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    補腎健脾活血方含藥血清對UMR106細胞成骨分化和骨形成相關(guān)蛋白的影響

    2018-08-02 03:22:02柴生颋謝平金萬雷林勇
    中國骨質(zhì)疏松雜志 2018年3期
    關(guān)鍵詞:血清

    柴生颋 謝平金 萬雷 林勇

    1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510240 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實驗室,廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是臨床常見的骨疾病之一,它是以一種由于骨強度降低而使骨折風(fēng)險升高的全身性骨骼疾病,目前已在世界常見病多發(fā)病中居第七位,成為世界性前沿研究難題。且隨著老齡化社會的到來,OP的發(fā)病率目前正以驚人的速度增長,防治骨質(zhì)疏松癥已成為當今國際上的研究熱點。本實驗,補腎健脾活血方含藥血清對UMR106細胞成骨分化和骨形成相關(guān)蛋白的影響,以期從細胞分子學(xué)角度探討補腎健脾活血方(骨康方)防治OP的作用機理。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物及細胞

    購置UMR106細胞(上海中科院);4月齡 SD 雌性大鼠40只, 用于制備含藥血清。

    1.2 實驗藥物

    補腎健脾活血方(淫陽藿10 g、熟地黃10 g、肉蓯蓉10 g、大棗10 g、當歸10 g、 丹參10 g、菟絲子10 g、補骨脂10 g、黃芪10 g、白芍10 g),并在本院制劑室常規(guī)水煎制,濃縮,生藥含量為1.43 g/mL。陽性對照藥:戊酸雌二醇片(補佳樂,J20130009)。

    1.3 實驗試劑儀器及器械

    UMR106細胞完全培養(yǎng)基配制:DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone,Cat. No.SH 30022.01B)+10%胎牛血清(Gibco,Cat. No.10099-141)+1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素),4 ℃放置,37 ℃水浴溫浴后使用;CCK8檢測工作液配制:10 μL CCK8檢測原液+100 μL細胞完全培養(yǎng)基,混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;青鏈霉素,PBS緩沖液,胰酶(GENVIEW,Cat.No.9002-07-7),ALP測試盒南京建成(A059-1)Cell Counting Kit-8(Dojindo,Cat.No.CK04);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司);低速離心機(Anke/飛鴿TDL-80-2B);倒置顯微鏡(MOTI);CO2細胞培養(yǎng)箱(Memmer,INC108);酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(Thermo Fisher Scientific,multiscan MK3);ALP 測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn),A059-1)。上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品水平離心機 (上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品,TDL-80-2B);普通培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產(chǎn)品,DHP-02.420); HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市晨陽電子儀器廠,XMTD203);Thermo酶標儀(MULTISKAN MK3);pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司,02220128);臺式高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠,TDL-80-2B);恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠,DYY-6C);冷凍高速離心機(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司,Hema TGL-16R);氣一電流儀(JUNY1,JY300);容聲柜式冰箱(青島海爾特種電器有限公司,BD/C310);立式超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司,DW-86L486);掃描儀(MICROTEK,Bio-5000);AX-Ⅱ X射線攝影暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械, 127 mm×178 mm);SDS-PAGE垂直電泳槽(北京凱元伯樂生物科技有限公司,MP-8001);漩渦振蕩器(上海精科實業(yè)有限公司,XW-80 A);超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司,JY 92-IIN);多用脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司,XK-8);磁力攪拌器(常州國華電器有限公司,78);Tris-base、Glycine、 SDS(十二烷基硫酸鈉)(上海生工,TB0194-2.5KG/GB0235-2.5KG/SB0485-500G);PVDF膜(Millipore,IPVH00010);醫(yī)用X-光片(廣西巨星醫(yī)療器械有限公司,SUPER RX-N-C 5×7);Acrylamide(丙烯酰胺)、BIS-Acrylamide(雙丙烯酰胺)(Genview,GA006-500G/GN199-25G);Ammonium persulphate(過硫酸銨)(GENVIEW,GA019-50G);蛋白定量試劑盒(Thermo,23227);裂解液(碧云天,P0013);DTT(二硫代蘇糖醇)碧云天(ST040);PMSF(苯甲基磺酰氟)、溴汾藍(Genebase,329-98-6/ 115-39-9)。

    1.4 含藥血清的制備

    將4月齡 SD 雌性大鼠40只,隨機分成 5 組、每組 8只。低劑量組按2.4 g生藥 /kg 大鼠體重灌胃,中劑量組按4.8 g生藥 /kg 大鼠體重灌胃,高劑量組按9.6 g生藥 /kg;陽性對照組每只大鼠灌胃大約戊酸雌二醇片0.1 g/ kg(用生理鹽水溶至1 mL);空白血清組每只大鼠灌胃生理鹽水大約20 mL/ kg。每天2次, 間隔5 h,,連續(xù)6天。第7天進行腹主動脈取血,并分離血清,過濾后分裝,置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 UMR106細胞的培養(yǎng)

    ①UMR106 細胞體外培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(4 ℃放置,37 ℃水浴溫浴后使用),取出長至80%的UMR106細胞,吸掉舊培養(yǎng)液;用PBS洗滌細胞一至二次;加入胰酶溶液,輕洗細胞皿底部,吸掉胰酶溶液,放入37 ℃培養(yǎng)箱2~3 min,于倒置顯微鏡下觀察,當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時,加入新鮮完全培養(yǎng)基,使用移液器將細胞吹勻,制備單細胞懸液;②計數(shù),并將細胞密度調(diào)整為1×105/mL;取出96孔板,接種100 μL密度為1×105/mL的細胞懸液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜,次日,按:正常大鼠血清組;低劑量含藥血清組;中劑量含藥血清組;高劑量含藥血清組;陽性對照組;分組進行加藥,分別培養(yǎng)72 h。③細胞處理結(jié)束的前4 h,吸去培養(yǎng)液,按每100 μL完全培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8將二者混合均勻后,每孔加入100 μL的CCK-8混合液,避免產(chǎn)生氣泡,將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h,4h后,將96孔板中的培養(yǎng)基移至酶標板中,酶標儀檢測450 nm處的OD殖。

    1.6 ALP 活性的測定

    ALP 活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)A059-1)檢測各組細胞培養(yǎng)72 h后的ALP 活性,酶標儀上測定各孔A520 nm殖。并計算血清中ALP活力。

    計算公式:

    血清中AKP活力(金氏單位/100ml)=

    1.7 OPN、RUNX2、BMP-2蛋白檢測

    各組經(jīng)血清分別培養(yǎng)72 h后,按比例加入裂解液,充分裂解后,120 000 g離心2~5 min,取上清液。提取總蛋白,測定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1),100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別至于濃縮膠和分離膠中電泳,350mA轉(zhuǎn)膜70 min。37封閉液中封閉1 h;將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的OPN(稀釋比例1∶8000,轉(zhuǎn)膜條件:300 mA恒流轉(zhuǎn)膜35 min,廠家:Abcam,貨號:ab91655)抗體、RUNX2(稀釋比例1∶1000,轉(zhuǎn)膜條件:300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min,廠家:Abcam,貨號:ab23981)抗體、BMP-2(稀釋比例1∶4000,轉(zhuǎn)膜條件:300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min,廠家:Abcam,貨號:ab183729)抗體,25 mL TBST洗滌PVDF膜3次,每次5 min;將PVDF膜放入含有3 mL辣根過氧化物酶標記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi),置于搖床上室溫平緩搖動40 min(二抗:HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家:BOSTER,貨號:BA1054,稀釋比例:1∶20000,孵育條件:室溫孵育40 min)25 mL TBST洗滌PVDF膜3次,每次7 min;用化學(xué)發(fā)光顯色后進行圖像分析,經(jīng)軟件分析,以O(shè)PN/GAPDH、RUNX2/GAPDHBMP-2/GAPDH比值表示OPN、RUNX2、BMP-2蛋白表達水平

    1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 各組血清對UMR106細胞ALP活性的影響

    如表1所示,與空白血清組比較,中劑量血清組、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預(yù)72 h后,細胞吸光度值均較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與空白血清組比較,低、中、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預(yù)72 h后,細胞ALP活性均較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨著中藥血清水平升高,ALP活性越高。

    表1 各組血清對UMR106細胞增殖和ALP活性的影響Table 1 Effect of the serum on the cell proliferation and ALP activity in UMR106 cells of each group

    注: 與空白血清組比較,*P<0. 05

    2.2 各組UMR106細胞中的OPN、RUNX2、BMP-2蛋白水平

    3 討論

    骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是臨床常見的骨疾病之一,它是以一種由于骨強度降低而使骨折風(fēng)險升高的全身性骨骼疾病。由于骨質(zhì)疏松時骨強度下降,在生活中輕微外力作用下即可造成骨折,骨折作為OP最嚴重的并發(fā)癥和早期死亡的危險因素之一[1],給患者及社會帶來沉重負擔。

    圖1 各組UMR106細胞中的OPN、RUNX2、BMP-2蛋白水平注: 與空白血清組比較,*P<0. 05Fig.1 The protein concentrations of OPN, RUNX2, and BMP-2 in UMR106 cells of each group

    圖2 各組UMR106細胞中OPN、RUNX2、BMP-2表達凝膠電泳圖Fig.2 The expression of OPN, RUNX2, and BMP-2 in UMR106 cells in each group

    中醫(yī)認為OP屬于“骨痿”范疇,其病位在腎,發(fā)病關(guān)鍵是“腎虛”。隨著年齡增長,腎中精氣由充盛轉(zhuǎn)而逐漸衰敗,性腺功能亦隨之漸漸衰退。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論,結(jié)合臨床體會,我們認為腎虛是OP的主要病因,并由此篩選補骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子、黃芪等中藥組成了治療骨質(zhì)疏松癥的補腎健脾活血方(骨康方)。成骨細胞作為參與骨生成、生長、吸收及代謝的關(guān)鍵細胞,具有活躍的分泌功能,能合成和分泌骨基質(zhì)中的多種有機成分,對骨生長有重要作用;此外,細胞表面存在多種骨吸收刺激因子的受體,細胞并能分泌一些細胞因子,調(diào)節(jié)骨組織形成和吸收。因此,鑒定新的重要的成骨細胞生長調(diào)節(jié)因子,深入研究骨發(fā)育和骨重塑的分子機制,就顯得非常必要。我們在前期研究發(fā)現(xiàn),補腎健脾活血方(骨康方)可以增加PMOP患者骨密度[2],且其含藥血清對成骨細胞和破骨細胞均有影響,可改變細胞生存環(huán)境中OPG/ RANKL的比例,間接影響著破骨細胞的功能活性[3]。

    本實驗采用的大鼠類成骨細胞UMR106,保留了成骨細胞形態(tài)和性質(zhì)上獨有的特征,具有穩(wěn)定、均一、純度高、易于培養(yǎng)等優(yōu)點,現(xiàn)已廣泛用于代替成骨細胞的細胞系,并用于研究各種調(diào)控骨質(zhì)疏松的激素、生長因子在細胞水平上治療骨質(zhì)疏松的作用機制[4-6]。故本實驗選取UMR106作為代替成骨細胞,以研究補腎健脾活血方(骨康方),在促進成骨分化中的作用。堿性磷酸酶作為成骨細胞分化早期分泌和高表達的標志酶,具有一定的特異性標志[7]。本研究發(fā)現(xiàn),與空白血清組比較,低、中、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預(yù)72 h后,細胞吸光度值均較低(P<0.05), 而隨著含藥血清水平的增加,對UMR 106細胞增殖的促進作用相對減弱;與空白血清組比較,低、中、高劑量血清組和陽性對照組加藥干預(yù)72 h后,細胞ALP活性均較高(P<0.05),且隨著中藥血清水平升高,ALP活性越高。這充分說明骨康含藥血清對能明顯提高UMR 106的成骨分化,且劑量水平越高,ALP活性越高。

    OPN是一種分泌型的糖基化磷酸化蛋白,分子結(jié)構(gòu)較特殊,富含精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,包含大量高度保守功能序列,作為成骨細胞成熟和分化過程的標志性因子在細胞黏附和基質(zhì)礦化中發(fā)揮著重要作用[8]。RUNX2 作為成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和成骨細胞分化的關(guān)鍵因子,不僅能調(diào)節(jié)成骨細胞的分化,還可調(diào)節(jié)成骨細胞的成熟,在胚胎發(fā)育過程中,RUNX2 的表達是成骨細胞分化的開始,RUNX2 的缺失將導(dǎo)致骨發(fā)育不良或終止[9-10]。亦有研究[11]表明,BMP-2能夠促進成骨細胞的增殖和分化,具有高效的誘導(dǎo)成骨活性。本實驗結(jié)果中,經(jīng)補腎健脾活血方(骨康方)含藥血清培養(yǎng)后UMR106細胞OPN、RUNX2、BMP-2均顯著上調(diào),且呈濃度梯度性變化,各中藥含藥血清組以高劑量組表達最為明顯,這表明補腎健脾活血方(骨康方)能夠通過上調(diào)OPN、RUNX2、BMP-2從而促進UMR106細胞成骨分化。

    綜上所述,補腎健脾活血方(骨康方)含藥血清對成骨樣細胞UMR106成骨分化具有促進作用,并能上調(diào)OPN、RUNX2、BMP2等相關(guān)骨形成蛋白的表達。但OPN、RUNX2、BMP2因子表達上調(diào)后能否進一步激活成骨細胞特異性的下游靶基因、實現(xiàn)的具體途徑如何,還有待進一步的研究。細胞的調(diào)節(jié)作用表明其具有被開發(fā)為抗骨質(zhì)疏松藥物的潛力,下一階段將重點研究補腎健脾活血方(骨康方)含藥血清調(diào)節(jié)成骨樣細胞UMR106的分子機制,為補腎健脾活血方在防治OP方面,提供新的科學(xué)依據(jù)和實驗方法。

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