多重PCR檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中3種食源性致病菌

姜 華,焦 陽(yáng),李遠(yuǎn)宏,張金鵬

(徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇徐州 221004)

嬰幼兒配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)是指以牛乳(或羊乳)及其加工制品為主要原料,根據(jù)配方加入適量的營(yíng)養(yǎng)素強(qiáng)化劑和其它輔料加工而成的供嬰幼兒食用的粉狀食品[1]。由于新生兒及嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善,食用具有質(zhì)量安全隱患的PIF將可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良后果甚至中毒,嚴(yán)重時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致死亡[2-3]。

食源性致病微生物是影響PIF安全性問題的一個(gè)極其重要的因素。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)專家委員會(huì)已將克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)、傷寒沙門氏菌(Salmonellaenterica)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterspp.)等20種細(xì)菌列為PIF中可能導(dǎo)致嬰幼兒致病的細(xì)菌[4]。我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》明確規(guī)定克羅諾桿菌(原阪崎腸桿菌)、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是嬰兒配方食品中必檢的3種食源性致病微生物,并且公布了其相應(yīng)的微生物限量指標(biāo)[5]。因此,建立一種能夠同時(shí)檢出嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)已無法滿足政府監(jiān)管部門和企業(yè)快速檢測(cè)多種致病微生物的需要,而多重PCR技術(shù)具有高通量、檢測(cè)速度較快、靈敏度較高、成本較低等優(yōu)點(diǎn),在食源性致病微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[6]。然而基于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)而建立的各種檢測(cè)方法往往會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果,其中引物特異性差是產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的重要原因之一[7]。本研究利用通過篩選克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性引物,建立了一種能夠準(zhǔn)確、快速的實(shí)現(xiàn)對(duì)PIF中上述3種主要食源性致病菌進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的多重PCR方法,以期為預(yù)防和控制這些食源性致病菌在PIF中的流行,保障PIF安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嬰幼兒配方奶粉 荷蘭菲仕蘭坎皮納乳品有限公司;標(biāo)準(zhǔn)菌株 共12株,其中4株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),6株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心,2株由徐州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境與健康實(shí)驗(yàn)室保存(詳細(xì)信息見表1);LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉5 g/L) 實(shí)驗(yàn)室自配;DL2000 DNA Marker 大連Takara公司;LAmp DNA Polymerase 南京諾唯贊生物科技有限公司;GelRed Nucleic Acid Gel Stain 美國(guó)Biotium公司;引物、TE緩沖液、PCR產(chǎn)物回收試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 Strains used in this study

DNP9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Veriti 96 PCR儀 美國(guó)ABI公司;5418型小型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Gel Doc XR凝膠成像儀 美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用水煮法[8]提取細(xì)菌總DNA,具體操作方法如下:將菌株接種于LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)液1 mL于12000 r/min條件下離心5 min,棄上清液,再用1 mL生理鹽水洗滌沉淀一次,于12000 r/min條件下離心5 min。棄上清液,加入200 μL含1% Triton X-100(V/V)的10 mmol/L,pH7.6的TE緩沖液重懸沉淀,煮沸10 min后立即放入-20 ℃冰箱冷凍30 min,室溫融化后于12000 r/min離心5 min,取上清液用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 引物合成 通過查閱文獻(xiàn)資料,選取9對(duì)引物,引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物的序列及PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度見表2。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primer sequences used for PCR amplification in this study

1.2.3 單重PCR驗(yàn)證引物特異性 以表3中標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板,分別對(duì)上述9對(duì)引物進(jìn)行引物的特異性驗(yàn)證。PCR反應(yīng)體系:10×LAmp buffer 5 μL,Mg2+濃度1.5 mmol/L,引物各0.2 μmol/L,基因組DNA模板1 μL,5 U/μL LAmp DNA Polymerase 0.5 μL,加雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min?？瞻讓?duì)照為經(jīng)滅菌處理的雙蒸水替代基因組DNA。PCR反應(yīng)結(jié)束后取7 μL反應(yīng)產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析各引物的特異性。

1.2.4 多重PCR條件的確定 以標(biāo)準(zhǔn)菌株阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213基因組DNA為模板構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系。多重PCR反應(yīng)基本體系:10×LAmp buffer 5 μL,Mg2+濃度1.5 mmol/L,特異性引物對(duì)(OmpA、invAF1和clfA)的上下游引物各0.2 μmol/L,基因組DNA模板各1 μL,5 U/μL LAmp DNA Polymerase 0.5 μL,加雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)基本條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。在此條件的基礎(chǔ)上分別對(duì)多重PCR反應(yīng)的退火溫度(51～61 ℃)、Mg2+濃度(0.25～3.00 μmol/L)和引物濃度(100～800 nmol/L)等多重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)結(jié)束后取7 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 多重PCR反應(yīng)的特異性 以9株標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板,以優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系及條件進(jìn)行多重PCR,瓊脂糖凝膠電泳觀察分析是否有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物以及產(chǎn)物的大小。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后送至生工生物工程(上海)股份公司測(cè)序以驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.6 多重PCR反應(yīng)靈敏度 將菌體濃度均為108CFU/mL(平板計(jì)數(shù)法測(cè)定)的阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213的菌懸液混合后進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,以煮沸法提取DNA,然后按照優(yōu)化后多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增以確定其靈敏度。

1.2.7 人工污染PIF樣品檢出限的確定 取25 g經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)[16-18]的不含克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的PIF,溶于225 mL無菌生理鹽水中,分別加入上述3種目標(biāo)菌使其終濃度達(dá)到108CFU/mL,再進(jìn)行10倍系列梯度稀釋至濃度為101CFU/mL。按照煮沸法提取DNA并進(jìn)行多重PCR檢測(cè)以確定人工污染PIF樣品中多重PCR反應(yīng)的靈敏度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜均由Bio-Rad公司的Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)產(chǎn)生,后由Photoshop 7.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性

以表3中的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增以驗(yàn)證引物的特異性,結(jié)果如表3所示。由表3可知OmpA、invAF1、clfA和nuc4對(duì)引物特異性較好,但由于nuc基因的擴(kuò)增產(chǎn)物只有173 bp,而易受PCR反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增條帶干擾,不利于獲得明確的檢測(cè)結(jié)果。因此,本研究最終選取OmpA、invAF1和clfA 3對(duì)引物為多重PCR引物組合。

表3 引物特異性測(cè)試Table 3 Specificity of primers used in this study

2.2 多重PCR反應(yīng)條件確定

2.2.1 退火溫度的優(yōu)化 當(dāng)退火溫度設(shè)置為51、53、55、57、59和61 ℃時(shí),多重PCR反應(yīng)均能擴(kuò)增出3條特異性目標(biāo)條帶,其中退火溫度為55 ℃時(shí)特異性目標(biāo)條帶最為清晰(圖1)。因此,將多重PCR反應(yīng)的最佳退火溫度確定為55 ℃。

圖1 多重PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of annealing temperature of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1～6:51、53、55、57、59、61 ℃。

2.2.2 鎂離子濃度的優(yōu)化 在最佳退火溫度(55 ℃)條件下,將多重PCR基本反應(yīng)體系中Mg2+濃度設(shè)置為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 和3.00 mmol/L時(shí)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。由電泳圖譜可知，當(dāng)Mg2+濃度大于等于1.0 mmol/L時(shí)，均可檢出多重PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增出的特異性目標(biāo)條帶，尤其是當(dāng)Mg2+濃度為2.00 mmol/L時(shí)特異性目標(biāo)條帶最為清晰(圖2)。因此，確定多重PCR反應(yīng)體系的最佳Mg2+濃度為2.00 mmol/L。

圖2 多重PCR反應(yīng)體系鎂離子濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of Mg2+ concentration of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1～7:0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L。

2.2.3 引物濃度的優(yōu)化 在最佳退火溫度(55 ℃)和最佳Mg2+濃度(2.00 mmol/L)條件下,將多重PCR基本反應(yīng)體系中引物濃度分別設(shè)置為100、200、300、400、500、600、700和800 nmol/L條件下進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明當(dāng)各引物濃度大于400 nmol/L后,特異性目標(biāo)條帶均可同時(shí)檢出且目標(biāo)條帶清晰(圖3)。因此,將多重PCR反應(yīng)的最佳引物濃度確定為400 nmol/L。

圖3 多重PCR反應(yīng)體系引物濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of primers concentration of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1～8:100、200、300、400、500、600、700、800 nmol/L。

2.3 多重PCR反應(yīng)特異性

為了測(cè)試多重PCR反應(yīng)的特異性,將供試標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA在最優(yōu)條件下進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果如圖4所示。陽(yáng)性對(duì)照菌株腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213、阪崎克羅諾桿菌CICC21560、鼠傷寒沙門氏菌CVCC3384、金黃色葡萄球菌ATCC10384和穆汀斯克羅諾桿菌CICC21563均能擴(kuò)增出相應(yīng)特異性基因片段,且無非特異性擴(kuò)增;而陰性對(duì)照菌株致病性大腸埃希氏菌O26∶K60 CICC 10372、大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 10907、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌O78∶K80CICC 10413、單增李斯特菌CICC21633、CICC21634和CICC21662以及空白對(duì)照均無非特異性擴(kuò)增(圖4),表明本研究建立的多重PCR檢測(cè)體系具有較好特異性。此外,將PCR產(chǎn)物測(cè)序后獲得的基因序列在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析,結(jié)果表明PCR產(chǎn)物均為對(duì)應(yīng)菌株的目的基因序列,從而進(jìn)一步證實(shí)了擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4 多重PCR反應(yīng)特異性測(cè)試Fig.4 Specific test of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1:陰性對(duì)照;2:腸炎沙門氏菌CICC21482+金黃色葡萄球菌ATCC29213+阪崎克羅諾桿菌CICC21560;3:腸炎沙門氏菌CICC21482;4:金黃色葡萄球菌ATCC29213;5:阪崎克羅諾桿菌CICC21560;6:鼠傷寒沙門氏菌CVCC3384;7:金黃色葡萄球菌ATCC10384;8:穆汀斯克羅諾桿菌CICC21563;9:致病性大腸埃希氏菌O26∶K60 CICC 10372;10:大腸埃希氏菌O157∶H7 CICC 10907;11:產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌O78∶K80CICC 10413;12:單增李斯特菌CICC21633;13:單增李斯特菌CICC21634;14:單增李斯特菌CICC21662。

2.4 多重PCR反應(yīng)靈敏度

利用本研究建立的多重PCR檢測(cè)體系進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213在107～102CFU/mL濃度下均可同時(shí)擴(kuò)增出清晰的條帶,而濃度為101CFU/mL時(shí)則無清晰的目標(biāo)條帶,因而確定多重PCR反應(yīng)的檢出限為102CFU/mL。

圖5 多重PCR反應(yīng)靈敏度測(cè)試Fig.5 Sensitivity test of multiplex PCR system注:M:DL2000 DNA ladder marker;1:空白對(duì)照;2～8:107、106、105、104、103、102、101 CFU/mL;圖6同。

2.5 人工污染奶粉檢出限

利用本研究建立的多重PCR檢測(cè)體系檢測(cè)人工污染奶粉中的阪崎克羅諾桿菌CICC21560、腸炎沙門氏菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC29213,結(jié)果如圖6所示。3種目標(biāo)菌在奶粉中的檢出限為103CFU/g。

圖6 人工污染PIF中主要食源性致病菌的檢出限Fig.6 Detection limits of the multiplex PCR for pathogenic bacteria in PIF

3 結(jié)論與討論

本研究建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)PIF中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測(cè)方法,該方法具有檢測(cè)速度快、特異性好的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)化后多重PCR檢測(cè)體系的最佳退火溫度為55 ℃,最佳Mg2+濃度為2.00 mmol/L,最佳引物濃度為400 nmol/L。在優(yōu)化條件下,多重PCR反應(yīng)體系可同時(shí)檢測(cè)3種致病菌的靈敏度為102CFU/mL,在人工污染PIF中同時(shí)檢測(cè)3種致病菌的檢出限為103CFU/g。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》中要求不得檢測(cè)克羅諾桿菌和沙門氏菌,金黃色葡萄球菌的微生物限量為10 CFU/g[5]。相比較而言,本研究建立的多重PCR檢測(cè)體系尚無法達(dá)到其要求,但可通過增菌培養(yǎng)來提高待檢食品中目標(biāo)菌含量的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。

近年來,PIF中存在的克羅諾桿菌、傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌污染引起了人們的廣泛關(guān)注[19-21],但是針對(duì)克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌3種致病菌的多重PCR檢測(cè)方法尚鮮見報(bào)導(dǎo)。此外,本研究采用水煮法提取細(xì)菌基因組DNA,具有簡(jiǎn)便、快速、并可顯著降低檢測(cè)成本等優(yōu)點(diǎn)。本研究初步建立了快速檢測(cè)嬰幼兒奶粉中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR體系,實(shí)現(xiàn)了對(duì)3種食源性致病菌DNA的同步快速擴(kuò)增,為PIF中克羅諾桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測(cè)提供了快速、靈敏、特異的檢測(cè)方法,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。