小檗堿調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平影響UC結(jié)腸炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

沈雁 王章流 鄭華君 鐘繼紅 江向紅 倪思憶 李思

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以黏膜炎癥和潰瘍形成為主要病理特征的慢性結(jié)腸炎癥性疾病，常反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，是目前消化科難治性疾病之一[1-2]。近年來，我國(guó)UC發(fā)病率不斷上升，且患者多為青壯年[3]。研究表明，腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）異常凋亡導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷是造成UC結(jié)腸炎癥反應(yīng)持續(xù)存在的主要原因，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）狀態(tài)下激活的 Caspase-12/Caspase-3凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能起到重要的中介作用[4-6]。小檗堿（berberine，BBR）是中藥黃連中提取的有效活性成分，對(duì)于多種急慢性炎癥均有良好的抑制作用，其用于治療UC效果確切[7-8]?；诖耍狙芯繌腃aspase-12/Caspase-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路角度出發(fā)，探討B(tài)BR是否通過調(diào)控ERS水平來影響IECs凋亡行為，以起到治療UC的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)BALB/c小鼠60只，8 周齡，體重（20±2）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，合格證號(hào)為0345203。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度 20～25℃，相對(duì)濕度 40%～70%。

1.1.2 藥品與試劑 右旋葡聚糖硫酸酯鈉（DSS，美國(guó)MP Biomedicals公司，批號(hào)：BJ14745）；小檗堿（BBR，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y18D8C50814）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（GRP78）、Caspase-12 和 Caspase-3 一抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為GR309483-1、ab62484和ab13847）；抗兔和抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為K167722B、K175212C）；蛋白酶K（北京 Tiangen公司，批號(hào)：M2011）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：K167722A）；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（德國(guó)ROCHE公司，批號(hào)：11906800）；高純總RNA快速提取試劑盒（上海Generay公司，批號(hào)：1703G01）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript-II Q RT SuperMix for qPCR（南京 Vazyme公司，批號(hào)：7E092G6）；qPCR試劑ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（南京Vazyme公司，批號(hào)：7E092H6）。

1.1.3 儀器 RM2235型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司），Tec 2500型病理組織漂烘儀（常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司），BX43型顯微鏡（日本OLYMPUS公司），PYX-DHS500BS-Ⅱ型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），BCD-211KD3型冰箱（TCL公司），C21-SDHC15K型電磁爐（浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司），101-3型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海錦屏儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理 將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、BBR低劑量組（UC模型+100mg·kg-1BBR）、BBR 中劑量組（UC 模型+150mg·kg-1BBR）和 BBR 高劑量組（UC 模型+200mg·kg-1BBR），每組12只。按人-小鼠體表面積換算，分別用蒸餾水配制成低、中、高劑量的BBR混懸液。采用DSS誘導(dǎo)法建立UC模型：配制5%DSS溶液（5g DSS溶于100ml蒸餾水中），空白對(duì)照組小鼠每日自由飲用蒸餾水（100ml），其他各組小鼠自由飲用5%DSS溶液，連續(xù)7d。BBR低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠造模同時(shí)予BBR混懸液灌胃（給藥容量為10ml·kg-1），模型對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠給予等體積蒸餾水，1次/d，共7d。

1.2.2 指標(biāo)觀察檢測(cè)

1.2.2.1 一般情況觀察 自造模之日起，每日觀察并記錄各組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)、攝食量和飲水量等情況，每日定時(shí)稱量體重，觀察糞便性狀并行隱血試驗(yàn)與疾病活動(dòng)度評(píng)分（disease activity index，DAI）。DAI=（體重減輕率分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+隱血程度分?jǐn)?shù)）/3。

1.2.2.2 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè) 用藥結(jié)束后，全部小鼠以頸部脫臼法處死，嚴(yán)格無菌條件下取出結(jié)腸組織，肉眼觀察黏膜與漿膜面的變化。取新鮮結(jié)腸組織1塊，修整大小為1.0cm×1.0cm×0.2cm，置于包埋盒用4%多聚甲醛固定4d，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.2.2.3 結(jié)腸組織IECs凋亡情況檢測(cè) 結(jié)腸組織切塊后用4%多聚甲醛固定，包埋切片，按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。主要步驟如下：切片脫蠟入水，蛋白酶K工作液37℃消化組織20min，PBS沖洗，加TUNEL反應(yīng)混合液（含5μl TdT和45μl熒光素標(biāo)記的dUTP標(biāo)記液），加封閉液于暗濕盒中37℃反應(yīng)30min，漂洗，加DAB底物，顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞呈褐色或深褐色，正常結(jié)腸上皮細(xì)胞呈藍(lán)色。每張切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，記錄并統(tǒng)計(jì)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，即代表IECs凋亡數(shù)。

1.2.2.4 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白的表達(dá) 結(jié)腸組織切塊后用4%多聚甲醛固定，包埋切片，按照免疫組化染色法進(jìn)行操作。主要步驟如下：切片二甲苯脫蠟，梯度酒精復(fù)水，3%過氧化氫溶液37℃孵育15min，PBS沖洗，滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，滴加二抗37℃孵育30min，DAB反應(yīng)染色，顯微鏡下觀察反應(yīng)進(jìn)度，沖洗、復(fù)染，干燥，封片。每張切片于200倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察，判讀陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性率。參照Fromowitz法進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：（1）染色強(qiáng)度（以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色強(qiáng)度并減去背景著色計(jì)分）：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；（2）陽(yáng)性范圍：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。計(jì)算兩項(xiàng)結(jié)果之和，＜2分為陰性（-），2～3分為弱陽(yáng)性（＋），4～5分為中度陽(yáng)性（＋＋），6～7 分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）；以評(píng)分代表蛋白表達(dá)水平。

1.2.2.5 熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織GRP78 mRNA的表達(dá) Trizol-離心柱法提取結(jié)腸組織總RNA，測(cè)定總RNA純度和含量后按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 體系（20μl）：10.0μl ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，上下游引物（10μmol/L）各 0.6μl，8.8μl cDNA。PCR 反應(yīng)條件 ：95℃ 30s；40 個(gè)循 環(huán)（95℃ 10s，60℃30s，收集熒光）。PCR 引物序列與擴(kuò)增條件詳見表1。取PCR產(chǎn)物用l%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像，目標(biāo)mRNA的表達(dá)采用內(nèi)參Musβ-Actin進(jìn)行校正，基因相對(duì)表達(dá)水平以 2（Ct內(nèi)參基因-Ct目的基因）表示。

表1 PCR引物序列與擴(kuò)增條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠一般情況比較 造模成功后，模型對(duì)照組與BBR低、中、高劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神呆滯、行動(dòng)緩慢、進(jìn)食少，伴有大便稀溏、便血、體重下降，而空白對(duì)照組小鼠的精神、活動(dòng)、飲食、大便、體重等一般情況均正常。5組小鼠DAI比較見表2。

由表2可見，5組小鼠DAI比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；模型對(duì)照組與BBR低、中、高劑量組小鼠DAI均高于空白對(duì)照組（均P＜0.05）；BBR高劑量組小鼠DAI較模型對(duì)照組降低（P＜0.05），而BBR低、中劑量組小鼠DAI與模型對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表2 5組小鼠DAI比較（分）

2.2 5組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化比較 見圖1。

圖1 5組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化比較

由圖1可見，空白對(duì)照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜上皮未見病變；模型對(duì)照組結(jié)腸可見黏膜下隱窩腺體全部丟失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜至上皮結(jié)構(gòu)破壞；BBR低、中、高劑量組中，以BBR高劑量組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)與正常對(duì)照組最為接近，BBR低劑量組可見隱窩腺體大片丟失，黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分黏膜上皮可見水腫，BBR中劑量組與低劑量組相比病變程度有所減輕。

2.3 5組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡情況比較 見圖2、表3。

圖2 5組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡情況比較

表3 5組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡數(shù)（個(gè)/5個(gè)視野）

由表3可見，5組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡數(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；模型對(duì)照組與BBR低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡數(shù)均高于空白對(duì)照組（均P＜0.05）；BBR低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織IECs凋亡數(shù)均較模型對(duì)照組減少（均P＜0.05）。

2.4 5組小鼠結(jié)腸組織 GRP78、Caspase-12和 Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 見圖3、表4。

由圖3可見，GRP78、Caspase-12和Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞均呈褐色或黃褐色，上述蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。由表4可見，5組小鼠結(jié)腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；模型對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組（均P＜0.05）；BBR中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織GRP78、Caspase-3表達(dá)水平均低于模型對(duì)照組（均P＜0.05），BBR高劑量組Caspase-12表達(dá)水平低于模型對(duì)照組（P＜0.05）。2.5 5組小鼠結(jié)腸組織GRP78 mRNA表達(dá)水平比較 見表5。

圖3 5組小鼠結(jié)腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

由表5可見，5組小鼠結(jié)腸組織GRP78 mRNA表達(dá)水平比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；模型對(duì)照組與BBR低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織GRP78 mRNA表達(dá)水平均高于空白對(duì)照組（均P＜0.05）；BBR中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織GRP78mRNA表達(dá)水平均較模型對(duì)照組降低（均 P＜0.05）。

表4 5組小鼠結(jié)腸組織GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（分）

表5 5組小鼠結(jié)腸組織GRP78 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

ERS是真核細(xì)胞中普遍存在且高度保守的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，是指細(xì)胞在各種應(yīng)激原的刺激下，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成加工蛋白質(zhì)的生理功能發(fā)生障礙，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蓄積所啟動(dòng)的一系列細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡過程[9]。ERS在決定應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局如抵抗、適應(yīng)、損傷或凋亡中發(fā)揮重要作用。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的GRP78通常被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志性分子，其表達(dá)水平代表了細(xì)胞的應(yīng)激水平。生理?xiàng)l件下，GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受蛋白相結(jié)合而使后者處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞ERS適度時(shí)，跨膜感受蛋白與GRP78發(fā)生解離而活化，進(jìn)而通過未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的保護(hù)性機(jī)制以改善應(yīng)激細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成加工，恢復(fù)和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，避免細(xì)胞損傷。但若ERS程度過強(qiáng)或持續(xù)過久，UPR不足以完全代償緩解細(xì)胞損傷時(shí)，為維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，活化的跨膜感受蛋白將進(jìn)一步激活細(xì)胞凋亡程序，誘導(dǎo)應(yīng)激細(xì)胞的程序性死亡[10-11]。Caspase-12是ERS特異性凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的起始因子，它僅在ERS狀態(tài)下被激活并進(jìn)一步磷酸化激活下游的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，從而獨(dú)立地介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。

IECs是一種ERS活躍細(xì)胞，其在生理?xiàng)l件下發(fā)生的適度凋亡與腸道干細(xì)胞的分化補(bǔ)充間維持動(dòng)態(tài)平衡[14]；但當(dāng)其受到腸腔內(nèi)病原微生物、黏膜炎性介質(zhì)、缺血缺氧等應(yīng)激原的刺激后易發(fā)生過度的ERS，出現(xiàn)凋亡加速，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，腸上皮通透性增高[15]，各種內(nèi)外源性抗原物質(zhì)異常暴露并激活腸道局部免疫系統(tǒng)，通過瀑布樣級(jí)聯(lián)放大的連鎖免疫炎癥反應(yīng)，引起組織損傷。研究表明，UC患者和動(dòng)物模型的IECs中可檢測(cè)出ERS過度狀態(tài)[16-18]；而不同應(yīng)激原刺激IECs所構(gòu)建的體外ERS模型以及UC患者、動(dòng)物模型的結(jié)腸組織中亦普遍存在細(xì)胞異常凋亡現(xiàn)象[19-23]。因此，IECs在ERS狀態(tài)下過度凋亡是導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷、引起UC發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[4-6]，通過抑制應(yīng)激特有的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號(hào)通路活化而抑制IECs的凋亡是治療UC的可能有效方法之一。

BBR是從黃連中提取的一種異喹啉類生物堿，具有較強(qiáng)的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，BBR對(duì)UC具有良好的治療效果，可能通過調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)[24]、保護(hù)腸屏障功能[25]和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)[26]等機(jī)制發(fā)揮作用，但直接研究BBR調(diào)控ERS影響IECs凋亡水平，從而介導(dǎo)UC結(jié)腸炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展方面的報(bào)道較為少見，有必要就此深入研究。本研究結(jié)果表明，BBR治療能明顯緩解UC小鼠腹瀉、便血、體重減輕等臨床癥狀，明顯減輕結(jié)腸黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮水腫、上皮結(jié)構(gòu)破壞及隱窩腺體丟失等結(jié)腸組織病理學(xué)損傷，UC小鼠的DAI均明顯下降，說明BBR治療UC具有良好的臨床效果。與正常小鼠相比，UC小鼠發(fā)生凋亡的IECs顯著增多，經(jīng)各劑量的BBR治療后，細(xì)胞的凋亡水平均較模型對(duì)照組明顯減輕，說明IECs凋亡過度是UC的重要病理過程之一，而BBR能有效抑制IECs的凋亡行為。GRP78、Caspase-12和Caspase-3蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，與正常小鼠相比，3者在UC小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)水平均顯著升高，GRP78 mRNA的相對(duì)表達(dá)量亦升高；而經(jīng)中、高劑量的BBR治療后，上述3種蛋白和GRP78 mRNA的表達(dá)水平均較模型對(duì)照組明顯下降，提示ERS介導(dǎo)的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號(hào)通路參與了UC小鼠IECs凋亡過程。

綜上所述，BBR減輕UC結(jié)腸炎癥可能與下調(diào)ERS水平，抑制ERS介導(dǎo)的Caspase-12/Caspase-3凋亡信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明BBR治療UC的作用機(jī)制，BBR在UC治療方面的應(yīng)用前景值得期待。