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    月見草油氣相色譜指紋圖譜研究

    2018-08-10 02:17:04王慧竹徐麗華
    中國釀造 2018年7期
    關(guān)鍵詞:月見草號(hào)峰亞油酸

    王慧竹,陳 帥*,石 琳,韓 緒,張 龍,張 敏,徐麗華

    (1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022;2.吉林大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 長春 130021)

    月見草(Oenothera biennisL.)為柳葉菜科月見草屬1~2年或多年生草本植物,其原產(chǎn)于北美地區(qū),在我國主產(chǎn)于東北三省[1],月見草全身是寶,月見草揮發(fā)油可食用,花可提取芳香油,莖皮纖維可制繩,根是解熱、消炎的良藥,莖和葉有清熱解毒、鎮(zhèn)痛的功效[2-3],種子可榨油食用和藥用,其中月見草油是其主要成分,主要由亞油酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸多種脂肪酸和維生素等組成[4],具有良好的降脂、降糖、減肥、抗炎、抗氧化、抗血栓功能[5-7],對(duì)老年慢性疾病具有醫(yī)療保健作用。隨著對(duì)月見草油藥理作用的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),全世界對(duì)月見草油的需求也日益增長。目前對(duì)月見草油的研究主要集中在提取工藝、成分分析、藥理作用等方面[8-10]。

    中藥指紋譜圖技術(shù)是指用色譜、光譜檢測(cè)方法獲得中藥成分的譜圖,然后對(duì)圖譜進(jìn)行“過濾”、簡化等加工處理,從而獲得穩(wěn)定和專屬的特征指紋圖譜,以此來控制藥材質(zhì)量[11-13]。

    本實(shí)驗(yàn)以月見草油為研究對(duì)象,采用氣相色譜法結(jié)合柱前甲酯衍生化法,建立不同產(chǎn)地月見草油的指紋圖譜,通過國家藥典委員會(huì)指紋圖譜評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度,并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)中的聚類分析和主成分分析,探討了不同批次月見草油差異的來源,以期為月見草油的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    來源于不同產(chǎn)地的月見草藥材購自吉林各大藥材零售商,經(jīng)吉林化工學(xué)院陳帥副教授鑒定為月見草正品,月見草藥材的批次編號(hào)、批號(hào)及產(chǎn)地信息匯總情況見表1。

    石油醚、環(huán)己烷(分析純)、對(duì)照品:γ-亞麻酸甲酯(批號(hào):20110723,純度≥98%)、亞油酸甲酯(批號(hào):20176307,純度≥98%)均由武漢華士特工業(yè)生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

    表1 月見草來源及編號(hào)Table 1 Sources and number ofOenothera biennis

    1.2 儀器與設(shè)備

    FL 9720氣相色譜儀:浙江福立分析儀器有限公司;AUY220型電子分析天平:日本島津公司;HP-5毛細(xì)管氣相色譜柱:美國安捷倫科技有限公司;氫火焰離子化檢測(cè)器:浙江福立分析儀器有限公司;SHC型高純氫氣發(fā)生器、JK-5L型純凈空氣泵:山東賽克賽斯氫能源有限公司;BJ-100植物粉碎機(jī):上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司;WSP-100恒溫水浴鍋:上海申生科技有限公司;SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵:鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SHZ-A水浴恒溫振蕩器:常州國旺儀器有限公司;H1850臺(tái)式高速離心機(jī):湖南長沙湘儀離心機(jī)廠。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件的優(yōu)化方法

    GC9720色譜柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm);分流比30∶1;檢測(cè)器溫度280℃;載氣高純氮?dú)?;柱流?.5 mL/min;氫氣流量30mL/min;空氣流量300 mL/min;進(jìn)樣量2 μL;柱溫箱溫度:在實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過程中共篩選了3個(gè)升溫程序。

    A:初始溫度50℃,保持2min,以10℃/min升溫至100℃,保持2 min,以15℃/min升溫至140℃,保持5 min,以8℃/min升溫至200℃,保持10 min。

    B:初始溫度55℃,保持2min,以7℃/min升溫至120℃,保持3 min,以16℃/min升溫至180℃,保持5 min,以8℃/min升溫至220℃,保持12 min。

    C:初始溫度55℃,保持3min,以5℃/min升溫至100℃,保持2 min,以20℃/min升溫至160℃,保持3 min,以3℃/min升溫至230℃,保持15 min。1.3.2供試品溶液制備方法

    取自然晾干的月見草適量,粉碎,過50目篩,準(zhǔn)確稱量100 g,置于2 000 mL圓底燒瓶中,加正己烷1 200 mL,水浴加熱回流提取2次,每次1.5 h,合并提取液,減壓回收溶劑,得月見草油。由于正己烷直接萃取的月見草提取液中可能會(huì)混有部分長鏈脂肪酸或不飽和脂肪酸,若直接進(jìn)氣相分析,會(huì)污染毛細(xì)柱,因此需將在進(jìn)樣前對(duì)其進(jìn)行衍生化,本文采用氫氧化鉀-甲醇溶液進(jìn)行脂肪酸甲酯化的方法進(jìn)行樣品處理,在處理過程中,分別對(duì)氫氧化鉀-甲醇溶液濃度、加入量、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行考察。具體操作為:取月見草油約50 mg,置于具塞離心試管中,加入5 mL正己烷中,然后分別加入濃度為(1 mol/L、2 mol/L、3 mol/L)的KOH甲醇溶液[14](0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL),室溫振蕩反應(yīng)(2 min、3 min、5 min、10 min),以1 200 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心,取上層有機(jī)相,置于10 mL容量瓶中,正己烷定容,搖勻,進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

    1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

    分別精密稱定γ-亞麻酸甲酯0.003 0 g、亞油酸甲酯0.005 0 g,分別置于兩個(gè)5 mL棕色容量瓶中,加正己烷溶解并定容至刻度,即得γ-亞麻酸甲酯、亞油酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品貯備液;分別精密移取上述兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.4 mL,分別置于同一個(gè)5 mL容量瓶中,即得體積分?jǐn)?shù)分別為48 μL/mL和80 μL/mL的γ-亞麻酸和亞油酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,冷藏備用。

    1.3.4 數(shù)據(jù)處理

    指紋圖譜相似度計(jì)算采用國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件”2012.130723版本,計(jì)算方法采用均值法;聚類分析采用SPSS20.0軟件,以月見草油指紋圖譜各共有峰面積為數(shù)據(jù)源,采用系統(tǒng)聚類中的組間連接方法,樣品距離度量采用平方Euclidean距離進(jìn)行計(jì)算;利用SIMCA 14.1軟件,以不同批次月見草油各共有峰的峰面積為自變量,進(jìn)行主成分分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 條件優(yōu)化

    在柱溫箱溫度優(yōu)化過程中因C升溫程序的色譜圖中,各色譜峰分離度良好,色譜峰分布均勻,故最終選擇C升溫程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn);供試品溶液甲酯化試驗(yàn)結(jié)果表明,在相同的色譜條件下,加入2 mol/L的KOH甲醇溶液1.0 mL,室溫振蕩反應(yīng)5 min,色譜峰較多、峰面積較大,且樣品處理時(shí)間合適,因此在供試品溶液制備過程中,采用向樣品溶液中加入2 mol/L的KOH甲醇溶液1.0 mL,室溫振蕩反應(yīng)5 min的方法進(jìn)行甲酯化。將表1中各批月見草藥材分別按“1.3.2”項(xiàng)下優(yōu)化出的最佳方法制備供試品溶液,并按“1.3.1”項(xiàng)優(yōu)化出的最佳色譜條件測(cè)定,記錄結(jié)果見圖1(圖中顯示樣品S4的色譜圖)。

    2.2 月見草油指紋圖譜的建立

    2.2.1 參比峰的選擇

    通過氣相色譜法對(duì)10批月見草油進(jìn)行測(cè)定,在樣品的氣相色譜圖(圖1)中,亞油酸甲酯(4號(hào)峰)色譜峰的峰面積較大,與相鄰色譜峰的分離度較好,且為10批月見草油指紋圖譜所共有,因此,本研究將其設(shè)為參照峰,用以計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

    圖1 月見草油樣品S4(A)和混合標(biāo)準(zhǔn)品(B)氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram ofOenothera biennisoil sample S4(A)and mix standards(B)

    2.2.2 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

    將所得的10批月見草揮發(fā)油GC圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入中國藥典委員會(huì)研制的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版),建立了月見草揮發(fā)油GC指紋圖譜疊加模式色譜圖,結(jié)果如圖2所示。將10批月見草油按平均值法生成對(duì)照指紋圖譜,通過對(duì)各批次的指紋圖譜的相似度計(jì)算,結(jié)果見表2。

    圖2 10批月見草油GC指紋圖譜疊加圖Fig.2 GC fingerprint superposition of 10 batches of Oenothera biennisoil

    由圖2可知,以樣品S4藥材圖譜作為參照譜進(jìn)行指紋匹配,確定了8個(gè)共有峰。由表2可知,以10批月見草油按平均值法生成對(duì)照指紋圖譜相似度為1進(jìn)行計(jì)算,10批藥材的相似度在0.914~0.989范圍內(nèi)。

    表2 10批月見草揮發(fā)油GC指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of GC fingerprint of the 10 batches of Oenothera biennisoil

    2.3 方法學(xué)考察

    2.3.1 精密度試驗(yàn)

    取同一供試品溶液(樣品S4),按“1.3.1”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,以4號(hào)峰(亞油酸甲酯)為參照峰,計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別見表3和表4。

    表3 相對(duì)保留時(shí)間的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results of precision for relative retention time

    表4 相對(duì)峰面積的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of precision for relative peak area

    由表3可知,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<0.76%;由表4可知,相對(duì)峰面積的RSD<1.60%,表明方法的精密度良好。

    2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取同一供試品(樣品S5)溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳色譜條件,分別于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h進(jìn)樣,記錄色譜圖,以4號(hào)峰(亞油酸甲酯)為參照峰,計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表5和表6。

    表5 相對(duì)保留時(shí)間的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experimental results of stability for relative retention time

    表6 相對(duì)峰面積的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Experimental results of stability for relative peak area

    由表5、表6可知,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.96%,各共有峰相對(duì)峰面積RSD<1.85%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

    取同一批(樣品S4)月見草藥材5份,按“1.3.2”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳供試品溶液制備方法平行制備5份月見草油供試品溶液,按“1.3.1”項(xiàng)下方法優(yōu)化出的最佳色譜條件,依次測(cè)定,記錄色譜圖,以4號(hào)峰(亞油酸甲酯)為參照峰,計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表7和表8。

    表7 相對(duì)保留時(shí)間的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Experimental results of repeatability for relative retention time

    表8 相對(duì)峰面積的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Experimental results of repeatability for relative peak area

    由表7、表8可知,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.24%,各共有峰相對(duì)峰面積RSD<2.83%,表明該方法具有較好的重復(fù)性。

    2.4 月見草油指紋圖譜的聚類分析

    本研究以月見草油指紋圖譜各共有峰面積為數(shù)據(jù)源[15],對(duì)10批月見草油的GC指紋圖譜進(jìn)行聚類分析,采用系統(tǒng)聚類中的組間連接方法,樣品距離度量采用平方Euclidean距離,得到10批月見草油指紋圖譜的聚類分析樹狀圖,結(jié)果如圖3所示。

    圖3 10批月見草油指紋圖譜的聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis tree for 10 batches ofOenothera biennisoil

    聚類分析圖反映的是各樣品的相似程度,樣品間的分類距離值越小則樣品間的差異越小,反之則越大。由圖3可知,當(dāng)分類距離取10時(shí),10批月見草樣品被分為2類,即Ⅰ和Ⅱ類,其中S4和S8為II類,其余樣品為I類。

    2.5 主成分分析

    以主成分特征值>1作為選擇主成分的依據(jù),獲得2個(gè)主成分,主成分分析結(jié)果如圖4所示。

    由圖4可知,累計(jì)均方差為96.5%,表明引入的2個(gè)主成分可以表達(dá)96.5%的原變量信息,從圖4A中可以看出,10批樣本大致分為兩組,分別標(biāo)記為I和II。其中,S4和S8為II組,其余樣品為I組,由于S4和S8樣品來源分別為湖北巴東和江西吉水,而其余樣品均來自北方寒冷地區(qū),結(jié)合分析結(jié)果,地理位置與氣候條件的差異對(duì)月見草質(zhì)量存在一定程度的影響。從圖4B中可以看出1,2,3,4,5,6號(hào)峰對(duì)PC1有較大的貢獻(xiàn),而7,8號(hào)峰對(duì)PC2有較大的貢獻(xiàn)。

    圖4 不同批次月見草油指紋圖譜的主成分分析結(jié)果Fig.4 Results of principle components analysis of fingerprint of oil fromOenothera bienniswith different batches

    3 結(jié)論

    在最優(yōu)的樣品處理方法和色譜條件下,建立了月見草油的指紋圖譜,經(jīng)方法學(xué)考察,該方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好,均符合指紋圖譜規(guī)定要求。通過對(duì)指紋圖譜分析,確證了8個(gè)共有峰,10批月見草油的相似度為0.914~0.989。考慮到中藥這一復(fù)雜體系中的不同的化學(xué)物質(zhì)之間可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性,因此聚類分析和主成分分析被應(yīng)用于此研究中,并且聚類分析和主成分分析的結(jié)果一致,所選樣本在兩種方法下均被分成了兩類,同時(shí)主成分分析結(jié)果表明1、2、3、4、5、6號(hào)峰為影響月見草油指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的主要因素(累計(jì)方差為90.5%)。由于受實(shí)驗(yàn)條件所限,本實(shí)驗(yàn)只鑒定出4號(hào)峰和5號(hào)峰分別為亞油酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯,其它色譜峰代表的化學(xué)成分需進(jìn)一步研究。本研究建立的月見草油指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法,為月見草油質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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