五味子乙素對(duì)LPS誘導(dǎo)小神經(jīng)膠質(zhì)BV-2細(xì)胞損傷保護(hù)的機(jī)制研究

吳 靖，續(xù) 蕾

0 引言

五味子乙素(Schisandrin B)是一種來源于中草藥五味子的活性物質(zhì)，屬于脂素類物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素具有廣泛的藥理活性，其中以抗炎效果較為顯著[1-3]。研究還證實(shí)，五味子乙素對(duì)短暫性局部腦缺血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[4]，能改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能。Traf6/TAK1信號(hào)通路的活化在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。Traf6作為一種銜接蛋白可以介導(dǎo)LTR4信號(hào)的傳導(dǎo)，最終激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[5-6]。為了探討五味子乙素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)是否具有保護(hù)作用，本文以LPS作用小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞BV-2誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥損傷模型，通過觀察細(xì)胞增殖抑制率、炎癥因子及炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，探究五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料 小神經(jīng)膠質(zhì)BV-2細(xì)胞購買于武漢巴菲爾生物科技有限公司；五味子乙素(北京博奧森生物科技有限公司，純度98%，批號(hào)：61281-37-6)；脂多糖LPS(美國Sigma公司，批號(hào)：A0267975)；CCK8試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號(hào)：59-20061)；ELISA試劑盒(深圳寶安康生物科技有限公司，批號(hào)：HSP-70)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(長沙贏潤生物科技有限公司，批號(hào)：P0006)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司，批號(hào)：P0012A)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：HS30809)；β-actin、iNOS、COX-2、Traf6、TAK1及p-TAK1一抗均購自英國Abcam公司；對(duì)應(yīng)二抗購自上海谷歌生物有限公司。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀(美國寶特公司，型號(hào)：ELX808IU)；單人超凈臺(tái)(廣州瀘瑞明儀器有限公司，型號(hào)：SW-CJ-1C)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司，型號(hào)：HERAcell 2401)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD，批號(hào)：LI-COR ODYSSEY)。

1.3 BV-2細(xì)胞培養(yǎng) 將單人超凈工作臺(tái)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)物品紫外光照30 min，復(fù)蘇BV-2細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，1%的100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液1次，培養(yǎng)3～4 d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，分為空白對(duì)照組(C組)、LPS誘導(dǎo)模型組(M組)、LPS+10 μmol/L五味子乙素組(SL組)、LPS+20 μmol/L五味子乙素組(SM組)、LPS+40 μmol/L五味子乙素組(SH組)，培養(yǎng)24 h后吸凈舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μl含10 μl CCK9試劑的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后在波長450 nm處的酶標(biāo)儀中測定每孔吸光度值。

1.5 細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平檢測 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞分組、培養(yǎng)按“1.4”項(xiàng)下操作，收集細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒操作說明書進(jìn)行IL-6、TNF-α水平檢測。

1.6 免疫印跡檢測蛋白水平 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)后，取適量細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞分組、培養(yǎng)按“1.4”項(xiàng)下操作，收集細(xì)胞，裂解，離心，收集上清，檢測蛋白濃度。然后每孔上樣50 μg，進(jìn)行電泳分析，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜及蛋白表達(dá)分析。

2 結(jié)果

2.1 五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞增殖的作用 由圖1可見，LPS能明顯抑制BV-2細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞相對(duì)存活率，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在經(jīng)過不同劑量的五味子乙素(10、20、40 μmol/L)干預(yù)后，BV-2細(xì)胞的相對(duì)存活率明顯升高，與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細(xì)胞相對(duì)存活率升高，見圖1。

圖1 五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞增殖的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

2.2 五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 由表1可見，LPS能夠明顯誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞釋放炎癥因子IL-6、TNF-α，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在經(jīng)過不同劑量的五味子乙素處理后，BV-2細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α的水平顯著降低，與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α的水平減少，見表1。

表1 五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞炎癥因子釋放的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

2.3 五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞中炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響 由圖2可見，LPS能夠明顯誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白iNOS、COX-2的上調(diào)，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在經(jīng)過不同劑量的五味子乙素處理后，BV-2細(xì)胞iNOS、COX-2水平顯著降低，與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細(xì)胞iNOS、COX-2的表達(dá)量降低。

圖2 五味子乙素對(duì)iNOS和COX-2蛋白表達(dá)水平的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

2.4 五味子乙素對(duì)BV-2細(xì)胞中Traf6/TAK1信號(hào)通路的影響 由圖3可見，LPS能夠明顯誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞中Traf6、TAK1磷酸化水平的上調(diào)，與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在經(jīng)過不同劑量的五味子乙素處理后，BV-2細(xì)胞中Traf6、TAK1磷酸化水平顯著降低，與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且隨著藥物劑量的增加，BV-2細(xì)胞中Traf6、TAK1磷酸化水平降低。

3 討論

目前，關(guān)于阿爾茨海默癥(AD)發(fā)病機(jī)制的闡述較為淺顯，而慢性炎癥反應(yīng)是誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的主要病因之一。BV-2細(xì)胞是腦組織中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)受到刺激因素作用時(shí)會(huì)被異常激活，其作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：其一，表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞細(xì)胞功能吞噬Aβ，降低神經(jīng)團(tuán)塊的形成；其二，其產(chǎn)生的大量炎癥因子誘發(fā)神經(jīng)元的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)變性[7-9]。因此，干預(yù)BV-2細(xì)胞的活化或抑制其炎癥因子的釋放，可能對(duì)預(yù)防AD及改善該疾病的進(jìn)展具有重要意義。

圖3 五味子乙素對(duì)Traf6/TAK1信號(hào)通路活化的影響(n=6)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與SL組比較，P<0.05；▲與SM組比較，P<0.05

轉(zhuǎn)錄生長因子-β活化激酶1(TAK1)受多種因素的刺激，可以介導(dǎo)胞外信號(hào)的傳導(dǎo)，TGF-β、TLR、CD4及B細(xì)胞受體等細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)均可由TAK1的磷酸化發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[10]。研究表明，Traf6表達(dá)水平上升可促使TAK1的磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥、凋亡及氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生[11]。并且Trfa6/TAK1通路可介導(dǎo)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)激活NF-κB炎癥通路[5-6]。本實(shí)驗(yàn)中，采用LPS誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞模型，經(jīng)過不同濃度五味子乙素干預(yù)后，可明顯降低炎癥因子IL-6、TNF-α的釋放，還抑制了炎癥相關(guān)蛋白iNOS、COX-2的表達(dá)，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠通過調(diào)節(jié)Trfa6/TAK1信號(hào)通路，降低活化的BV-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子的產(chǎn)生，從而對(duì)慢性炎癥性神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)炎癥角度探討了五味子乙素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。五味子乙素可能通過抑制Traf6/TAK1通路活化對(duì)BV-2細(xì)胞激活進(jìn)行調(diào)控。本文闡述了該化合物的抗炎作用機(jī)制，可能為AD等神經(jīng)退行性疾病治療提供新的思路，也為五味子乙素的臨床應(yīng)用提供新的方向。