煙草甲兩個羧酸酯酶基因的克隆及表達(dá)模式*

朱曉曄 ，丁天波，許抗抗，周江，李燦 ，楊文佳

(1. 貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院∥貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點實驗室，貴州 貴陽 550005; 2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001; 3. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

煙草甲Lasiodermaserricorne(Fabricius)，隸屬鞘翅目Coleoptera、竊蠹科 Anobiidae，是一種世界性的倉儲害蟲，在中國大部分地區(qū)都有分布。該蟲寄主范圍廣，對煙葉、糧食、茶葉、中藥材等多種儲藏物造成危害[1]。主要以幼蟲潛居寄主體內(nèi)進(jìn)行蛀食，排出大量糞便、留下蟲尸、產(chǎn)生異味，嚴(yán)重影響儲藏物的產(chǎn)量和品質(zhì)，其發(fā)生危害具有較強(qiáng)的隱蔽性[2]。目前煙草甲的防治主要以化學(xué)藥劑熏蒸為主，不僅帶來食品安全和人類安全隱患，而且導(dǎo)致其對殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，需要探索新的倉儲害蟲防治策略[3-4]。氣調(diào)技術(shù)(利用高φ(CO2)和低φ(O2)協(xié)同作用)作為一種新的防治手段，近年來被廣泛應(yīng)用于倉儲害蟲的防治[5]，但目前已在谷象Sitophilusgranaries、赤擬谷盜Triboliumcastaneum、粉斑螟Ephestiacautella、嗜卷書虱Liposcelisbostrychophila等發(fā)現(xiàn)其對CO2氣調(diào)產(chǎn)生了不同程度的抗性[6-10]。前期研究對昆蟲應(yīng)對CO2氣調(diào)脅迫適應(yīng)性主要集中在生理學(xué)和生態(tài)學(xué)方面，而分子水平上的機(jī)制研究尚未見報道。

羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)是一種多功能家族酶，廣泛存在于微生物、植物、昆蟲和哺乳動物中。CarE屬于絲氨酸水解酶家族，具有多種類型，有廣泛的底物專一性和重迭性，大多數(shù)酶的反應(yīng)機(jī)理相同，因為在其氨基酸序列上存在保守的催化三聯(lián)體活性中心(Ser、His、Glu)。在昆蟲體內(nèi)，CarE的生理功能并不局限在對外源化合物的解毒代謝和對殺蟲劑的抗藥性形成中的作用[11-12]，近年來研究發(fā)現(xiàn)它在昆蟲信息素、激素降解以及調(diào)節(jié)昆蟲行為中起著重要作用。此外，部分CarE與昆蟲神經(jīng)形成和發(fā)育調(diào)控密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高體積分?jǐn)?shù)CO2氣調(diào)脅迫后煙草甲體內(nèi)CarE酶活性顯著升高[17]，推測CarE可能在害蟲應(yīng)對CO2氣調(diào)脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

為了探究CarE基因在煙草甲體內(nèi)的生理功能，本研究以轉(zhuǎn)錄組測序獲得的CarE序列為基礎(chǔ)，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得煙草甲2條CarE基因的cDNA全長序列，并對其氨基酸序列、同源性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時對其在不同發(fā)育階段及CO2氣調(diào)脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在分析CarE基因與煙草甲生長發(fā)育及與CO2氣調(diào)脅迫響應(yīng)的相關(guān)性，為理解該蟲生長發(fā)育調(diào)控及氣調(diào)脅迫下的應(yīng)激機(jī)制提供分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

供試煙草甲于2010年采自貴州省貴陽市，置于溫度為(28±1) ℃，相對濕度為(75±5) %，全黑暗的人工氣候箱內(nèi)，以中藥材當(dāng)歸Angelicasinensis為食料連續(xù)飼養(yǎng)繁殖40代以上。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑(TRIzol regent，Invitrogen公司)；DNA酶(RQ1 RNase-Free DNase，Promega公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RT Reagent Kit，TaKaRa公司)；Taq酶(TaKaRa公司)；膠回收試劑盒(Gel Extraction Kit，Omega公司)；載體(pGEM-T Easy Vector，Promega公司)；感受態(tài)細(xì)胞DH5α(北京全式金公司)；定量試劑(GoTaq?qPCR Master Mix，Promega公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙草甲RNA提取 分別收集煙草甲低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲，每個蟲態(tài)設(shè)置4個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)40頭試蟲。按照TRIzol試劑說明書提取上述樣品總RNA，利用Nanodrop 2000核酸濃度測定儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和完整性。

1.3.2 CO2氣調(diào)處理 參照筆者實驗室已發(fā)表的CO2氣調(diào)毒理的生物測定數(shù)據(jù)[21]，挑取高齡幼蟲于2個亞致死體積分?jǐn)?shù)LC10[φ(CO2)=30% +φ(空氣)=70%]和LC30[φ(CO2)=70% +φ(空氣)=30%]，及致死中體積分?jǐn)?shù)LC50[φ(CO2)=90%+φ(空氣) =10%]的CO2氣調(diào)處理6 h，挑取存活的試蟲備用，相同條件下空氣處理作為對照，每組處理設(shè)置4個重復(fù)。將處理后的試蟲按照1.3.1方法分別提取總RNA。

1.3.3 第一鏈cDNA的合成 利用DNA酶處理總RNA，去除基因組DNA后，按照PrimeScript?RT Reagent Kit說明書合成第一鏈cDNA，作為全長驗證PCR擴(kuò)增和實時定量PCR的模板。

1.3.4 基因克隆 根據(jù)筆者實驗室測序完成的煙草甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的2個CarE基因片段，BLAST分析后，采用Primer 5.0軟件設(shè)計2對特異性引物(表1)用于開放閱讀框的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包含10×PCR緩沖液2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2.0 μL，rTaq酶0.25 μL，ddH2O補足至25 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照Gel Extraction Kit說明書回收目的條帶，連接至pGEM-T Easy上，再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定，最終將陽性克隆送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.3.5 序列分析 利用DNAMAN 6.03(Lynnon Biosoft)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行編輯和分析，推導(dǎo)的氨基酸采用BLAST工具(http:∥www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性比較分析。利用ProtParam(http:∥web.expasy.org/)、NetNGlys 1.0 server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析編碼蛋白的理化性質(zhì)、N-糖基化位點和信號肽。利用Scanprosite(http:∥prosite.expasy.org/scanprosite/)分析氨基酸的保守區(qū)域。利用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支重復(fù)檢驗次數(shù)均為1 000[18]。

1.3.6 實時定量PCR檢測 采用實時定量PCR方法檢測煙草甲LsCarEB1和LsCarEB2在不同發(fā)育階段及CO2氣調(diào)脅迫后的相對表達(dá)量。使用在線軟件Primer 3.0(http:∥frodo.wi.mit.edu/)設(shè)計特異性表達(dá)引物，內(nèi)參基因采用煙草甲LsEF1α基因(GenBank登錄號：KY549658)，引物序列信息如表1。實時定量PCR反應(yīng)體系如下：GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL以及Nuclease-free Water 7 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)；最后在60～95 ℃ 進(jìn)行熔解曲線分析。每個樣品重復(fù)測定3次。利用2-△△CT方法計算不同發(fā)育階段及CO2氣調(diào)脅迫后的基因相對表達(dá)量[19]，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件中的單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 LsCarEB1和LsCarEB2的克隆及序列分析

利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出煙草甲LsCarEB1和LsCarEB2的cDNA全序列，將其提交到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號分別為MG189601和MG189602。LsCarEB1開放閱讀框長度為1 698 bp，編碼565個氨基酸(圖1)，理論相對分子質(zhì)量和等電點分別為64 100和6.40。LsCarEB2的開放閱讀框為1 695 bp，編碼564個氨基酸(圖2)，理論相對分子質(zhì)量和等電點分別為64 000和5.32。經(jīng)NetNGlyc 1.0 server預(yù)測，LsCarEB1可能存在3個N-糖基化位點，分別為N117、N250和N376；LsCarEB2存在2個N-糖基化位點，分別為N359和N371。 經(jīng)ScanProsite分析表明，2個推導(dǎo)的蛋白均具有羧酸酯酶典型的兩個保守結(jié)構(gòu)域：LsCarEB1蛋白第199-214位含羧酸酯酶B型絲氨酸活性位點FGGNPNSVTLTGFSAG，第104-110位含二硫鍵形成位點EDCLYLN；LsCarEB2蛋白第197-212位含絲氨酸活性位點FGGNPDSITLTGMSAG，第104-110位含二硫鍵形成位點EDCLYVN。LsCarEB1蛋白催化活性中心是以絲氨酸(Ser212)為中心的催化三聯(lián)體(Ser212、Glu346和His466)，LsCarEB2蛋白的催化三聯(lián)體為(Ser210、Glu339和His461)。LsCarEB2編碼的蛋白N末端具有20個氨基酸組成的信號肽序列，推測其可能為分泌蛋白，而LsCarEB1無信號肽存在。

將LsCarEB1和LsCarEB2編碼的氨基酸序列分別進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LsCarEB1與同為鞘翅目的赤擬谷盜T.castaneum(GenBank登錄號：CAH64510)和黃粉蟲Tenebriomoliter(AKZ17664)羧酸酯酶的同源性較高，分別為 51% 和44%。LsCarEB2與赤擬谷盜T.castaneum(KYB968215)和黃粉蟲T.moliter(AKZ17669)羧酸酯酶的同源性分別為 56% 和53%。另外，LsCarEB1和LsCarEB2編碼的蛋白質(zhì)序列相似性為30.0%。

2.2 LsCarEB1和LsCarEB2的系統(tǒng)發(fā)育分析

將LsCarEB1和LsCarEB2推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank登錄的其它昆蟲CarEs氨基酸序列進(jìn)行比對，利用MEGA 7.0軟件的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，上述昆蟲羧酸酯酶可分為6個簇(A、F、G、K、M和N)，本文克隆獲得的LsCarEB1和LsCarEB2基因均屬于羧酸酯酶第三功能組(H-N)的M簇中，該簇主要為β酯酶(β-esterase)(圖3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它們與同為鞘翅目的馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineate和赤擬谷盜T.castaneum的親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)分類學(xué)的分類一致。

2.3 LsCarEB1和LsCarEB2在不同發(fā)育階段的表達(dá)

利用實時定量PCR方法檢測LsCarEB1和LsCarEB2在煙草甲不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明，LsCarEB1和LsCarEB2在煙草甲各發(fā)育時期均有表達(dá)，其中LsCarEB1在高齡幼蟲、成蟲及低齡幼蟲中的相對表達(dá)量顯著高于蛹期(P< 0.05)，上述時期的mRNA表達(dá)量分別是蛹期的14.9、3.58和2.50倍。LsCarEB2在高齡幼蟲、成蟲期、低齡幼蟲中的表達(dá)量分別是蛹期的6.92、2.76和1.21倍，且在高齡幼蟲期的表達(dá)量顯著高于其他時期(P< 0.05)(圖4)。

2.4 不同φ(CO2)對LsCarEB1和LsCarEB2基因表達(dá)的影響

采用LC10、LC30和LC503個φ(CO2)處理煙草甲高齡幼蟲，6 h后發(fā)現(xiàn)LsCarEB1在LC10的相對表達(dá)量與對照組相比無明顯差異，而LC30和LC50處理組mRNA表達(dá)量分別為對照組的2.7倍和4.1倍，且顯著高于對照組(P< 0.05)。LsCarEB2 mRNA的相對表達(dá)量分別為對照的1.66、1.89和2.65倍，其表達(dá)量隨脅迫CO2的體積分?jǐn)?shù)升高而上調(diào)，LC50氣調(diào)脅迫下mRNA表達(dá)量顯著高于對照、LC10和LC30處理組(P< 0.05)(圖5)。

3 討 論

羧酸酯酶作為昆蟲體內(nèi)重要的初級代謝酶系，在殺蟲劑及外源物質(zhì)的代謝、激素降解和神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[11-14]。隨著昆蟲基因組計劃的開展、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不斷普及，目前已有多種昆蟲的羧酸酯酶基因被陸續(xù)克隆，如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster[22]、岡比亞按蚊Anophelesgambiae[23]、赤擬谷盜T.castaneum[24]、家蠶Bombyxmori[25]、意大利蜜蜂Apismellifera[26]、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum[27]、溫室白粉虱Trialeurodesvaporariorum[28]、中華稻蝗Oxyachinensis[29]、橘小實蠅Bactroceradorsalis等[30]。根據(jù)其催化能力、細(xì)胞定位和系統(tǒng)進(jìn)化，可將昆蟲羧酸酯酶分為14個簇(命名為A-N簇)，進(jìn)一步可劃分為A-C、D-G、H-N 3個功能組[31]。本研究在煙草甲轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得2條CarE基因cDNA全序列，經(jīng)與其它昆蟲CarE氨基酸進(jìn)行序列比對和聚類分析，發(fā)現(xiàn)LsCarEB1和LsCarEB2均屬于M簇，為β酯酶。前期研究發(fā)現(xiàn)M簇CarEs基因參與昆蟲體內(nèi)多種生理途徑，包括信息素的降解、生殖發(fā)育以及對外源物質(zhì)的解毒代謝等[28]。

圖1 煙草甲LsCarEB1核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列(起始密碼子ATG和終止密碼子TAA加粗；*表示終止密碼子；下劃虛線為信號肽序列；下劃線為糖基化位點；催化三聯(lián)體用陰影表示；方框為保守氨基酸序列)Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of LsCarEB1 in Lasioderma serricorne (The start codon is indicated with bold and the stop codon is indicated with bold and an asterisk; N-linked glycosylation is underlined; Putative catalytic triad is shaded; The conserved amino acids are boxed)

圖2 煙草甲LsCarEB2核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列(起始密碼子ATG和終止密碼子TAA加粗；*表示終止密碼子；下劃虛線為信號肽序列；下劃線為糖基化位點；催化三聯(lián)體用陰影表示；方框為保守氨基酸序列)Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of LsCarEB2 in Lasioderma serricorne(The start codon is indicated with bold and the stop codon is indicated with bold and an asterisk; The predicated signal peptide is dotted underlined; N-linked glycosylation is underlined; Putative catalytic triad is shaded; The conserved amino acids are boxed)

圖4 煙草甲不同發(fā)育階段LsCarEBs的相對表達(dá)量(柱狀圖上的不同小寫字母表示在P < 0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；EL、LL、PU、AD分別代表煙草甲的低齡幼蟲、高齡幼蟲、蛹和成蟲A：LsCarEB1；B：LsCarEB2)Fig.4 Relative expression levels of LsCarEBs in different development stages of L. serricorne (Different lowercase letters above bars indicate statistically differences at the 0.05 probability level；EL: early larvae；LL: lately larvae；PU: pupae; AD: adults. A: LsCarEB1; B: LsCarEB2)

圖5 不同φ(CO2)誘導(dǎo)下煙草甲高齡幼蟲體內(nèi)LsCarEBs的相對表達(dá)量(柱狀圖上的不同小寫字母表示在P < 0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Control：對照；1：LC10(φ(CO2)=30% + φ(空氣)=70%)；2：LC30(φ(CO2)=70% + φ(空氣)=30%)；3：LC50(φ(CO2)=90% + φ(空氣)=10%)；A：LsCarEB1；B：LsCarEB2)Fig.5 Relative expression levels of LsCarEBs in lately larvae of L. serricorne after exposure to different volume fraction of CO2(Different lowercase letters above bars indicate statistically differences at the 0.05 probability level；Control; 1: LC10 (φ(CO2)=30% + φ(air)=70%); 2: LC30 (φ(CO2)=70%+ φ(air)30 %); 3: LC50 (φ(CO2)=90%+ φ(air)10%)；A: LsCarEB1; B: LsCarEB2)

研究發(fā)現(xiàn)CarEs基因在昆蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)存在一定的差異。如東亞飛蝗Locustamigratoria的LsCseF1在卵期和低齡若蟲期表達(dá)較低，在4齡若蟲表達(dá)量上調(diào)達(dá)到峰值，且一直持續(xù)到成蟲期第5天[32]。而橘小實蠅BdCAREB1主要集中在3齡幼蟲期高表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，幼蟲發(fā)育至3齡幼蟲進(jìn)入暴食期，隨著食物攝入的外源毒素顯著增加，因此BdCAREB1的表達(dá)量相應(yīng)升高[33]。本研究發(fā)現(xiàn)煙草甲LsCarEB1和LsCarEB2在不同發(fā)育階段均有表達(dá)，高齡幼蟲期的表達(dá)量顯著高于低齡幼蟲、蛹和成蟲期，這可能與2個基因在高齡幼蟲期發(fā)揮重要作用相關(guān)，其具體的功能解析還有待于進(jìn)一步研究。

CO2氣調(diào)技術(shù)是一種環(huán)保安全的新型害蟲防治技術(shù)，它主要利用高φ(CO2)和低φ(O2)協(xié)同作用來提高對害蟲的控制效果[5]。在同一昆蟲中，不同發(fā)育階段對CO2氣調(diào)的耐受能力存在顯著的差異，如粉螟C.cautella各發(fā)育時期的試蟲經(jīng)φ=99% CO2處理后，發(fā)現(xiàn)幼蟲、蛹和成蟲的致死時間分別為99.9、78.1和37.5 h，幼蟲對CO2氣調(diào)脅迫的耐受性最強(qiáng)；而赤擬谷盜經(jīng)φ=99% CO2處理后，其幼蟲的致死時間明顯高于成蟲，說明該蟲的幼蟲階段具有更強(qiáng)的耐受性[7]。基于此，選擇耐受性相對較差的發(fā)育階段作為控制害蟲的關(guān)鍵時期，將為有效地應(yīng)用CO2氣調(diào)防治害蟲提供便利。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，煙草甲高齡幼蟲對CO2氣調(diào)具有較強(qiáng)的耐受能力，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)羧酸酯酶的活性顯著高于對照[18]，基于羧酸酯酶在外源物質(zhì)代謝方面的重要作用，推測高齡幼蟲期CO2高耐受性可能與羧酸酯酶的活性升高密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CO2氣調(diào)處理煙草甲6 h后，LsCarEB1和LsCarEB2表達(dá)量均顯著高于對照組，且mRNA的相對表達(dá)量隨著脅迫φ(CO2)的升高而逐漸上調(diào)，我們推測這2個基因可能共同參與了煙草甲對CO2氣調(diào)脅迫的應(yīng)激響應(yīng)。

本研究成功克隆煙草甲LsCarEB1和LsCarEB2的全長cDNA，據(jù)軟件預(yù)測這2個基因編碼的蛋白質(zhì)均屬于β酯酶；LsCarEB1和LsCarEB2在煙草甲各發(fā)育階段均有表達(dá)，且在高齡幼蟲期的表達(dá)量最高，均能被CO2氣調(diào)脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說明它們是煙草甲生長發(fā)育的重要參與者，并在抵御CO2氣調(diào)脅迫過程中起著關(guān)鍵作用。本研究為闡明CarEs基因在昆蟲抵抗氣調(diào)脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時為利用CO2氣調(diào)防控害蟲提供新的思路。