小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒的抑制作用*

和七一，余曉東，李博，熊艷，肖靜

(重慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥教育部活性物質(zhì)生物技術(shù)工程研究中心∥重慶市生物活性物質(zhì)工程研究中心, 重慶401331 )

毒蛇咬傷是一個(gè)嚴(yán)重的公眾健康問(wèn)題，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年有超過(guò)500萬(wàn)蛇傷事件發(fā)生，造成約2.5萬(wàn)～12.5萬(wàn)人喪生[1-2]。為此，2009年，世界衛(wèi)生組織首次將毒蛇咬傷認(rèn)定為一種長(zhǎng)期被忽視的人類健康問(wèn)題[3]。在中國(guó)，每年有近10萬(wàn)人被毒蛇咬傷，蛇傷致死率高達(dá)5%～10%[4]。尖吻蝮蛇Deinagkistrodonacutus是中國(guó)特有蛇種，蛇毒中富含金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、磷脂酶A2和去整合素家族，蛇傷后易造成組織水腫、壞死、出血、血液不凝等癥狀，并引發(fā)全身多器官功能衰竭，致死致殘率極高[5]?？股叨狙遄鳛橐环N有效的蛇傷治療藥物，在實(shí)際應(yīng)用中，也暴露出一些不足，如保存不便、價(jià)格昂貴、適用范圍狹窄、可能引起過(guò)敏反應(yīng)等等[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)大量中草藥提取物或其組分具有抑制蛇毒的作用[7-10]，為蛇傷藥物的研究開(kāi)發(fā)提供了新的思路。小葉三點(diǎn)金Desmodiummicrophyllum為豆科三螞蝗屬植物，具有清熱解毒、利濕通絡(luò)、消炎止血、活血化瘀的功效，用于治療尿路感染、糖尿病、泌尿系結(jié)石、慢性胃炎、慢性氣管炎等癥[11]。在民間，小葉三點(diǎn)金常被用于治療毒蛇咬傷，但其對(duì)蛇毒的抑制效果及其作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)道。本研究以尖吻蝮蛇毒為研究對(duì)象，重點(diǎn)研究小葉三點(diǎn)金醇提物在體外對(duì)蛇毒中蛋白質(zhì)水解酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、纖維蛋白水解酶活性的抑制作用；通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)蛇毒引起的小鼠出血、水腫、組織壞死以及致死作用的中和能力。探究小葉三點(diǎn)金對(duì)尖吻蝮蛇毒體外、體內(nèi)活性的抑制作用，為其治療蛇傷作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小葉三點(diǎn)金采于重慶市北碚區(qū)，經(jīng)鑒定為小葉三點(diǎn)金，陰干后保存?zhèn)溆谩３赡晡宀缴卟捎靡蠓ㄈ《?，冷凍干燥后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器設(shè)備

CK試劑盒，南京建成生物工程研究所；瓊脂糖，酪蛋白，纖維蛋白原，Biosharp公司；透明質(zhì)酸鈉，XiyaReagent公司；溴代十六烷基三甲胺，Amresco公司；丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，考馬斯亮藍(lán)R250，鼎國(guó)生物；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

主要儀器與設(shè)備：四川蜀科TGL-20高速冷凍離心機(jī)，Christ RVC2-18真空離心濃縮儀，北京博醫(yī)康FD-1A-50凍干機(jī)，東莞大華DH-HP80A恒溫恒濕培養(yǎng)箱，北京君意東方JY-SCZ2+電泳儀，鞏義宇翔RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小葉三點(diǎn)金醇提物制備 稱取小葉三點(diǎn)金500 g，切碎后浸泡于1 000 mLφ=75%乙醇中，加熱回流萃取1 h，過(guò)濾得提取液，重復(fù)提取3次。將3次提取液10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，所得上清液低壓旋轉(zhuǎn)濃縮回收乙醇，剩余浸膏冷凍干燥后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對(duì)蛋白水解酶活力的抑制作用 蛋白水解酶活力檢測(cè)參照Okoroma等[12]的方法進(jìn)行。稱取瓊脂糖和酪蛋白各1 g，加入100 mL PBS緩沖液(50 mmol/L pH 7.5)，溶解后倒板，待平板冷卻后打孔。取10 μL尖吻蝮蛇毒(2 μg/μL)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，37 ℃孵育過(guò)夜。平板經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液脫色后測(cè)量透明圈直徑。抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶5、1∶25、1∶50、1∶100]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)，重復(fù)3次。以單獨(dú)蛇毒組作為陽(yáng)性對(duì)照，蛋白水解酶活力定義為100%。

1.3.3 對(duì)磷脂酶A2活力的抑制作用 磷脂酶A2活力檢測(cè)參照Habermann和Hardt[13]的方法進(jìn)行。稱取1 g瓊脂糖，加入100 mL醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L pH 6.5)，溶解后冷卻至50 ℃，加入φ=4%蛋黃液(蛋黃與w=0.85% NaCl溶液按1∶3的比例混合，然后于3 000 r/min離心5 min，取上清)以及c=2% 10 mmol/L CaCl2溶液，混合后倒板，待板凝固后，打孔。取10 μL尖吻蝮蛇毒(1 μg/μL)加入上樣孔內(nèi)，37 ℃孵育9 h后測(cè)量透明圈直徑。抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶5、1∶10、1∶25、1∶50]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)，重復(fù)3次。以蛇毒組作為陽(yáng)性對(duì)照，磷脂酶A2活力定義為100%。

1.3.4 對(duì)透明質(zhì)酸酶活力的抑制作用 透明質(zhì)酸酶活力參照Singer等[14]的方法進(jìn)行。稱取2 g瓊脂糖，加入100 mL醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L pH 5.0)，溶解后50 ℃孵育備用；稱取0.2 g透明質(zhì)酸鈉，加入100 mL相同緩沖液溶解，與瓊脂糖溶液混勻后倒板，待板凝固后，打孔。取10 μL蛇毒(5 μg/μL)加入孔內(nèi)，37 ℃孵育15 h后，加入w=0.75%溴代十六烷基三甲胺溶液，放置2 h后觀察透明圈大小。抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶5、1∶10、1∶25、1∶50]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)，重復(fù)3次。以蛇毒組作為陽(yáng)性對(duì)照，透明質(zhì)酸酶活力定義為100%。

1.3.5 對(duì)纖維蛋白原水解酶活力的抑制作用 纖維蛋白原水解酶活力參照Edgar和Prentice[15]的方法進(jìn)行檢測(cè)。取20 μL尖吻蝮蛇毒(1 μg/μL)與等體積牛纖維蛋白原(20 μg/μL)37 ℃孵育1 h，加入10 μL 5×蛋白質(zhì)變性電泳上樣緩沖液，混勻后沸水加熱5 min，于w=12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶5、1∶10、1∶25、1∶50、1∶100]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)，重復(fù)3次。以纖維蛋白原組和蛇毒組作為對(duì)照，對(duì)抑制結(jié)果進(jìn)行判定。

1.3.6 對(duì)蛇毒出血活性的中和作用 蛇毒出血活性的測(cè)定參考Roodt等[16]的方法進(jìn)行。取昆明小鼠(20±2)g 30只，隨機(jī)分為5組，蛇毒組每只小鼠皮下注射100 μL尖吻蝮蛇毒(0.2 μg/μL)；對(duì)照組每只小鼠注射100 μL生理鹽水，注射后3 h，動(dòng)物經(jīng)乙醚深度麻醉致死，解剖觀察皮下出血情況；抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶25、1∶50、1∶100]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)。以蛇毒組引起的出血活性定義為100%。

1.3.7 對(duì)蛇毒水腫活性的中和作用 蛇毒水腫活性的測(cè)定參考Maiorano等[17]的方法進(jìn)行。取昆明小鼠(20±2 g)30只，隨機(jī)分為5組，蛇毒組每只小鼠足趾注射20 μL尖吻蝮蛇毒(0.15 μg/μL)，對(duì)照組每只小鼠注射20 μL生理鹽水，每隔1 h用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠腳掌厚度。抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶25、1∶50、1∶100]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)。小鼠腳掌的腫脹率=(注射后某時(shí)刻腳掌厚度-注射前腳掌厚度)/注射前腳掌厚度。

1.3.8 對(duì)蛇毒組織壞死活性的中和作用 蛇毒組織壞死活性的測(cè)定參考Mebs等[18]的方法進(jìn)行。取昆明小鼠(20±2)g 30只，隨機(jī)分為5組，蛇毒組每只小鼠肌肉注射50 μL尖吻蝮蛇毒(1 μg/μL)；對(duì)照組每只小鼠注射50 μL生理鹽水，注射后3 h，小鼠眼球取血制備血清，對(duì)肌酸激酶活性進(jìn)行檢測(cè)。抑制作用檢測(cè)：不同質(zhì)量比的蛇毒與小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶25、1∶50、1∶100]預(yù)先在37 ℃孵育30 min，再按照上述方法進(jìn)行活性檢測(cè)。以蛇毒組引起的肌酸激酶活性定義為100%。

1.3.9 蛇毒致死及中和作用研究 尖吻蝮蛇毒半致死劑量(The median lethal dose，LD50)的測(cè)定根據(jù)Meier和Theakston[19]的方法進(jìn)行。選取40只昆明雄性小鼠(20±2)g，隨機(jī)分為5組，分別于腹腔注射200 μL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的尖吻蝮蛇毒(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/kg)，觀察24 h內(nèi)小鼠死亡數(shù)。結(jié)果采用SPSS軟件Pbobit模塊進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。中和蛇毒致死作用的研究，選取48只昆明雄性小鼠(20±2)g，隨機(jī)分為6組。2LD50尖吻蝮蛇毒分別與不同質(zhì)量比的小葉三點(diǎn)金醇提物[m(蛇毒)∶m(提取物)：1∶25、1∶50、1∶100]在37 ℃孵育30 min，按照上述方法進(jìn)行注射，以尖吻蝮蛇毒、生理鹽水以及高劑量提取物作為對(duì)照，記錄小鼠24 h內(nèi)的生存狀況。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析與處理 采用SPSS 18.0 軟件one-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P< 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒酶活力的抑制作用

2.1.1 對(duì)蛋白水解酶活力的抑制 尖吻蝮蛇毒中含有豐富的蛋白水解酶，如金屬蛋白酶，絲氨酸蛋白酶，這些酶類能破壞動(dòng)物組織、導(dǎo)致血液系統(tǒng)紊亂，引起水腫、出血以及組織壞死等癥狀[20]。以酪蛋白為底物檢測(cè)蛇毒中蛋白水解酶的活力，結(jié)果顯示，小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒中蛋白水解酶具有抑制作用，且呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1)。當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶25時(shí)，蛇毒蛋白水解酶活力降低35.22%；當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶50時(shí)，蛇毒蛋白水解酶活力降低55.15%；蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶100時(shí)，提取物能夠完全抑制蛇毒蛋白水解酶活性。

2.1.2 對(duì)磷脂酶A2活性的抑制 磷脂酶A2是一類廣泛存在于蛇毒中的酶類，表現(xiàn)出多種生理藥理功能，如出血毒性、肌肉毒性、神經(jīng)毒性，心臟毒性，以及溶血活性，水腫活性和抗血小板聚集等活性[21]。卵黃瓊脂糖平板結(jié)果顯示(圖2)，當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比在1∶5時(shí)，可使蛇毒磷脂酶A2活力減低21.98%。而當(dāng)兩者比例達(dá)到1∶25時(shí)，可以完全抑制磷脂酶A2活性，提示小葉三點(diǎn)金對(duì)蛇毒磷脂酶A2具有顯著的抑制作用。

圖1 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒蛋白水解酶的抑制作用 (與蛇毒處理組比較,**∶ P < 0.05; ***: P<0.001)Fig.1 Inhibitory effect of ethanol extract of D. microphyllum on proteolytic enzyme activity from D. acutus venom

圖2 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒磷脂酶A2的抑制作用(與蛇毒處理組比較, ***: P<0.001)Fig.2 Inhibitory effect of ethanol extract of D. microphyllum on phospholipase A2 activity from D. acutus venom

2.1.3 對(duì)透明質(zhì)酸酶活力的抑制 透明質(zhì)酸酶存在于多種蛇毒中，尤其在蝰科蛇毒中含量較高。該酶能溶解細(xì)胞與纖維間質(zhì)間的透明質(zhì)酸，破壞結(jié)締組織的完整性，促使蛇毒從局部向周圍組織擴(kuò)散，擴(kuò)大局部毒性；同時(shí)，該酶能促使蛇毒經(jīng)淋巴管和毛細(xì)血管吸收進(jìn)入血液循環(huán)，加速蛇毒引發(fā)的系統(tǒng)性毒性，因而也被稱為“擴(kuò)散因子”[22]。透明質(zhì)酸平板檢測(cè)顯示(圖3)，小葉三點(diǎn)金提取物具有顯著的抑制透明質(zhì)酸酶活性。當(dāng)蛇毒與小葉三點(diǎn)金提取物質(zhì)量比為1∶5時(shí)，可使蛇毒透明質(zhì)酸酶活力降低51.83%；而當(dāng)兩者比例達(dá)到1∶25時(shí)，可以完全抑制透明質(zhì)酸酶活性。

圖3 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒透明質(zhì)酸酶的抑制作用(與蛇毒處理組比較, ***: P<0.001)Fig.3 Inhibitory effect of ethanol extract of D. microphyllum on hyaluronidase activity from D. acutus venom

2.1.4 小葉三點(diǎn)金提取物抑制蛇毒水解纖維蛋白原活性 SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖4)，牛纖維蛋白原呈現(xiàn)3條蛋白質(zhì)條帶，分別為Aα、Bβ、γ。在尖吻蝮蛇毒的作用下，纖維蛋白原Aα、Bβ鏈被降解，產(chǎn)生多條水解片段。當(dāng)小葉三點(diǎn)金醇提物與蛇毒孵育后，可以有效抑制蛇毒對(duì)纖維蛋白原的降解，隨著提取物濃度的增加，纖維蛋白原依次恢復(fù)正常的3條蛋白質(zhì)條帶，且水解片段逐漸消失。當(dāng)蛇毒與小葉三點(diǎn)金提取物質(zhì)量比為1∶5時(shí)，可以保護(hù)部分Bβ鏈被降解；當(dāng)兩者比例達(dá)到1∶10時(shí)，可以完全抑制尖吻蝮蛇毒對(duì)纖維蛋白原Bβ鏈的降解，保護(hù)部分Aα被降解。

圖4 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒纖維蛋白原水解酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of ethanol extract of D. microphyllum on fibrinogenolytic activity from D. acutus venom

2.2 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒體內(nèi)毒性的中和作用

2.2.1 對(duì)出血活性的中和作用 金屬蛋白酶是尖吻蝮蛇毒中含量最高的一類蛋白水解酶，能夠降解微血管基底膜，引發(fā)微血管壁損傷造成局部出血癥狀[20]。小鼠皮下出血結(jié)果顯示(圖5)，當(dāng)蛇毒與小葉三點(diǎn)金提取物質(zhì)量比為1∶25時(shí)，可以抑制尖吻蝮蛇毒64.53%的出血活性；當(dāng)兩者質(zhì)量比為1∶100時(shí)，可以抑制尖吻蝮蛇毒91.73%的出血活性。結(jié)合蛋白水解酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)小葉三點(diǎn)金中存在能夠與蛇毒金屬蛋白酶相互作用的功效組分。

圖5 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒出血活性的中和作用Fig.5 Neutralization of ethanol extract of D. microphyllum on hemorrhagic activity from D. acutus venomA∶ 各處理組引起小鼠皮下相對(duì)出血活性. ***: 與蛇毒處理組比較, P<0.001; B∶ 各處理組小鼠皮下出血代表圖譜. a：蛇毒組; b-d：分別為不同m(蛇毒) ∶ m(提取物)(1∶25, 1∶50, 1∶100)孵育30 min后處理組; e：PBS處理組

2.2.2 對(duì)水腫活性的中和作用 水腫是尖吻蝮蛇傷誘發(fā)的另一顯著癥狀，主要涉及金屬蛋白酶和磷脂酶A2的參與，引起內(nèi)源性炎癥因子釋放從而導(dǎo)致水腫發(fā)生[23-24]。小鼠腳趾水腫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖6)，小葉三點(diǎn)金提取物可以有效抑制尖吻蝮蛇毒引起的水腫癥狀，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。在單獨(dú)注射蛇毒后3 h，小鼠腳掌腫脹度達(dá)到75.17%；當(dāng)蛇毒與小葉三點(diǎn)金提取物質(zhì)量比為1∶25時(shí)，可以使腫脹度降低14.02%；當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶50時(shí)，可以使腫脹度降低22.30%；當(dāng)兩者質(zhì)量比為1∶100時(shí)，可以使腫脹度降低28.82%。基于蛋白水解酶抑制實(shí)驗(yàn)和磷脂酶A2抑制實(shí)驗(yàn)，我們推測(cè)小葉三點(diǎn)金可能通過(guò)作用于蛇毒中這兩類酶起到抑制水腫作用。

圖6 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒水腫活性的中和作用(與蛇毒處理組比較, ***:P<0.001)Fig.6 Neutralization of ethanol extract of D. microphyllum on edema activity from D. acutus venom

2.2.3 對(duì)組織壞死活性的中和作用 肌酸激酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，在組織細(xì)胞內(nèi)能量代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)、肌肉收縮、ATP再生等方面起著重要作用。蛇傷后引起動(dòng)物肌肉組織損傷，引起細(xì)胞膜破裂，肌酸激酶釋放到胞外，通過(guò)檢測(cè)血清中肌酸激酶含量可用來(lái)評(píng)價(jià)蛇毒導(dǎo)致組織損傷情況[25]。結(jié)果顯示(圖7)，小葉三點(diǎn)金提取物各濃度組均能夠顯著的抑制尖吻蝮蛇毒誘導(dǎo)的肌肉毒性，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶100時(shí)，其肌肉毒性可以完全被抑制。

2.2.4 致死保護(hù)性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)小鼠腹腔注射測(cè)得，尖吻蝮蛇毒LD50為2.88 mg/kg。以2LD50尖吻蝮蛇毒作為致死劑量，分別與不同質(zhì)量比的提取物孵育后注射動(dòng)物，結(jié)果顯示(圖8)，小葉三點(diǎn)金提取物能夠顯著增加小鼠存活時(shí)間，且呈量效關(guān)系。單獨(dú)注射蛇毒對(duì)照組，小鼠在5 h內(nèi)全部死亡；當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶25時(shí)，24 h內(nèi)小鼠存活率達(dá)到57.14%；當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶50時(shí)，24 h內(nèi)小鼠存活率達(dá)到85.71%；當(dāng)蛇毒與提取物質(zhì)量比為1∶100時(shí)，小鼠在24 h內(nèi)全部存活。在生理鹽水或高劑量提取物對(duì)照組中，小鼠均未表現(xiàn)出中毒或者致死情況(結(jié)果未顯示)，提示小葉三點(diǎn)金可以作為一種安全的蛇傷治療制劑。

圖7 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒肌肉毒性的中和作用(與蛇毒處理組比較, ***:P<0.001)Fig.7 Neutralization of ethanol extract of D. microphyllum on myotoxic activity from D. acutus venom

圖8 小葉三點(diǎn)金醇提物對(duì)尖吻蝮蛇毒致死活性的中和作用Fig.8 Neutralization of ethanol extract of D. microphyllum on lethal potency from D. acutus venom

3 討 論

在中國(guó)，蛇傷是一種危害較嚴(yán)重的疾病，頻發(fā)于農(nóng)村和偏遠(yuǎn)山區(qū)，而這些地區(qū)抗蛇毒血清供應(yīng)往往較為匱乏。因此，中草藥常被作為蛇傷救治的首選藥物。在民間，雖然大量的中草藥被用于蛇傷治療[27]，然而其治療效果缺乏科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，治療機(jī)制尚不清楚，難以得到大范圍的推廣應(yīng)用。

本研究中，我們選取常用于蛇傷治療的中草藥小葉三點(diǎn)金為研究對(duì)象，體外酶活結(jié)果顯示，小葉三點(diǎn)金醇提物能夠有效抑制尖吻蝮蛇毒中蛋白水解酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶以及纖維蛋白原水解酶活性。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，尖吻蝮蛇毒引起的小鼠皮下出血、水腫、組織壞死癥狀可以被小葉三點(diǎn)金醇提物顯著抑制。大量研究發(fā)現(xiàn)，小葉三點(diǎn)金中除含有蛋白質(zhì)、糖類外，還含有黃酮類、酚類、生物堿類、苯丙素類以及苷類物質(zhì)[27-28]。目前，研究人員已從小葉三點(diǎn)金中分離鑒定出9個(gè)黃酮類化合物[27]。研究證實(shí)，來(lái)源于不同植物中的黃酮類化合物能夠抑制蛇傷引起的炎癥和出血癥狀；同時(shí)，類黃酮物質(zhì)，如Quercetin、kaempferol、luteolin等，還具有顯著的抑制透明質(zhì)酸酶活性[29]。酚類化合物是植物中一類重要的代謝產(chǎn)物，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有抑制蛇毒中乙酰膽堿酯酶、蛋白水解酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、L-氨基酸氧化酶的活性，能夠抑制蛇毒引起的出血、皮膚壞死癥狀[7, 8, 10, 30]。生物堿是小葉三點(diǎn)金中含量較高的一種組分[11]，該類物質(zhì)也被證實(shí)具有抑制蛇毒磷脂酶A2的活性。部分植物來(lái)源的苯丙素類、苷類以及蛋白質(zhì)也被發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)與蛇毒中酶類或毒素相互作用發(fā)揮抗蛇毒功效[7, 8, 31]。蛇傷后引起的動(dòng)物致死是由蛇毒中多種組分(蛋白酶類和毒素)共同作用的結(jié)果，保護(hù)性實(shí)驗(yàn)顯示，小葉三點(diǎn)金能夠顯著延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠存活時(shí)間，提示其可能通過(guò)多組分多途徑發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，從而達(dá)到抑制蛇毒活性的作用。

本研究首次證實(shí)了小葉三點(diǎn)金具有抑制尖吻蝮蛇毒的功效，為該中草藥在蛇傷救治中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。然而，小葉三點(diǎn)金中抗蛇毒功效組分的篩選、鑒定及其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。