等調(diào)味面制品的安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。