鷹嘴豆納豆優(yōu)良發(fā)酵菌株的篩選與初步鑒定

張俊杰，郭 晨，尚益民，劉毅飛，方 彩

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450000）

納豆是盛行于日本的傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品，至今已有近2 000年的歷史[1]。其特點為表面覆有一層粘性物質(zhì)，挑起時有拉絲現(xiàn)象[2]。日本民間自制納豆的現(xiàn)象產(chǎn)生于江戶時代，如今納豆已經(jīng)成為大多數(shù)日本人生活中必不可少的食物之一[3]，也涌現(xiàn)出了一大批納豆品牌，如北海道產(chǎn)圓粒大豆納豆、本場水戶極小粒納豆、御城納豆等。

傳統(tǒng)納豆是大豆通過接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵而成。納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）最早由日本學(xué)者SAWAMURA從發(fā)酵食品納豆中發(fā)現(xiàn)并篩選出來[4]。納豆芽孢桿菌屬細(xì)菌科芽孢桿菌屬，屬于枯草芽孢桿菌的一個亞種[5]。除了大豆可用于納豆的制作外，其他豆類同樣可以用于發(fā)酵制作納豆。鷹嘴豆是世界第二大種植豆類，僅次于大豆[6]，也是世界第三大作為膳食蛋白質(zhì)來源的豆類作物[7]。鷹嘴豆含有18種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸全部具備[8]。因此，以鷹嘴豆為原料制作納豆同樣具有很高的營養(yǎng)價值。

納豆激酶（natto kinase，NK）是枯草芽孢桿菌代謝時產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶[9]，最早于1987年由日本科學(xué)家須見洋行博士發(fā)現(xiàn)并命名[10]。它是一種可以分泌到細(xì)胞外的、具有高效溶栓能力的蛋白酶，其高纖溶活性可用于預(yù)防和治療各種血栓類疾病。因此，對納豆激酶活性的測定有著重要意義。納豆激酶活性常見的測定方法有纖維蛋白平板法、纖維蛋白塊溶解時間法、四肽底物法、酶聯(lián)免疫吸附法、血清板法及Folin-酚法等[11]。纖維蛋白平板法以其特異性高、操作簡單易行等突出優(yōu)點，成為國內(nèi)外研究者最普遍使用的方法，但易受孵育時間影響，另外在測量的過程中也有一定的誤差，且平板制作和點樣的技術(shù)十分關(guān)鍵；纖維蛋白塊溶解時間法迅速、快捷，分辨率較高，但時間的判定存在主觀誤差，難于同時測定多個樣品；四肽底物法所得到的蛋白酶活性并不能完全表示其溶纖維活性[12]；酶聯(lián)免疫吸附法和血清板法應(yīng)用較少。Folin-酚法是測定枯草芽孢桿菌的蛋白酶活力經(jīng)典的方法，該法簡單易行，可以同時測多個樣品，成本低，經(jīng)實驗證明此法測得的蛋白酶活力與纖溶活力之間存在一定的相關(guān)性[13]。本研究在篩選菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)酵制作了鷹嘴豆納豆，并采用Folin-酚法測定了納豆激酶活性，旨在挑選出納豆激酶活力高且在鷹嘴豆納豆制作中有優(yōu)秀表現(xiàn)的菌株，為生產(chǎn)高納豆激酶活性的鷹嘴豆納豆提供菌種基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

土壤樣品：采集于學(xué)校周邊樹林里地表5 cm以下的土樣，用無菌袋裝好后帶回備用。

納豆樣品：市購北海道產(chǎn)圓粒大豆納豆、本場水戶極小粒納豆、北海道大粒納豆、燕京納豆和御城納豆共5種。置于4℃冰箱備用。

1.1.2 試驗試劑

胰蛋白胨、酪蛋白（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉（生化試劑）、Folin-酚試劑（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制造廠；HCl、NaCl、Na2HPO4、CuSO4·5H2O、KH2PO4、Na2CO3、MgSO4（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；L-酪氨酸（分析純）：合肥博美生物科技責(zé)任有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

酪蛋白平板培養(yǎng)基[14]：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，磷酸二氫鈉1 g，磷酸氫二鈉2 g，硫酸鎂 0.1 g，干酪素5 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DH-600A電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DMEX30生物顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；FORMA-86C超低溫冰箱：鄭州金友寧儀器有限公司；ZWY-100H搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；AE224分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；TGL-16G離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；SC-15恒溫水浴鍋，SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機：寧波新芝生物科技有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；T6紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢桿菌的分離純化

（1）土壤中芽孢桿菌的分離純化

將5.0 g土壤樣品加入到45 mL無菌生理鹽水中，煮沸10 min殺死土壤中的營養(yǎng)體細(xì)胞[15]，取上清液梯度稀釋到10-6，用涂布平板法每個梯度（10-1～10-6）涂兩塊LB平板，每塊平板涂布0.15 mL，然后37℃倒置培養(yǎng)至長出菌落。然后在菌落密度合適的平板上挑取菌落形態(tài)與枯草芽孢桿菌相似的單菌落，劃線接種到LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)，至再次長出單菌落后，進(jìn)行革蘭氏染色和顯微細(xì)胞形態(tài)觀察，然后保存于LB斜面?zhèn)溆谩?/p>

（2）納豆中芽孢桿菌的分離純化

取大約5.0 g納豆樣品加到45 mL無菌生理鹽水中，置于搖床上充分振蕩至生理鹽水變渾濁，讓納豆成分充分分散在生理鹽水中，然后靜置10 min，取上清液，用梯度稀釋法稀釋到10-7，用涂布平板法每個梯度涂兩塊酪蛋白平板，每塊平板涂布0.15 mL液體，37℃倒置培養(yǎng)。

培養(yǎng)到平板上長出明顯菌落時，在菌落密度合適的平板上挑取產(chǎn)透明圈較大的單菌落，用平板劃線法接種到LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)。用相同方法可多次純化培養(yǎng)，直到顯微觀察沒有雜菌，并挑取單菌落接種到LB斜面上，將革蘭氏染色結(jié)果為陽性的菌接種于LB斜面?zhèn)溆谩?/p>

（3）菌種的保藏

將得到的納豆芽孢桿菌接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，在無菌甘油管中將培養(yǎng)好的菌液與50%的無菌甘油以體積比1∶1充分混合后，于-80℃超低溫冰箱中保存。

（4）革蘭氏染色

參考國標(biāo)GB 4789.28—2013《食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[16]對所分離的菌株進(jìn)行染色、鏡檢。

2.教師疏于感情投入和美好的形象塑造，學(xué)生對語文教師缺乏好感，把對教師的好惡遷移到學(xué)習(xí)之中，從而對語文學(xué)科缺少興趣。

1.3.2 酪蛋白平板初篩

將菌體接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃條件下以180 r/min的轉(zhuǎn)速搖菌24 h后，在波長600 nm處測菌液的OD600nm值。根據(jù)OD600nm值加入無菌LB液體培養(yǎng)基將菌液OD600nm值調(diào)節(jié)至相同以保證接種的菌液濃度相同。分別吸取5 μL菌液于酪蛋白平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察透明圈直徑。每株菌做3個平行。對菌液在酪蛋白平板上產(chǎn)生的透明圈直徑進(jìn)行排序，分別從納豆食品樣品中選出了透明圈直徑排前3的菌株，以及從土壤樣品中選出了透明圈直徑排前10的菌株，共計13株菌用于發(fā)酵鷹嘴豆納豆制備。

1.3.3 鷹嘴豆納豆的加工工藝流程及操作要點

操作要點：

種子液的活化：取篩選保存的納豆芽孢桿菌甘油管，先在LB平板上劃線活化，37℃培養(yǎng)過夜，待長單菌落后，挑取單菌落接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃條件下以180 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h。

原料預(yù)處理：挑選顆粒飽滿，大小均勻的鷹嘴豆，清洗干凈后室溫下清水浸泡24 h。

蒸煮與接種：浸泡后的鷹嘴豆在0.13 MPa的壓力下蒸煮20 min。無菌條件下按原料質(zhì)量的4%的接種量接種納豆芽孢桿菌。

1.3.4 鷹嘴豆納豆的感官評價

感官評價小組由10人組成（男女各半），年齡均在20歲至50歲之間。評價小組在專業(yè)的感官評價室中進(jìn)行感官評價。樣品由統(tǒng)一容器盛裝，編碼與取樣過程均為隨機。要求評價小組成員評價前12 h內(nèi)不得飲酒，不得食用刺激性食物，評定過程中禁止相互討論。每次評定之間以10 min為時間間隔，評定完每份樣品后以清水漱口。鷹嘴豆納豆感官評價的特征描述在金爽等[2]的研究上略做改進(jìn)，具體感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。鷹嘴豆納豆各項指標(biāo)滿分為10分，其中，拉絲和口感的權(quán)重分別為30%，色澤和氣味各的權(quán)重分別為20%，最終得到的一個滿分為10分的綜合評分。

表1 鷹嘴豆納豆感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of chickpea natto

1.3.5 納豆激酶酶活的測定

（1）納豆激酶粗酶液的獲得

發(fā)酵后的新鮮納豆送入預(yù)冷室-40℃冷凍，冷凍干燥后用粉碎機粉碎成含納豆激酶的納豆樣品粉末。在每克納豆樣品粉末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水5 mL，4℃浸提4 h，4℃條件下4 500 r/min離心20 min，所得上清液即為納豆激酶粗酶液[17]。

（2）酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制質(zhì)量濃度為50mg/mL的酪氨酸（tyrosine，Tyr）標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.025 mL、0.050 mL、0.075 mL、0.100 mL、0.150 mL、0.200 mL，分別加入蒸餾水0.500 mL、0.475 mL、0.425 mL、0.400 mL、0.350 mL、0.300 mL，加入0.4 mol/L的Na2CO3和Folin-酚試劑混勻后，放入40℃水浴保溫20 min，進(jìn)行比色測定（波長680 nm）。然后以Tyr標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)680nm（y）為縱坐標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）納豆激酶酶活測定

參考商業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定》[18]中的方法，在1.5 mL的離心管中加入300 μL納豆激酶粗酶液，再加入300 μL的1%酪蛋白溶液，混勻，40℃水浴加熱10 min，再加入300 μL 10%的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)。室溫4 500 r/min離心10 min。取上清濾液20 μL，用上述Folin-酚法測定吸光度值A(chǔ)680nm。納豆激酶酶活計算公式如下：

納豆激酶酶活定義：在40℃條件下每克樣品每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位（U/g）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0對測定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色結(jié)果

按照1.3.1中的方法從土壤中共分離出了23株菌（編號S-1～S-23）。按照1.3.2中的方法分別從北海道產(chǎn)圓粒大豆納豆樣品中分離出7株菌（編號為F-1-1～F-1-7）；本場水戶極小粒納豆樣品中分離出5株菌（編號為F-2-1～F-2-5）；北海道大粒納豆樣品中分離出5株菌（（編號為F-3-1～F-3-5）；燕京納豆樣品中分離出5株菌（編號為F-4-1～F-4-5；御城納豆樣品中分離出5株菌（F-5-1～F-5-5），共27株菌。經(jīng)過革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明所分離的50株菌均為革蘭氏陽性菌。

2.2 酪蛋白平板篩選

分別測量從納豆樣品中得到的27株菌與從土壤中分離出的23株菌在酪蛋白平板上形成透明圈的直徑，并對其排序，結(jié)果如表2、表3所示。

表2 納豆樣品中27株菌酪蛋白平板產(chǎn)透明圈排序Table 2 Ranking of transparent zones produced by 27 strains in natto samples

由表2可知，從納豆樣品中分離出來的菌株在酪蛋白平板上產(chǎn)生的透明圈直徑達(dá)5 mm以上（含5 mm）的菌株有16株，占納豆樣品中食品中分離菌株總數(shù)的59.26%；由表3可知，從土壤中分離出來的菌株分解酪蛋白產(chǎn)透明圈直徑達(dá)5 mm以上（含5 mm）的菌株有5株，僅占土壤中分離菌株的21.74%。從納豆樣品中分離出的菌株在分解酪蛋白產(chǎn)透明圈能力上極顯著高于從土壤中分離出的菌株（P＜0.01）。值得注意的是，盡管從土壤中分離出的菌株分解酪蛋白的能力差異較大，仍出現(xiàn)了個別菌株分解酪蛋白的能力強于分離自納豆樣品的菌株（如菌株S-12）。因此，很有可能從土壤中分離出可以用于納豆制作的高酶活力菌株。

表3 土壤樣品中23株菌酪蛋白平板產(chǎn)透明圈排序Table 3 Ranking of transparent zones produced by 23 strains in soil samples

2.3 鷹嘴豆納豆感官評價

根據(jù)2.2中得到的結(jié)果，從土壤樣品中挑選出了水解酪蛋白能力最強的10株菌（S-12、S-18、S-16、S-19、S-5、S-6、S-11、S-15、S-1及S-8）和納豆樣品中水解酪蛋白能力最強的3株菌（F-5-3、F-4-4及F-2-4），共計13株菌，將其接種到鷹嘴豆上，發(fā)酵制備鷹嘴豆納豆，并對得到的鷹嘴豆納豆成品打分，結(jié)果如圖1及表4所示。

圖1 鷹嘴豆納豆成品性狀Fig.1 Characters of chickpea natto products

由圖1可知，發(fā)酵成熟的鷹嘴豆納豆表面為金黃色，覆有一層白色的分泌物，濕潤且有光澤，挑起后有長長的拉絲。由表4可得，在感官評價方面，納豆樣品中分離出的菌株占據(jù)了前三名的位置。經(jīng)方差分析，從納豆樣品中分離出的菌株發(fā)酵制作的鷹嘴豆納豆在感官評分上顯著高于從土壤中分離出來的菌株發(fā)酵制成的納豆（P＜0.05）。同時，土壤中分離出來的菌株S-15、S-19、S-11在感官評分上也很接近納豆樣品中分離出的菌株F-4-4。

表4 鷹嘴豆納豆感官評分結(jié)果Table 4 Results of sensory evaluation scores of chickpea natto

2.4 納豆激酶活力的測定

2.4.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以Tyr標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）的平均值為縱坐標(biāo)，繪制Tyr的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.056 6x+0.001 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，表明Tyr質(zhì)量濃度與吸光度值線性關(guān)系良好。

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of tyrosine

2.4.2 納豆激酶活力的測定

將測得不同樣品的吸光度值帶入酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，可得到對應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量濃度，計算出樣品納豆激酶活性的大小，具體結(jié)果如表5所示。

由表5可知，從土壤中分離出的菌株S-18平均酶活力最高，達(dá)到了（3 269.38±52.59）U/g，從納豆中分離出的菌株F-2-4次之，酶活力為（2 931.12±172.74）U/g。從不同品牌納豆樣品中分離得到的菌株在制作鷹嘴豆納豆中獲得納豆激酶活力差別較大，分別位列2、9、12位。經(jīng)過方差分析，用這13株菌發(fā)酵得到鷹嘴豆納豆的納豆激酶活力差異性顯著（P＜0.05）。用土壤中分離出的S-18、S-19和S-5三株菌發(fā)酵得到的鷹嘴豆酶活力均＞2 500 U/g。

表5 納豆激酶酶活力測定結(jié)果Table 5 Determination results of nattokinase activity

3 結(jié)論

本研究對來自5種不同品牌的納豆樣品與土壤中的50株芽孢桿菌進(jìn)行了分離篩選，從土壤中得到了用于發(fā)酵鷹嘴豆納豆有較高感官評分同時納豆激酶活性較高的菌株S-18。綜合考慮，土壤中分離出的最優(yōu)三株菌分別為S-19、S-18和S-5。其中，菌株S-18酶活力最高，達(dá)到了（3 269.38±52.59）U/g，該菌屬于納豆激酶高產(chǎn)菌株。

綜合來看，分離自納豆樣品中的菌株無論是在酪蛋白分解實驗還是在鷹嘴豆納豆發(fā)酵的感官評價中都有著明顯的優(yōu)勢，而且整體能力十分均衡。但是，從土壤樣品中分離出部分菌株在這些方面也有著接近于食品中分離出菌株的優(yōu)良能力，甚至在發(fā)酵鷹嘴豆納豆產(chǎn)納豆激酶的活力上還要更勝一籌，對高納豆激酶活性的鷹嘴豆納豆的開發(fā)具有良好的應(yīng)用前景。