Wnt/β-catenin、RANKL/LGR4通路因子在骨質(zhì)疏松性骨折端的表達

曹燕明 王斌 金晶 鄭聰 黎明明 魏嘯 胡海瀾 凌龍

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科二區(qū)，廣東 廣州 510260

隨著人口老齡化的增加，骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)的發(fā)病率逐年升高。據(jù)統(tǒng)計，我國65歲以上的老年人在無意識跌倒時，有87%會發(fā)生OPF，與對照組相比，OPF愈合時間遲緩，骨折固定難度增加，骨不連及再骨折發(fā)生率較高[1]。因此，研究OPF的發(fā)病、愈合因素，已經(jīng)成為臨床的迫切需要。成骨和破骨成為防治骨質(zhì)疏松癥的熱點。Wnt/β-catenin通路中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc是關(guān)鍵的成骨因子[2,3]。RANKL/LGR4通路中LGR4、RANKL是調(diào)控破骨分化的關(guān)鍵因子[4]。本研究擬采用RT-PCR、Western blotting技術(shù)檢測比較OPF組與對照組患者骨折端骨組織LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、RANKL、LGR4的表達差異，探討OPF的發(fā)病機制及影響因素。

1 材料和方法

1.1 研究對象及受試基本條件

本研究選擇2016年1月至2017年7月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科就診的股骨骨折患者56例，對照組患者29例；OPF組患者27例?；颊邆熬邆湔；顒幽芰巴耆袷滦袨槟芰?，無精神及認(rèn)知障礙，X線等影像學(xué)確診為骨折，需要切開或有限切開復(fù)位內(nèi)固定或關(guān)節(jié)置換術(shù)，同意為本研究受試。并簽署知情同意書告知研究涉及的相關(guān)事宜。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1OPF組入組標(biāo)準(zhǔn)：①滿足受試基本條件。②雙能X線骨密度儀(DXA)測量，T值≤-2.5，診斷為骨質(zhì)疏松癥；③受傷過程滿足脆性骨折定義，即低能量或者非暴力骨折。

1.2.2對照組入組標(biāo)準(zhǔn)：①滿足受試基本條件。②雙能X線骨密度儀(DXA)測量，T≥-1.0；

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴發(fā)有嚴(yán)重慢性疾?。喝缰?、重度慢性阻塞性肺疾病、心力衰竭、腦梗死等。②患有各種可致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的內(nèi)分泌性疾??；患有影響鈣和維生素D吸收和調(diào)節(jié)的疾病，如患有消化道、腎臟疾病、骨髓瘤或其他惡性疾病。③1年內(nèi)長期接受雙膦酸鹽類、雌激素、PTH等抗骨質(zhì)疏松藥物或者激素治療的患者。④因病情需要，術(shù)式不暴露骨折端的或難以取骨的患者。

1.3 骨組織標(biāo)本收集

患者在傷后3～7 d內(nèi)根據(jù)骨折類型分別行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(25例)、有限切開骨折復(fù)位髓內(nèi)釘內(nèi)固定術(shù)(24例)、切開復(fù)位鋼板內(nèi)固定術(shù)(7例)。術(shù)中于骨折斷面內(nèi)用刮匙刮取骨折處骨組織≥200 mg，迅速放入小液氮瓶中。

1.4 實驗主要儀器及試劑

1.4.1儀器：紫外分光光度計：Nano Drop Technologies，USA；PCR 儀、CLINX凝膠成像儀、垂直電泳儀、熒光定量PCR儀：美國伯樂公司。

1.4.2試劑：RNAiso Plus、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PrimeScript RT Master Mix：Taraka公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：上海碧云天公司；Tublin Beta Polyclonal Antibody：四正柏生物公司；LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、LGR4、RANKL一抗抗體：Abcam公司；GAPDH內(nèi)參、二抗Peroxidase-conjugated Goat Anti-Mouse leggy、Goat Anti-Rabbit(H+L)Pyroxenitic、Rabbit anti-Goat IgG-HRP：愛必信(上海)生物科技有限公司。

1.5 RT-PCR過程：

1.5.1RNAiso Plus法提取骨組織內(nèi)總RNA、定量：取骨樣品100 mg，加液氮研磨，勻漿，室溫靜置5 min。4℃下12,000 g離心5 min。加入氯仿0.2 mL。振蕩15 s，15到30 ℃孵育5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min。將水相上層移至無RNA酶離心管中。加等體積異丙醇，混勻后15～30 ℃孵育10 min后，于4 ℃下12 000 r/m離心10 min。移去上清液，加入1 mL的75%乙醇?；靹?，4 ℃下7,500×g 離心5 min后棄去上清，室溫干燥5～10 min。加入無RNA酶的水40 μL，獲得RNA溶液。用DEPC水做空白標(biāo)記，光度計檢測讀取OD比值介于1.8～2.0之間。

1.5.2逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2 μL，1×Total RNA 1μg，RNase Free dd H2O up to 10 μL。輕柔混勻后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，4 ℃ 持續(xù)。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計、賽默飛公司合成的引物(序列見表1)，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL, PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)7.5 μL，RT反應(yīng)液(cDNA溶液)2 μL，滅菌蒸餾水4.5 μL，Total 15 μL。預(yù)變性Repeat：95 ℃，30 s，PCR反應(yīng) Repeat：40，95 ℃，5s，60 ℃，30～60 s。選擇GAPDH做基因相對表達分析的內(nèi)參基因，結(jié)果使用QPCR儀自帶Rotor-Gene Q Software進行計算所有樣品的Ct值，采用2-ΔΔCT表示OPF組目的基因相對對照組樣本表達變化的倍數(shù)。

1.6 Western Blotting分析

1.6.1骨組織總蛋白的提取、濃度測定：在液氮保護下錘擊加研磨液氮中取出的骨組織100 mg，加入裂解液(骨組織/裂解液為1 mg/10 μL，蛋白裂解液：蛋白酶抑制劑為100∶1)，冰上裂解30 min，4℃12,000 r/min，離心30 min。吸取中間層，按照BCA蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的方法配制工作液，96空板內(nèi)操作上樣，檢測吸光度，后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出樣品蛋白的濃度。

1.6.2電泳、轉(zhuǎn)膜、顯影：根據(jù)分子量及相對內(nèi)參配置不同濃度的膠(LRP5、Runx2、C-myc選擇10%濃度的膠，內(nèi)參為GAPDH；β-catenin、LGR4選擇6%濃度的膠，內(nèi)參為Tublin；RANKL選擇10%濃度的膠，內(nèi)參為Tublin)。蛋白加上樣緩沖液(5×)，98 ℃加熱10 min，然后根據(jù)濃度各孔加入上樣量及蛋白Marker。電泳60 V 30 min，105V1.5 h。轉(zhuǎn)膜105 V 1.5 h。脫脂奶粉搖床封閉孵育1 h。然后把封閉過后的NC膜至于脫色搖床上一抗(根據(jù)Abcam試劑說明書的比例)4 ℃過夜14～16 h，取出膜用tbst溶液洗滌，后室溫把膜至于脫色搖床上二抗(根據(jù)對應(yīng)抗體)孵育1 h，后取出膜用tbst溶液洗滌。將膜置于CLINX凝膠成像儀中發(fā)光顯影。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 引物序列表Table 1 List of the primer sequences

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

患者一般資料見表2。

表2 對照組和OPF組內(nèi)一般資料比較Table 2 Comparison of general data between control group and OPF group

從表2可以看出本次納入研究的對照組患者以男性居多，OPF組患者以女性居多，符合該類疾病臨床發(fā)病率規(guī)律。年齡、身高、體重P值>0.05，兩組之間無差異性。對照組骨密度正常，OPF組骨密度T值<-2.5。

2.2 各組患者骨組織各因子檢測表達比較

RT-PCR檢測OPF組對比對照組患者LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、LGR4表達降低(P<0.05)，RANKL表達升高(P<0.05)(圖1)。

圖1 對照組和OPF組患者mRNA表達情況Fig.1 mRNA expression of patients in control group and OPF group

Western blotting檢測OPF組對比對照組患者LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc、LGR4表達降低(P<0.05)，RANKL表達升高(P<0.05)(圖2、3)。

圖2 對照組和OPF組目的基因蛋白的表達圖Fig.2 Expression of genes and proteins in control group and OPF group

圖3 對照組和OPF組目的基因蛋白的定量表達(Image J軟件定量對比灰度)Fig.3 Quantitative expression of genes and proteins in control group and OPF group (ImageJ software quantitative contrast grayscale)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種全身性的骨骼老化或廢用退化相關(guān)的代謝障礙性疾病，以骨量減少、結(jié)構(gòu)退化、脆性增加，易發(fā)生骨折為特征[5]。股骨頸OPF約占全身骨折的3.58%，骨質(zhì)疏松并發(fā)骨折致殘率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松癥病因包括內(nèi)分泌、遺傳、營養(yǎng)、廢用、藥物等各方面，直接原因是骨吸收和骨形成平衡機制打破，破骨細(xì)胞的骨吸收作用大于成骨細(xì)胞的骨形成作用，引起骨質(zhì)疏松癥并易發(fā)骨折[6]。在調(diào)控骨重建的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要包括調(diào)控成骨細(xì)胞的Wnt/β-Catenin信號通路和破骨細(xì)胞的RANKL/LGR4信號通路等[7]。

Wnt/β-cateinin信號通路與間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞關(guān)系密切[7-12]。典型通路包括Wnt家族分泌蛋白配體、卷曲受體(Frizzled)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)復(fù)合物、蓬亂蛋白(Dvl)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、直腸腺瘤性息肉蛋白(APC)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等胞內(nèi)蛋白，以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(Tcf)等一系列蛋白。如果Wnt信號關(guān)閉的情況下，游離的β-catenin與GSK-3β結(jié)合后磷酸化，隨后降解，此時的胞質(zhì)中的β-catenin水平較低[2]；如果Wnt信號通路被激活，Wnt與LRP5/6、Frizzled相互結(jié)合形成復(fù)合體，招募Dvl和降解復(fù)合物(由軸蛋白、APC、GSK-3β等組成)，抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化。未磷酸化的β-catenin逐漸積累，到一定的量就會進入細(xì)胞核和TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，激活下游靶基因并轉(zhuǎn)錄表達，如核心結(jié)合因子(Runx2)，原癌基因(C-myc)等[3]。

β-catenin是Wnt/β-catenin通路中最關(guān)鍵的成骨因子。Hill等[10]在小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中敲除β-catenin基因，發(fā)現(xiàn)小鼠的軟骨生成增加而成骨細(xì)胞生成減少，揭示了β-catenin對早期間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞定向分化是必需的。本實驗OPF組內(nèi)β-catenin表達下降，表明OPF組內(nèi)的Wnt/β-catenin通路處于抑制的狀態(tài)，這種狀態(tài)可能與OPF后成骨不足有關(guān)。Runx2是骨形成過程中最早和最具特異性的標(biāo)志基因，是決定骨脆性的重要因素[13]。Runx2能上調(diào)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的共同前體細(xì)胞中各種礦化相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，對軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨均有幫助[14]。Komori等[15]研究發(fā)現(xiàn)Runx2基因敲除的小鼠成骨分化即被阻斷。本實驗OPF組表達Runx2降低，說明Runx2的表達下調(diào)可能是影響OPF的因素。LRP5存在多種細(xì)胞膜表面[16]。van Meurs 等[17]研究發(fā)現(xiàn)LRP5的Met667和Val1330等位基因與腰椎、股骨頸的骨密度下降有關(guān)。Zhou等[18]對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的LRP5基因多態(tài)性與唑來膦酸反應(yīng)相關(guān)性進行研究分析，發(fā)現(xiàn)CC和CT基因型患者的骨密度、血清β-CTX和ALP顯著下降。本實驗發(fā)現(xiàn)OPF組LPR5的表達明顯減少，考慮骨硬化蛋白可能通過與LRP5/6的高度結(jié)合，使Wnt/β-catenin通路處于抑制狀態(tài)，導(dǎo)致骨形成受阻[19,20]，另外可能同時存在OPF后LRP5受體減少的情況。C-myc是Wnt/β-catenin通路下游的重要靶基因。C-myc的蛋白促進細(xì)胞周期從G1加速進入S期，促進成骨細(xì)胞分化增殖和分化，胞漿β-catenin的水平?jīng)Q定了與核內(nèi)C-myc的表達能否被激活[21]。本實驗檢測發(fā)現(xiàn)C-myc在OPF后表達下降，說明C-myc作為Wnt/β-catenin下游靶標(biāo)基因，可進一步從核內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平表明OPF組內(nèi)的Wnt/β-catenin通路處于抑制的狀態(tài)或成骨不足。

在RANKL/LGR4信號通路中，核因子κ B受體活化因子配體(RANKL)是目前研究發(fā)現(xiàn)僅有的具有刺激破骨細(xì)胞分化、成熟和阻止破骨細(xì)胞凋亡的因子[22-24]，G蛋白偶聯(lián)受體48(GPR48，又稱LGR4)是RANKL的一個重要受體，在破骨細(xì)胞分化過程中LGR4與RANK競爭結(jié)合RANKL，激活了Gαq和GSK3-β信號通路，抑制了破骨細(xì)胞生成過程中活化T細(xì)胞核因子的表達和活性，抑制了RANKL/RANK信號的破骨細(xì)胞分化和骨吸收[4]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，OPF患者骨組織內(nèi)RANKL表達上升，說明RANKL促進破骨細(xì)胞分化增強引起骨質(zhì)疏松。因而阻斷RANKL/RANK信號通路在OPF骨破壞中的作用，有重要的臨床意義，有研究對OPF患者用唑來膦酸鈉注射，30 d內(nèi)RANKL的水平呈現(xiàn)出下降的趨勢[25],這也與本實驗結(jié)果相符。敲除LGR4的小鼠顯示破骨細(xì)胞過度活化和骨質(zhì)破壞增加[26]；也有研究[27]認(rèn)為LGR4基因無突變情況下引起人類的骨礦物質(zhì)密度(BMD)降低，其分子機制尚不清楚。實驗發(fā)現(xiàn)LGR4在OPF組中表達下降，可能是LGR4抑制破骨和骨質(zhì)減少，可能是抑制了RANK信號。而RANKL在OPF組內(nèi)表達上升，這結(jié)果符合LGR4與RANK競爭結(jié)合RANKL，抑制了RANKL/RANK信號破骨的作用。既然LGR4是RANKL的受體，負(fù)向調(diào)控了破骨細(xì)胞分化和骨吸收，故LGR4可用于治療骨質(zhì)疏松癥和其他骨質(zhì)破壞疾病[7]。有研究[4]在骨質(zhì)疏松癥小鼠模型中LGR4胞外域(ECD)可以治療RANKL誘導(dǎo)的骨量丟失。而Denosumab是RANKL的一個抗體，有許多副作用，如鈣穩(wěn)態(tài)失衡和低鈣血癥[28,29]。有研究LGR4-ECD蛋白比骨保護素與RANKL結(jié)合親和力較低，對破骨細(xì)胞分化正常小鼠的生理負(fù)影響小，這表明LGR4能拮抗RANKL的副作用，以LGR4為靶標(biāo)的抑制劑影響成熟的破骨細(xì)胞[4]治療骨質(zhì)疏松癥具有較大的優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)OPF與Wnt/β-catenin成骨信號通路中LRP5、β-catenin、Runx2、C-myc因子成骨抑制或減弱有關(guān)，與RANKL/LGR4破骨信號通路中RANKL因子破骨增強、LGR4因子破骨抑制有關(guān)。藥物或其他治療可提高或限制這些相互作用的發(fā)展。對于骨質(zhì)疏松的患者，通過干預(yù)這些基因水平的變化，可以降低OPF發(fā)生的幾率，促進其骨折愈合，從而降低其并發(fā)癥的發(fā)生。