馬鈴薯黑痣病生防芽孢桿菌的篩選與鑒定

朱明明，張 岱，趙冬梅，潘 陽(yáng)，朱杰華，楊志輝

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000)

馬鈴薯黑痣病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的一種土傳性真菌病害，該病害既可通過(guò)土壤傳播，也可通過(guò)帶病種薯傳播[1]，在世界各國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。近年來(lái)，馬鈴薯種植面積逐漸擴(kuò)大，難以進(jìn)行輪作倒茬，導(dǎo)致土壤中立枯絲核菌逐年累積，馬鈴薯黑痣病對(duì)我國(guó)馬鈴薯外觀品質(zhì)影響嚴(yán)重。據(jù)報(bào)道，內(nèi)蒙古地區(qū)馬鈴薯黑痣病發(fā)病嚴(yán)重的地塊發(fā)病率可達(dá) 70%～80%[3]，植株幼苗的死亡率高達(dá)60%[4]，嚴(yán)重制約我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

目前，馬鈴薯黑痣病仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)藥劑的頻繁使用會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染[5-6]。我國(guó)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展方向是綠色可持續(xù)發(fā)展，因此利用生物源藥劑來(lái)防控病害符合我國(guó)當(dāng)今和未來(lái)的農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)。當(dāng)前，有機(jī)改良劑[7]、有益微生物[8]、植物藥劑和生防因子[9]等環(huán)境友好型生防藥劑的開(kāi)發(fā)成為防治土傳病害的研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究表明，寄生性真菌綠色黏帚霉(Gliocladiumvirens)和木霉屬(Trichodermaspp.)[10-12]、輪枝菌(Verticilliumbiguttatum)[13-15]能夠破壞立枯絲核菌的菌絲和菌核，從而降低馬鈴薯黑痣病的發(fā)生。此外，熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)[16]、多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)[17]等細(xì)菌也能夠有效防治馬鈴薯黑痣病。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)微生物群體，能夠產(chǎn)生不同的抗真菌化合物，有利于植物生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗性；此外，還能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，具有很強(qiáng)的生存繁殖能力，有利于生防菌劑的開(kāi)發(fā)[18-19]。芽孢桿菌有益菌株已用于如稻瘟病[20]、小麥赤霉病[21]、小麥根腐病[22]、蘋果輪紋病[23]等多種植物病害的防控研究。針對(duì)馬鈴薯病害的研究多集中于幾種馬鈴薯細(xì)菌病害如馬鈴薯黑脛病和軟腐病[24]、馬鈴薯環(huán)腐病[25]，對(duì)于馬鈴薯黑痣病的生防芽孢桿菌，僅見(jiàn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) XC5[17]和萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)D1-0-1和D1-0-2[26]。因此，進(jìn)一步篩選出適合我國(guó)不同區(qū)域的芽孢桿菌菌株對(duì)于防治黑痣病具有重要意義。

本研究從河北省和內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯連作試驗(yàn)田采集的馬鈴薯根際土中篩選對(duì)黑痣病生防效果好的芽孢桿菌，進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn)，以期為今后馬鈴薯黑痣病優(yōu)良生防菌劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究所用生防菌株均由本試驗(yàn)分離獲得，指示菌株立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)分離自馬鈴薯黑痣病塊莖，保存于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯病害研究中心。

1.2 根際土壤樣品的采集

從河北省和內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯連作試驗(yàn)田采用5點(diǎn)取樣法取馬鈴薯黑痣病發(fā)病嚴(yán)重的植株周圍的健康植株根際 0～20 cm的土壤，混合均勻，裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 馬鈴薯黑痣病生防芽孢桿菌的分離和篩選

采用土壤稀釋法分離土壤中的芽孢桿菌[27]，以平板對(duì)峙法[28]篩選對(duì)馬鈴薯黑痣病具有生防效果的菌株：將25 ℃培養(yǎng)3 d的立枯絲核菌菌餅(直徑5 mm)置于PDA培養(yǎng)基中央，取供試芽孢桿菌菌懸液5 μL分別接種于距立枯絲核菌菌餅2.5 cm處的無(wú)菌濾紙片上，以接無(wú)菌水為對(duì)照。放置在28、15、10 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，待對(duì)照長(zhǎng)滿平板，測(cè)量抑菌帶寬度。

1.4 生防芽孢桿菌的鑒定

1.4.1 生防菌的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征 參照范秀容等的方法[29]，將所篩選的菌株劃線接種于LB平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4.2 生防菌的分子鑒定 采用細(xì)菌Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取生防菌DNA，并用引物gyrB-F(5′-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3′)和gyrB-R(5′-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3′)進(jìn)行g(shù)yrB序列擴(kuò)增[26]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)得的序列與GenBank中核酸序列進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，下載同源性大于98%的序列，利用ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì)，切除兩端不齊的部分，用MEGA(6.06)以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap置信值估算重復(fù)次數(shù)為1 000次。

1.5 生防菌對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽防效試驗(yàn)

1.5.1 生防菌發(fā)酵液的制備 將保存在-80 ℃的菌株劃線于LB平板上活化培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h，按2%的接種量接種于40 mL/250 mL 的三角瓶中，培養(yǎng)2～3 d，調(diào)整菌液濃度至1.0×109CFU/mL，備用。

1.5.2 盆栽防效試驗(yàn) 將麥粒培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后的病原菌按2%的質(zhì)量比接入盆中。試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)處理(表1)，每個(gè)處理10盆，重復(fù)3次。接種30 d后調(diào)查其出苗率、發(fā)病率，根據(jù)張建平等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[30]統(tǒng)計(jì)病害嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

出苗率=出苗數(shù)/播種數(shù)×100%；

發(fā)病率=發(fā)病數(shù)/出苗數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×發(fā)病級(jí)別)/(調(diào)查數(shù)×最高級(jí)別)×100%；

防治效果=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

表1 生防菌株HN-Q-8對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽試驗(yàn)處理

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

生防菌篩選和盆栽試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS V21.0進(jìn)行方差分析，并采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離及黑痣病菌拮抗菌株的篩選

通過(guò)土壤稀釋法從28個(gè)土樣中共分離到141株芽孢桿菌，以平板對(duì)峙法28 ℃培養(yǎng)篩選出12株對(duì)黑痣病菌(R.solani)具有拮抗作用的菌株，其抑菌帶寬度>5.0 mm(表2)。其中HN-Q-8、HC-X-21、NZ-9、NZ-7、FX、HC-W-162等6株芽孢桿菌對(duì)黑痣病菌(R.solani)具有很強(qiáng)的抑制作用(圖1)，其抑菌帶寬度為6.1～8.0 mm(表2)。

表2 芽孢桿菌對(duì)立枯絲核菌的抑制效果

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 溫度對(duì)芽孢桿菌抑制黑痣病菌的影響

將篩選獲得的6株強(qiáng)抑制作用的芽孢桿菌分別放置于28、15、10 ℃與供試立枯絲核菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，測(cè)定溫度對(duì)抑菌帶大小的影響。結(jié)果表明，28 ℃時(shí)供試6株芽孢桿菌的抑菌帶最寬；15 ℃時(shí)抑菌帶的大小急劇減小(圖2)。從表3可以看出，不同菌株抑菌帶減小量差異很大，菌株FX在28 ℃時(shí)抑菌帶寬度為 6.6 mm，在15 ℃時(shí)抑菌帶寬度為2.1 mm，減少了4.5 mm；溫度為15 ℃時(shí)，菌株HN-Q-8的抑菌帶寬度明顯高于其他菌株。而當(dāng)溫度降為10 ℃時(shí)，所有菌株均無(wú)抑菌效果(圖2-C)，表明低溫抑制了芽孢桿菌的活力，從而使其喪失了抑菌效果。

2.3 生防菌株的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征

生防菌HN-Q-8等6個(gè)菌株在LB平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)一致為圓形或橢圓形、乳白色，黏稠濕潤(rùn)，菌落邊緣不整齊，表面有褶皺，不透明(圖3-A)。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體呈桿狀并生有芽孢(圖3-B)。

表3 溫度對(duì)生防菌株抑制黑痣病菌效果的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 生防芽孢桿菌的分子鑒定

本研究測(cè)定了HN-Q-8等6個(gè)菌株的gyrB序列，提交到GenBank，登錄號(hào)為：KY369915-KY369920，長(zhǎng)度為911～927 bp。分別在GenBank中進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，下載21條相似性高于98%的序列，同源比對(duì)后，獲得長(zhǎng)度為 899 bp 的gyrB基因數(shù)據(jù)組。以B.atrophaeus、B.subtilis、B.licheniformis和B.malacitensis作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。該樹形成了3個(gè)分支，從上到下以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。結(jié)合文獻(xiàn)和GenBank注釋分支1～3為解淀粉芽孢桿菌復(fù)合種。Dunlap研究表明，菌株JN86140為B.velezensis[31]，Agbobatinkpo等和Zhao等分別將菌株JX513952和JQ734538鑒定為Bacillusamyloliquefaciens[32-33]，因此分支1界定為B.velezensis，分支2界定為狹義的B.amyloliquefaciens，而分支3為一未命名的隱藏種。本研究中所測(cè)定的6個(gè)芽孢桿菌均聚在分支1中，因此我們將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。

2.5 生防芽孢桿菌HN-Q-8對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽防治效果

不同處理組接種培養(yǎng)30 d后，測(cè)定生防菌株對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果。結(jié)果表明，生防菌灌根和浸種處理組的發(fā)病率和病情指數(shù)均低于病原菌對(duì)照組，且灌根處理低于浸種處理組(表4)；生防菌灌根處理對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果高于浸種處理組，防效分別為61.22%和52.72%(表4)。

3 討論

應(yīng)用有益微生物和微生物代謝產(chǎn)物被認(rèn)為是防治植物病害的有效方法[34-37]。本研究從馬鈴薯根際土中篩選出6株對(duì)馬鈴薯黑痣病菌具有較強(qiáng)抑制效果的B.velezensis，其中菌株HN-Q-8對(duì)馬鈴薯黑痣病的防治效果最強(qiáng)。研究表明，B.velezensis能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，防控植物病原菌，并且能夠誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性[31，38-39]。B.velezensisCC09產(chǎn)生的活性化合物對(duì)由大豆炭疽病菌、立枯絲核菌和鏈格孢引起的真菌病害具有防治作用，且促進(jìn)植物生長(zhǎng)[40-41]。Chen等發(fā)現(xiàn)B.velezensisFZB42產(chǎn)生的聚酮化合物對(duì)果樹火疫病具有防治作用[42]。此外，B.velezensis對(duì)白菜黑斑病菌[43]、番茄灰霉病菌[44]、蘭花枯萎病菌[45]等也具有較好的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)生防菌在不同的溫度下其防治效果不同，大體表現(xiàn)為溫度降低，生防效果減小，且不同菌株減小的程度不同。在10 ℃時(shí)供試芽孢桿菌對(duì)黑痣病菌均無(wú)任何抑制作用，而馬鈴薯在5 ℃以上即可發(fā)芽，10 ℃即可生長(zhǎng)，同時(shí)黑痣病菌10 ℃也可生長(zhǎng)，而此時(shí)供試芽孢桿菌無(wú)防病作用。因此，在今后利用芽孢桿菌防控黑痣病時(shí)，應(yīng)注意播種前期結(jié)合噴施化學(xué)藥劑方能在后期表現(xiàn)出其對(duì)黑痣病的防控作用。本研究中菌株HN-Q-8和HC-X-21在28 ℃時(shí)對(duì)立枯絲核菌的抑制作用無(wú)明顯差異，但當(dāng)溫度降至15 ℃時(shí)，其抑菌效果差異顯著。因此，為了更好地發(fā)揮早期溫度較低時(shí)生防菌株的防病效果，應(yīng)選擇受溫度影響較小的菌株。

表4 菌株HN-Q-8對(duì)馬鈴薯黑痣病的盆栽防治效果

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。