生物功能化碳量子點(diǎn)制備

楊 佩 許 斌 孫清江

(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 南京210096)(東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京210096)

碳量子點(diǎn)或碳點(diǎn)是一種新型零維碳納米材料，其尺寸小于10 nm．Xu等[1]在分離與提純單層碳納米管時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了碳量子點(diǎn)．碳量子點(diǎn)具有優(yōu)良的光化學(xué)性能、良好的生物相容性、低毒性和易于表面修飾等優(yōu)點(diǎn)，因此在生物成像、生物傳感器以及納米載體等方面有著廣泛的應(yīng)用[2-4]．通常碳量子點(diǎn)表面擁有不同的功能團(tuán)，例如，羧基、羥基以及氨基等[5]，表面基團(tuán)單一性有利于碳量子點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾和生物偶聯(lián)，通過不同的方法可以實(shí)現(xiàn)碳量子點(diǎn)表面基團(tuán)的單一化，如：通過聚乙烯亞胺(PEI)可合成富含氨基的碳量子點(diǎn)[6]，利用氯乙酸鈉(ClCH2COONa)可制備得到富含羧基的碳量子點(diǎn)[7]．這些基團(tuán)不但使碳量子點(diǎn)具有很好的水溶性，同時(shí)也有利于具有生物功能的分子對碳量子點(diǎn)的功能化[8]．

近年來，作為新一代的診療技術(shù)，“精準(zhǔn)醫(yī)療”由于其準(zhǔn)確性和快捷性的特點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注[9]．碳量子點(diǎn)經(jīng)生物功能化后，不僅擁有碳點(diǎn)本身的優(yōu)異的熒光、物理和化學(xué)性質(zhì)，還能具有特定生物功能，如癌細(xì)胞靶向和細(xì)胞核靶向等能力．這些功能可極大地?cái)U(kuò)展碳點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)靶向藥物運(yùn)輸以及特定位置的熒光成像分析．碳量子點(diǎn)尺寸一般在10 nm以下，非常易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器靶向定位甚至進(jìn)入到細(xì)胞核中仍然是個(gè)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)[10]．

PEG是一種呈中性的水溶性聚合物分子，具有良好的生物相容性，被廣泛地用作修飾或摻雜分子以提高生物材料的生物相容性[11-12]．修飾PEG的方法大致可分為2類：一步合成和二步修飾．一步合成方法主要將PEG作為碳量子點(diǎn)合成的碳源或鈍化劑，使得碳量子點(diǎn)在合成后含有PEG，擁有良好的生物相容性[13]；二步修飾方法是在合成碳量子點(diǎn)后，再將PEG作為可修飾的功能分子，通過共價(jià)鍵偶聯(lián)至碳量子點(diǎn)表面，PEG能很好地保持其分子的完整性，對碳量子點(diǎn)的物理、化學(xué)和熒光等方面的穩(wěn)定性有著很大的提升，提高了碳量子點(diǎn)的抗環(huán)境干擾能力[14]．TAT被用作經(jīng)典的核定位信號序列，可用于實(shí)現(xiàn)碳量子點(diǎn)作為納米載體對細(xì)胞核靶向的功能[15]．FA是一種典型的細(xì)胞靶向分子，能與細(xì)胞膜上的葉酸受體相結(jié)合，促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞，而癌細(xì)胞表面擁有過度表達(dá)的葉酸受體，可以通過FA實(shí)現(xiàn)被癌細(xì)胞攝取的能力[16]．

本文用預(yù)先羧基化處理的碳量子點(diǎn)(CD)修飾生物分子PEG，TAT和FA，制備了生物功能化的碳量子點(diǎn)．第1步利用羧基與氨基的EDC/NHS反應(yīng)一步在羧基化的碳量子點(diǎn)表面偶聯(lián)上PEG和TAT，制備了具有良好生物相容性和細(xì)胞核靶向的水溶性碳量子點(diǎn)(TAT-CD-PEG)．第2步通過TAT-CD-PEG上PEG部分的羥基與FA的羧基之間的酯化反應(yīng)，將FA修飾至TAT-CD-PEG的表面，為碳量子點(diǎn)提供癌細(xì)胞受體介導(dǎo)內(nèi)吞的功能，最終制備得到PEG，TAT和FA修飾的具有生物功能的碳量子點(diǎn)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

主要試劑包括：合成碳量子點(diǎn)的原材料檸檬酸(CA)和乙二胺(EDA)，氫氧化鈉(NaOH)，氯乙酸鈉(ClCH2COONa)，聚乙二醇(PEG)，葉酸(FA)，核定位肽(TAT)，EDC，NHS，PB緩沖液(pH=8.0)．實(shí)驗(yàn)所有試劑均為分析純，所用水均為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm．

主要儀器包括：F-7000型熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)； ZS90型電位粒度分析儀(美國Malvern公司)；紅外光譜儀(美國Thermo 公司)；TSC-SP8型共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；冷凍干燥機(jī)(中國北京醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；CT18RT型離心機(jī)(美國Techcomp公司)；KQ-500DB型超聲波振蕩儀(中國昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)．

1.2 碳量子點(diǎn)的制備

碳量子點(diǎn)合成根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[17]，以檸檬酸為碳源，乙二胺為表面鈍化劑，通過水熱法合成，具體方法為：合成所用檸檬酸與乙二胺以摩爾比為1∶4溶于50 mL水中，再將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在180 ℃條件下加熱5 h；待冷卻至室溫后，將得到的碳量子點(diǎn)原液用分子截留量為1 kDa的透析袋透析2 d，除去未反應(yīng)完全的反應(yīng)物；最后將透析后的碳量子點(diǎn)溶液用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行濃縮，得到純化后的碳量子點(diǎn)溶液．

1.3 碳量子點(diǎn)羧基化

將1 mg/mL的碳量子點(diǎn)溶液與含有125 mg NaOH和125 mg ClCH2COONa的水溶液混合，水浴超聲3 h；再將此碳量子點(diǎn)溶液用稀HCl調(diào)節(jié)pH值至中性后，用分子截留量為1 kDa的透析袋透析1 d，經(jīng)冷凍干燥濃縮后得到羧基化的碳量子點(diǎn)溶液．

1.4 熒光量子產(chǎn)率計(jì)算

碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率通過以下公式計(jì)算得到：

式中，Q,QR分別為待計(jì)算物質(zhì)和參照熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；I,IR分別為待計(jì)算物質(zhì)和參照熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度；A,AR分別為待計(jì)算物質(zhì)和參照熒光物質(zhì)的吸收強(qiáng)度;n,nR分別為待計(jì)算物質(zhì)和參照熒光物質(zhì)的折射率．本文選取的參照熒光物質(zhì)為硫酸奎寧，當(dāng)以360 nm為激發(fā)波長時(shí)，硫酸奎寧在0.1 mol/L的硫酸溶液中的熒光量子產(chǎn)率為0.54．碳量子點(diǎn)與硫酸奎寧的溶劑折射率均為1.33，為最小化吸收帶來的影響，取碳量子點(diǎn)吸收值強(qiáng)度小于0.1，以此計(jì)算得碳量子點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率．

1.5 TAT-CD-PEG制備

將1 mg/mL羧基化后的碳量子點(diǎn)溶液與含有15 mg EDC和10 mg NHS的水溶液混合，水浴超聲1 h，對碳量子點(diǎn)表面的羧基進(jìn)行活化；往活化后的碳量子點(diǎn)溶液中同時(shí)加入20 mg/mL的PEG溶液和4 mg/mL的TAT溶液，攪拌24 h，用分子截留量為2 kDa的透析袋透析1 d，經(jīng)冷凍干燥濃縮后得到PEG和TAT修飾的碳量子點(diǎn)(TAT-CD-PEG)．

1.6 FA偶聯(lián)TAT-CD-PEG

通過FA一端的羧基與TAT-CD-PEG表面的羥基之間的酯化反應(yīng)，將FA修飾至TAT-CD-PEG表面．具體實(shí)驗(yàn)過程如下:將FA溶于pH為8.0的PB緩沖液中，得到濃度為1 mg/mL的FA溶液，與含有10 mg EDC和15 mg NHS的PB緩沖液混合，活化FA上的羧基1 h；隨后往活化后的FA溶液中加入4 mg/mL的TAT-CD-PEG溶液，室溫避光環(huán)境下攪拌24 h，用分子截留量為1 kDa的透析袋透析1 d，經(jīng)冷凍干燥濃縮后得到TAT-CD-PEG-FA．

1.7 細(xì)胞成像

HeLa細(xì)胞擁有較大的細(xì)胞核，將其選作成像用細(xì)胞．分別完成了TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA與HeLa細(xì)胞培養(yǎng)2組實(shí)驗(yàn)．在HeLa細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入0.1 mg/mL的TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA溶液與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)，分別培養(yǎng)2, 4, 6, 12 h后，用PB緩沖液沖洗，并用多聚甲醛將細(xì)胞固定，用核酸染料Syto 9對HeLa細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過共聚焦顯微鏡觀察成像結(jié)果．用405 nm激發(fā)波長激發(fā)TAT-CD-PEG-FA熒光，收集440～460 nm范圍內(nèi)發(fā)射的熒光，488 nm激發(fā)波長激發(fā)Syto 9，收集490～510 nm范圍內(nèi)發(fā)射的熒光．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 CD的性質(zhì)

圖1對CD的性質(zhì)進(jìn)行了表征．由CD的熒光光譜(見圖1(a))可看出，該CD沒有激發(fā)波長依賴性，在以320～380 nm波長激發(fā)時(shí)，CD的發(fā)射波長在450 nm處，屬于藍(lán)光波長范圍，在紫外燈照射下CD呈明亮的藍(lán)色熒光(見圖1(b))．該CD具有良好的熒光性質(zhì)．對CD的吸收(見圖1(c))進(jìn)行了測定，CD在350 nm處有非常明顯的吸收峰，并且通過CD在360 nm處的吸收值，由熒光量子產(chǎn)率公式計(jì)算出CD的熒光量子產(chǎn)率為 25%．進(jìn)一步對CD進(jìn)行了TEM表征(見圖1(d))，從TEM照片可以看出CD具有很好的單分散性，經(jīng)粒徑統(tǒng)計(jì)(見圖1(e))，CD的尺寸為(1.4±0.5) nm．通過熒光特性和粒徑分析可以得知CD具有良好的光學(xué)性質(zhì)，并且具有較小且均一的尺寸分布和良好的單分散性，可用于進(jìn)一步的生物功能化．

(a) 熒光光譜

(b) 熒光照片

(c) 吸收光譜

(d) TEM

(e) 粒徑統(tǒng)計(jì)

圖1 CD性質(zhì)表征

2.2 TAT-CD-PEG-FA的熒光和紅外表征

圖2 TAT-CD-PEG-FA制備示意圖

(a) 熒光光譜

(b) 紅外光譜

2.3 TAT-CD-PEG-FA的物理化學(xué)性質(zhì)

制備完成TAT-CD-PEG-FA后，使用電位粒度分析儀對其Zeta電位與DLS進(jìn)行了測量．從Zeta電位圖譜(見圖4(a))中可看出，CD生物功能化前后的Zeta電位發(fā)生了變化，由最初CD的-24.3 mV到TAT-CD-PEG的-3.2 mV，再到TAT-CD-PEG-FA的2.4 mV，表明CD在進(jìn)行兩步生物功能化之后Zeta電位呈中性．水動(dòng)力尺寸(見圖4(b))從最初的4.1 nm 到最后的6.1 nm，表明在生物功能化后CD的水合動(dòng)力尺寸有略微增加，仍保持了較小的水合動(dòng)力尺寸．為了確保TAT-CD-PEG-FA能應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)，對其進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，MTT實(shí)驗(yàn)(見圖4(c))表明在不同濃度TAT-CD-PEG-FA條件下，細(xì)胞存活率在95 %以上，表明該TAT-CD-PEG-FA具有低毒性．納米材料在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行應(yīng)用需要滿足以下特點(diǎn)：① 低毒性，保證材料在進(jìn)入細(xì)胞后，不會(huì)對細(xì)胞生存和正常的代謝活動(dòng)產(chǎn)生較大的影響或殺死細(xì)胞；② 生物相容性好，良好的生物相容性能使納米材料更容易進(jìn)入細(xì)胞；③ 小尺寸，尺寸越大進(jìn)入細(xì)胞的難度越大，甚至有可能引起細(xì)胞的免疫應(yīng)答，小尺寸的納米材料更容易被細(xì)胞吞噬進(jìn)細(xì)胞內(nèi)；④ 呈電中性，細(xì)胞內(nèi)有各種帶電的蛋白，呈正電或負(fù)電的納米材料進(jìn)入細(xì)胞容易通過經(jīng)典作用被細(xì)胞的蛋白吸附，造成非特異性吸附，不利于納米材料在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的功能．本文中合成的CD本身具有小尺寸和低毒性的特點(diǎn)，經(jīng)過PEG和FA生物功能化修飾后不僅能提高CD的生物相容性，還能提高CD進(jìn)入細(xì)胞的效率．經(jīng)生物功能化后，TAT-CD-PEG-FA仍然具有較小的水合動(dòng)力尺寸，并且?guī)щ娦猿手行?，可將此TAT-CD-PEG-FA應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)．

2.4 細(xì)胞成像

將未修飾FA的碳點(diǎn)TAT-CD-PEG和生物功能化碳量子點(diǎn)TAT-CD-PEG-FA分別與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)2組實(shí)驗(yàn)對比驗(yàn)證TAT-CD-PEG-FA 上的FA能通過癌細(xì)胞表面的FA受體實(shí)現(xiàn)對TAT-CD-PEG-FA的快速內(nèi)吞和TAT-CD-PEG-FA的細(xì)胞核靶向作用．通過共聚焦顯微鏡觀察所制備的TAT-CD-PEG-FA在2組細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中癌細(xì)胞受體介導(dǎo)內(nèi)吞的功能與細(xì)胞核靶向的能力．在共聚焦顯微鏡成像結(jié)果(見圖5)中，藍(lán)色熒光為碳量子點(diǎn)熒光，綠色熒光為細(xì)胞核染料Syto 9的熒光．可以看出，TAT-CD-PEG與HeLa細(xì)胞培養(yǎng)4 h后細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的CD藍(lán)色熒光；12 h后細(xì)胞核中CD的藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)．而TAT-CD-PEG-FA與HeLa細(xì)胞培養(yǎng)2 h后細(xì)胞質(zhì)中已出現(xiàn)明顯的碳量子點(diǎn)藍(lán)色熒光，6 h后細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯CD藍(lán)色熒光，12 h后細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中碳量子點(diǎn)藍(lán)色熒光相對6 h時(shí)無明顯變化．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD修飾FA使癌細(xì)胞更易于攝取CD，提高了CD進(jìn)入細(xì)胞的速度，而TAT的修飾使CD具有細(xì)胞核靶向的功能．

(a) Zeta電位

(b) DLS

(c) MTT實(shí)驗(yàn)

圖4 物理化學(xué)性質(zhì)表征

(a) TAT-CD-PEG與細(xì)胞培養(yǎng)2 h

(b) TAT-CD-PEG與細(xì)胞培養(yǎng)4 h

(c) TAT-CD-PEG與細(xì)胞培養(yǎng)6 h

(d) TAT-CD-PEG與細(xì)胞培養(yǎng)12 h

(e) TAT-CD-PEG-FA與細(xì)胞 培養(yǎng)2 h

(f) TAT-CD-PEG-FA與細(xì)胞 培養(yǎng)4 h

(g) TAT-CD-PEG-FA與細(xì)胞 培養(yǎng)6 h

(h) TAT-CD-PEG-FA與細(xì)胞 培養(yǎng)12 h

圖5 細(xì)胞成像熒光共聚焦圖片

3 結(jié)論

1) 碳量子點(diǎn)具有良好的熒光性質(zhì)且具有低毒性、生物相容性好和易于表面修飾的特點(diǎn)，使得碳量子點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)離子、生物分子的檢測與細(xì)胞熒光成像方面的應(yīng)用有著明顯的優(yōu)勢．對碳量子點(diǎn)進(jìn)行功能化，不僅能提升碳量子點(diǎn)的性質(zhì)，還能賦予碳量子點(diǎn)特殊功能，擴(kuò)展碳量子點(diǎn)在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用．

2) 本文合成了熒光性質(zhì)優(yōu)異的碳量子點(diǎn)，為了使碳量子點(diǎn)在細(xì)胞熒光成像分析中的應(yīng)用更為廣泛，對預(yù)先羧基化處理的碳量子點(diǎn)通過共價(jià)修飾的方式進(jìn)行了生物功能化．PEG，TAT和FA的修飾分別賦予了碳點(diǎn)良好的生物相容性、細(xì)胞核靶向和易于被癌細(xì)胞攝取的能力，成功制備了生物功能化碳量子點(diǎn)(TAT-CD-PEG-FA)．該生物功能化的碳量子點(diǎn)具有電中性、小尺寸、低毒性的特點(diǎn)和細(xì)胞核靶向的能力，并且能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光成像分析．

3) 良好的物理化學(xué)性質(zhì)保證了生物功能化碳點(diǎn)有望被用作納米示蹤劑，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的癌癥標(biāo)志物或特殊藥物靶點(diǎn)的高分辨原位熒光成像分析．該生物功能化碳量子點(diǎn)可作為納米載體，實(shí)現(xiàn)對抗癌藥物指定位置的運(yùn)輸，達(dá)到“精準(zhǔn)醫(yī)療”的目的．

DOI:10.1039/c6ra11660d.

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