一種ACE抑制肽在不同溶液中構(gòu)象變化的核磁共振

張 欽,宋鋮鋮,蘇盛億,付穎寰

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧大連 116034;2.國家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034;3.大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

高血壓是最常見的心血管疾病之一,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE,EC 3.4.15.1)在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)中對調(diào)節(jié)血壓起著關(guān)鍵作用[1]。抑制ACE的活性是降低血壓的有效手段,而目前廣泛應(yīng)用的ACE抑制劑往往伴隨副作用[2],這可能與ACE抑制肽的構(gòu)象有關(guān)[3]。核磁共振波譜技術(shù)是現(xiàn)有的能夠測定生物大分子三維空間結(jié)構(gòu)的技術(shù)之一[4-5],在測定分子空間構(gòu)象有著不可替代的重要作用。其中二維核磁共振譜因其相對于一維核磁共振的眾多優(yōu)勢而在分析分子空間狀態(tài)得到運用[6]。NOESY譜表示質(zhì)子的NOE關(guān)系,NOE是一種跨越空間的效應(yīng),與核之間的距離有關(guān),當質(zhì)子間距小于5?時便可在譜圖上觀察到[7]。二維圖譜中的任何一個交叉峰都表示兩個原子之間的距離,利用這樣一系列未經(jīng)指認的距離進行結(jié)構(gòu)推測,從而得到分子的構(gòu)象狀態(tài)[8]。

因此，本文以海蜇性腺中分離出的ACE抑制肽SY為基礎(chǔ),通過核磁共振實驗研究其在不同溶劑中的構(gòu)象情況,為后續(xù)研究ACE抑制肽SY的空間結(jié)構(gòu)及作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Ser-Tyr 純度99.6%,委托南京萊昂生物科技有限公司合成;重水 氘代度99.8%,北京百靈威科技有限公司;DMSO-d6 氘代度99.9%,含0.03% TMS,上海麥克林生化科技有限公司;氘代甲醇-d4 氘代度99.8%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

Mettler MS205DU型半微量天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司;AvanceⅢ400 MHz核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的制備 SY水溶液:精密稱取10.00 mg SY粉末于2 mL 塑料離心管中,用1 mL混合溶劑(D2O∶H2O=9∶1)溶解。SY的DMSO溶液:精密稱取10.00 mg SY 于2 mL 塑料離心管中,用1 mL含TMS的DMSO溶解。SY的甲醇溶液:精密稱取10.00 mg SY于2 mL塑料離心管中,用1 mL的甲醇溶解。超聲(40 Hz)至樣品完全溶解,轉(zhuǎn)移至核磁樣品共振管。

1.2.2 核磁測定條件1H-NMR譜采用zg30脈沖序列在恒溫(25 ℃)下檢測。實驗參數(shù)如下:譜寬(SWH):8012.82 Hz,脈沖寬度(P1):14.55 μs,原始數(shù)據(jù)點數(shù)(TD):65536,采樣時間(AQ):4.0894465 s,接收增益(RG):20.2,采樣次數(shù)(NS):16,空掃次數(shù)(DS):2,馳豫延遲時間(D1):1 s。NOESY譜測定實驗參數(shù)設(shè)置如下:譜寬(SWH):4000 Hz,接收增益(RG):203,采樣次數(shù)(NS):16,空掃次數(shù)(DS):6。

2 結(jié)果與分析

2.1 SY在水溶液中的氫譜與歸屬分析

二肽SY的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和原子編號如圖1所示,SY在水溶液中的一維氫譜如圖2所示,其H原子的歸屬如表1所示。重水上的重氫與SY上的OH、COOH、NH活潑氫相互質(zhì)子交換,在一維氫譜中δ4.7附近出現(xiàn)氘代水的質(zhì)子吸收峰[11]。Tyr-H-8(1)和Tyr-H-8(2)雖然連在同一C原子上,由于該C原子相鄰的原子環(huán)境不同,導(dǎo)致Tyr-H-8中的一個H原子更靠近-CO,使峰產(chǎn)生分裂進而在δ2.96、δ3.13左右產(chǎn)生兩對雙峰。Ser-H-2由于連接電負性比較大的-COOH,在δ3.8左右產(chǎn)生一組四重峰。Ser-H-4周圍相鄰氫所處的環(huán)境不同,Ser-H-4上的亞甲基在δ 3.9和δ4.0左右產(chǎn)生兩組分裂峰。Tyr-H-7連接電負性較大的-COOH,但由于其化學(xué)位移與重水的溶劑峰接近,因此產(chǎn)生的四重峰與重水的溶劑峰重疊。Tyr-H-14,15,16,17這四個位于芳香族上的H,由于苯環(huán)的共軛作用,降低了周圍的電子云密度[19],從而在δ 6.8與δ7.1左右產(chǎn)生兩對雙峰。Tyr-H-6由于連著電負性較大的-CO,核外電子云密度降低,產(chǎn)生最大的屏蔽效應(yīng),在δ8.5左右產(chǎn)生一組雙峰。

圖1 SY化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖Fig.1 Chemical structure of SY

圖2 SY在水溶液中的1H-NMR譜圖Fig.2 1H-NMR spectrum of SY in water solution

表1 SY在三種溶液中的化學(xué)位移Table 1 Chemical shift of SY in three kinds of solution

2.2 SY在DMSO溶液中的氫譜與歸屬分析

SY在DMSO中的一維氫譜如圖3所示。DMSO作為溶劑,則在核磁實驗中樣品SY的-COOH、-OH、-NH活潑氫均不會被取代。在δ2.5出現(xiàn)DMSO的溶劑峰。Tyr-H-8(1)和Tyr-H-8(2)兩個氫原子受到不同的屏蔽效應(yīng),在δ2.8和δ2.9附近產(chǎn)生兩對雙峰,由于自身偶合作用,在δ2.8處為四重峰。Ser-H-2與Tyr-H-7,兩個氫原子都連接著電負性較大的-COOH,由于所處環(huán)境類似,略有差異,分別在δ3.5和δ4.4左右產(chǎn)生四重峰。在δ3.8位置產(chǎn)生的分裂峰為Tyr-H-4亞甲基的信號。在苯環(huán)上的四個氫由于所處空間位置略有差異,故Tyr-H-15,17在δ6.6左右產(chǎn)生一組雙峰,Tyr-H-14,16在δ7.0左右產(chǎn)生雙峰。在δ8.6左右產(chǎn)生了Tyr-H-6(N-H)的雙重峰。Tyr-H-10上的H-為COOH上的氫,由于化學(xué)環(huán)境推測其在δ9.2左右產(chǎn)生單峰。Ser上的NH2上的兩個氫原子在δ8.0產(chǎn)生單峰[20],而Ser-4-H上的H原子由于其化學(xué)環(huán)境接近Ser-H-1上的H原子,與Ser-H-1的峰重疊在一起,在δ8.0產(chǎn)生信號。δ2.0產(chǎn)生的峰為Tyr-H-19產(chǎn)生的信號。由于每個原子的所處環(huán)境不同,故產(chǎn)生相應(yīng)的H歸屬。SY在DMSO中H原子的化學(xué)位移如表1所示。

圖3 SY在DMSO溶液中的1H-NMR譜圖Fig.3 1H-NMR spectrum of SY in DMSO solution

2.3 SY在甲醇溶液中的氫譜與歸屬分析

SY在甲醇中的一維氫譜如圖4所示。用甲醇作為溶劑,活潑氫-OH、-COOH、NR不會在氫譜中產(chǎn)生信號。在δ3.3產(chǎn)生的峰是甲醇的溶劑峰,δ4.8左右產(chǎn)生的為甲醇的水峰。Tyr-H-8(1)和Tyr-H-8(2)分別在δ2.9和δ3.1產(chǎn)生兩組四重峰。Ser-H-2和Tyr-H-7都連接了-COOH,空間環(huán)境相似,分別在δ3.8和δ4.6產(chǎn)生了兩個四重峰。Ser-H-4的亞甲基的兩個氫原子周圍連接的原子環(huán)境不同,導(dǎo)致兩個氫原子也處于不同的環(huán)境,由于偶合作用,在δ3.9左右產(chǎn)生分裂峰。苯環(huán)上的四個H原子由于空間略微的差異,分別在δ6.7與δ7.0產(chǎn)生兩對雙峰。Tyr-H-6在δ8.5產(chǎn)生一個N-H的雙重峰。SY在DMSO中H原子的化學(xué)位移如表1所示。

圖4 SY在甲醇溶液中的1H-NMR譜圖Fig.4 1H-NMR spectrum of SY in CD3OD solution

2.4 SY在三種溶液中NOESY譜及構(gòu)象分析

一般來說NOESY譜上的交叉峰表示在空間位置比較相接近的質(zhì)子。因此NOESY譜可以提供在空間位置上相距若干個鍵之間質(zhì)子的相鄰情況[21]。圖5為SY在水溶液中的1H-1HNOESY譜圖,從圖中可以觀察到3個NOE信號,分別為Tyr-H-8(1)～Tyr-H-8(2),Ser-H-4(1)～Ser-H-4(2),Tyr-H-15,17～Tyr-H-14,16質(zhì)子之間的信號。可以發(fā)現(xiàn),其中的兩個NOE效應(yīng)是連在同一C原子上的兩個H原子之間產(chǎn)生的。另一個NOE效應(yīng)是由苯環(huán)上相對的四個H原子之間產(chǎn)生的。這三個NOE效應(yīng)可能由于是本身空間位置較接近產(chǎn)生的,而且,并未觀察到Ser與Tyr的H原子接觸產(chǎn)生信號,說明SY中兩個氨基酸彼此處在一種相對自由的狀態(tài),在水溶液中處于一個相對伸展的狀態(tài)。有研究表明當小分子物質(zhì)在水溶液時大部分處于活躍狀態(tài)[22]。油菜花粉十二肽在水溶液中時則表現(xiàn)出無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[15]。這種差異可能與肽鏈的長短有關(guān)。較長的肽鏈構(gòu)象可能受溶劑的影響更大,也可能與自身折疊相關(guān)。有文獻報道其他含有酪氨酸的一種ACE抑制肽在水溶液中呈現(xiàn)一種相對伸展的狀態(tài)[17],但有折疊現(xiàn)象,這可能是由于C端氨基酸的不同導(dǎo)致的。雖然都為ACE抑制肽,但由于其氨基酸序列的差異,導(dǎo)致在同一溶液中構(gòu)象也存在差異性。溶劑雖然相同,但氨基酸序列不同,同一環(huán)境下構(gòu)象也可能存在著差異。

圖5 SY在水溶液中的1H-1HNOESY譜圖Fig.5 1H-1HNOESY spectrum of SY in water solution

圖6為SY在DMSO溶液中的1H-1HNOESY譜圖,相對于SY在水溶液中NOESY譜圖,NOE信號明顯增加多至9個。SY在DMSO溶液中的NOE信號分別為Tyr-H-8-(1)～Tyr-H-8(2),Tyr-H-7～Tyr-H-8(1),Tyr-H-7～Tyr-H-8(2),Tyr-H-8(1)～Tyr-H-15,17,Tyr-H-8(2)～Tyr-H-15,17,Tyr-H-7～Tyr-H-15,17,Tyr-H-6～Ser-H-4,Tyr-H-15,17～Tyr-H-14,16,Tyr-H-6～Tyr-H-10。酪氨酸苯環(huán)上的H原子與Tyr-H-7上的H原子有交叉峰,雖然這些H原子都歸屬于酪氨酸,但是通過NOE效應(yīng)和其空間位置效應(yīng),表明在酪氨酸Tyr-H-7附近位置出現(xiàn)折疊現(xiàn)象。且Tyr-H-7和Tyr-H-8質(zhì)子間也產(chǎn)生NOE信號,進一步表明酪氨酸在Tyr-H-7,8以及苯環(huán)位置上的H處于一種折疊狀態(tài)。酪氨酸上的-NH和-COOH可能由于相互吸引作用,在譜圖上產(chǎn)生NOE信號,從而酪氨酸處于一個以其自身為中心的折疊蜷縮狀態(tài),同時酪氨酸上的H-6還與絲氨酸上的H-4在空間位置上接近存在NOE信號。則推測SY在DMSO溶液中處于一個緊湊的折疊蜷縮狀態(tài)。有報道表明谷胱甘肽在DMSO溶液中處于一種折疊的構(gòu)象狀態(tài)[17]。有文獻研究ACE抑制肽IIP在DMSO溶液中也存在類似的構(gòu)象[16]。這些結(jié)果與實驗得到的結(jié)果近似相同。這可能與DMSO本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)[23],DMSO疏水水合作用導(dǎo)致這種構(gòu)象。

圖6 SY在DMSO溶液中的1H-1HNOESY譜圖Fig.6 1H-1HNOESY spectrum of SY in DMSO solution

圖7為SY在甲醇溶液中的1H-1HNOESY譜圖,譜圖中可以觀察到對于酪氨酸和絲氨酸分別產(chǎn)生了來自各自H原子之間的相對應(yīng)的NOE信號。在酪氨酸中分別產(chǎn)生了Tyr-H-8-(1)～Tyr-H-8(2),Tyr-H-7～Tyr-H-8(1),Tyr-H-7～Tyr-H-8(2),Tyr-H-8(1)～Tyr-H-14,16,Tyr-H-8(2)～Tyr-H-14,16,Tyr-H-15,17～Tyr-H-14,16質(zhì)子間的信號。產(chǎn)生這些信號的H原子位置比較接近,因此Tyr優(yōu)先處于一種伸展的狀態(tài),彼此之間略帶有一點折疊狀態(tài)。絲氨酸中產(chǎn)生的NOE信號為Ser-H-2～Ser-H-4(1)、Ser-H-2～Ser-H-4(2),得到的信號表明絲氨酸有折疊現(xiàn)象。從譜圖得到的信息絲氨酸和酪氨酸質(zhì)子之間并沒有產(chǎn)生NOE信號,故兩個氨基酸在相對彼此處于一種比較自由的狀態(tài)。以有機溶液甲醇作為溶劑,產(chǎn)生的折疊構(gòu)象可能是由于有機溶劑導(dǎo)致。但SY整體處于一種較為自由的狀態(tài),甲醇也可以作為一個溶解SY的良好溶劑。

圖7 SY在甲醇溶液中的1H-1HNOESY譜圖Fig.7 1H-1HNOESY spectrum of SY in CD3OD solution

對比SY在三種不同溶液中的NOESY譜圖,可以推測SY在水溶液中整個分子都是處于一種自由的伸展狀態(tài)并不能觀察到折疊狀態(tài)。在甲醇溶液中是以伸展狀態(tài)為優(yōu)勢構(gòu)象并伴有折疊構(gòu)象存在。而在DMSO溶液中是以伸展和折疊狀態(tài)共存,折疊構(gòu)像相對較多。這說明在不同性質(zhì)的溶液中,SY所處的狀態(tài)也是不同的。

3 結(jié)論

通過核磁共振實驗對二肽SY在水溶液、DMSO溶液以及甲醇溶液三種不同溶液環(huán)境下的構(gòu)象進行研究。得到的分析結(jié)果SY分子處在不同溶液環(huán)境時,其構(gòu)象也發(fā)生改變。其在水溶液中相對柔順自由伸展的構(gòu)象存在。而與水溶液不同,在DMSO溶液與甲醇溶液,均有折疊狀態(tài)出現(xiàn)。但在DMSO溶液中,SY分子兩個氨基酸存在接觸,處于折疊蜷縮狀態(tài)。在甲醇中兩個氨基酸獨自折疊,處于相對伸展的狀態(tài)。本研究在對SY后續(xù)的分子構(gòu)象進行進一步研究時,對于溶液選擇提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。