甘草多糖對(duì)小鼠及鼠傷寒沙門菌生長(zhǎng)性能的影響

付道斌，廖成水*，路 霞，王曉利，辛 玲，肖宜航，宋香朋

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023； 2.河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

抗生素在人和動(dòng)物疾病治療中發(fā)揮著極其重要的作用，但抗生素耐藥和藥物殘留問(wèn)題嚴(yán)重威脅著人類健康安全。微生態(tài)制劑、抗菌肽、酶制劑、中草藥制劑等作為飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中正在逐步替代抗生素，具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，越來(lái)越多的科研工作者試圖從天然動(dòng)植物中篩選出活性物質(zhì)開發(fā)新藥物[1]，其中天然植物活性多糖具有抗炎、抗瘤、抗病毒的功效，同時(shí)可以激活、增強(qiáng)和調(diào)節(jié)人體免疫能力，使得天然植物活性多糖的研究成為當(dāng)代醫(yī)藥生物技術(shù)的前沿領(lǐng)域之一。甘草素有“十方九草”之稱，被歷代名醫(yī)尊稱為“眾藥之王”，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明了黃酮類、三萜類和多糖類化合物是甘草的主要有效成分[2]。甘草多糖是甘草中的一類α-D-吡喃多糖，研究證明，甘草多糖可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬功能[3-4]。隨著對(duì)甘草多糖研究的不斷深入，甘草多糖的部分藥理作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。王麗榮等[5]研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射甘草多糖能明顯提高小鼠的生長(zhǎng)性能，但甘草多糖的理論研究和臨床應(yīng)用狀況仍不容樂觀。因此，將甘草多糖作為飼料添加劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)之前，需要加大甘草多糖的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究和臨床前期評(píng)價(jià)。本研究通過(guò)灌胃途徑給予小鼠甘草多糖，觀察小鼠生長(zhǎng)性能及破鼠傷寒沙門菌感染的情況，為甘草多糖作為飼料添加劑的應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、試驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

鼠傷寒沙門菌SL1344株由洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；6～8周齡昆明小鼠(18.0±2.0)g 138只，清潔級(jí)，購(gòu)自鄭州中原動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；甘草多糖購(gòu)自洛陽(yáng)藍(lán)斯利科技有限公司；胰蛋白胨和酵母浸出物購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；氯化鈉等其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 甘草多糖對(duì)小鼠臨床狀況及器官指數(shù)的影響測(cè)定

1.2.1 動(dòng)物分組 將72只小鼠隨機(jī)平均分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和對(duì)照組。低劑量組：按1 mg/kg劑量給予小鼠灌胃甘草多糖，每次0.2 mL。中劑量組：按10 mg/kg劑量給予小鼠灌胃甘草多糖，每次0.2 mL。高劑量組：按100 mg/kg劑量給予小鼠灌胃甘草多糖，每次0.2 mL。對(duì)照組：正常飼養(yǎng)。每日灌胃給藥一次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 臨床癥狀觀察 給予甘草多糖后每日觀察小鼠的臨床癥狀，分別于第3天、第5天和第7天用電子分析天平測(cè)定小鼠體質(zhì)量。

1.2.3 免疫器官及臟器指數(shù)的測(cè)定 分別于給藥后第3天、第5天和第7天處死小鼠并取出免疫器官(胸腺、脾臟)及其他臟器(肺臟、心臟、腎臟)組織，電子分析天平稱量各臟器組織質(zhì)量，臟器指數(shù)=小鼠臟器質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)。再取出肺臟組織置于60 ℃電熱恒溫干烤箱中烘烤72 h，電子分析天平稱量干質(zhì)量，計(jì)算濕/干質(zhì)量比值。

1.3 鼠傷寒沙門菌菌液制備

取凍干保存的鼠傷寒沙門菌SL1344劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。第2天挑取活化好的單克隆菌接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，利用無(wú)菌PBS洗滌菌液2次，備用。

1.4 甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌體外生長(zhǎng)影響的測(cè)定

1.4.1 鼠傷寒沙門菌生長(zhǎng)速度測(cè)定 將1.3中培養(yǎng)的鼠傷寒沙門菌轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基，分別加入終質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每1 h取樣涂板計(jì)數(shù)，至第10小時(shí)。用無(wú)菌PBS對(duì)樣品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，取100 μL稀釋后的菌液均勻涂布于LB固體平板上，每組做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，培養(yǎng)過(guò)夜后計(jì)數(shù)，取平均值計(jì)算原液的有效活菌數(shù)量，繪制鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)曲線。

1.4.2 鼠傷寒沙門菌生物被膜形成測(cè)定 采用96孔微孔板結(jié)晶紫染色法檢測(cè)鼠傷寒沙門菌生物被膜形成。將1.3中培養(yǎng)的鼠傷寒沙門菌轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶20比例轉(zhuǎn)接于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別加入終質(zhì)量濃度為10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖，溫箱孵育48 h，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照孔，每孔重復(fù)3次。孵育結(jié)束后，用無(wú)菌PBS輕輕洗滌3次除去未附著的細(xì)菌，晾干后加入1%結(jié)晶紫染色45 min，用蒸餾水洗去浮色，37 ℃放置10 min干燥，每孔用200 μL乙醇溶解，于590 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。同時(shí)將單克隆菌液轉(zhuǎn)接到含有40 mg/L剛果紅和20 mg/L考馬斯亮藍(lán)的無(wú)NaCl的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌的菌落形態(tài)。

1.5 鼠傷寒沙門菌對(duì)小鼠半數(shù)致死量(LD50)的測(cè)定

將36只小鼠平均隨機(jī)分為6組(5個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)無(wú)菌PBS組)，取1.3中培養(yǎng)的鼠傷寒沙門菌SL1344，無(wú)菌PBS連續(xù)5倍稀釋，選取合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度口服感染6只小鼠，每只200 μL，觀察直至無(wú)小鼠死亡，記錄死亡情況，根據(jù)Bliss法計(jì)算鼠傷寒沙門菌SL1344對(duì)小鼠LD50。

1.6 甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠保護(hù)力的測(cè)定

將30只小鼠隨機(jī)平均分為5組，按照1.2.1中方法設(shè)甘草多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組、PBS組和空白組。于給藥5 d后腹腔注射鼠傷寒沙門菌SL1344。正常飼喂小鼠，每隔12 h觀察其精神狀態(tài)及飲食狀況，連續(xù)觀察直至無(wú)小鼠死亡，記錄死亡情況。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草多糖對(duì)小鼠臨床狀況的影響

灌胃給予不同質(zhì)量濃度甘草多糖后的小鼠與健康對(duì)照組相比，精神狀態(tài)、采食量、飲水量、活動(dòng)量等一般臨床狀況均無(wú)明顯變化?？傮w上看，在第5天和第7天所有劑量組小鼠體質(zhì)量均有一定增高，但差異不顯著(表1)，在整個(gè)試驗(yàn)期間未見有其他并發(fā)癥，無(wú)小鼠死亡。

表1不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響

g

2.2 甘草多糖對(duì)小鼠免疫器官及其他臟器指數(shù)的影響

給予甘草多糖后小鼠免疫器官指數(shù)(胸腺和脾臟)高于正常對(duì)照組，但各時(shí)間點(diǎn)不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)小鼠胸腺指數(shù)影響均不顯著；給藥后第3天脾臟指數(shù)與正常對(duì)照組相比沒有顯著差異，但到第5天時(shí)，各質(zhì)量濃度甘草多糖可顯著增加小鼠的脾臟指數(shù)，而到第7天時(shí)只有高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)(表2)。肺臟、心臟、肝臟、腎臟等小鼠的其他臟器指數(shù)在給予甘草多糖后雖然有增高趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比差異均不顯著(表3和表4)。

表2 不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

注：與空白組相比，*表示P<0.05。

表3 不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)小鼠肺臟指數(shù)與肺臟濕/干質(zhì)量比值的影響

表4 不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)小鼠其他臟器指數(shù)的影響

2.3 甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌體外生長(zhǎng)的影響

甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌的影響如圖1所示，10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖在不同時(shí)間點(diǎn)與空白對(duì)照組相比均不同程度地促進(jìn)鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)，但差異不顯著。

圖1 不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌體外生長(zhǎng)的影響

2.4 甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌生物被膜形成的影響

當(dāng)添加不同質(zhì)量濃度甘草多糖培養(yǎng)48 h后，與空白對(duì)照組相比，隨著甘草多糖質(zhì)量濃度增加，鼠傷寒沙門菌在聚乙烯板孔內(nèi)形成生物被膜的量逐漸增加，但差異不顯著(圖2)。沙門菌生物被膜的主要成分為卷曲菌毛和纖維素，鼠傷寒沙門菌在剛果紅和考馬斯亮藍(lán)平板上能夠形成呈現(xiàn)紅色干燥粗糙型菌落。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加不同質(zhì)量濃度甘草多糖后鼠傷寒沙門菌菌落仍呈紅色粗糙型(圖3)，說(shuō)明甘草多糖對(duì)細(xì)菌的菌毛和纖維素的表達(dá)并無(wú)影響。

圖2 不同質(zhì)量濃度甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌生物被膜形成的影響

A—F：分別為0、10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖處理圖3 含剛果紅和考馬斯亮藍(lán)的無(wú)鹽LB固體平板上的菌落形態(tài)

2.5 鼠傷寒沙門菌對(duì)小鼠LD50測(cè)定結(jié)果

小鼠腹腔注射鼠傷寒沙門菌SL1344后第3天即可出現(xiàn)死亡，連續(xù)觀察記錄小鼠死亡情況，直至5 d內(nèi)未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，根據(jù)Bliss法計(jì)算得到腹腔注射鼠傷寒沙門菌SL1344對(duì)小鼠的LD50為2.09×105cfu/mL(表5)。

表5 鼠傷寒沙門菌SL1344對(duì)小鼠的毒力測(cè)定結(jié)果

2.6 甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠的影響

給予小鼠不同質(zhì)量濃度的甘草多糖，并在第5天腹腔感染100倍LD50的鼠傷寒沙門菌，所有感染組小鼠均出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、嗜睡、呆臥不動(dòng)、食欲降低等臨床癥狀，感染后第3天出現(xiàn)死亡。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖，腸壁變薄，腸道內(nèi)充滿氣體，腸系膜充血、粘連；脾臟腫大、淤血；肝臟腫大，表面顏色變暗，有出血點(diǎn)和出血斑；腎臟充血、腫大；肺臟腫脹，呈暗紅色。高劑量組小鼠感染后第9天全部死亡，低劑量和中劑量組均是第6天全部死亡，而PBS組則是在感染后第5天全部死亡(表6)，這提示甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠有一定的抵抗作用。

表6 甘草多糖對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠的影響

3 結(jié)論與討論

甘草多糖作為一種多糖類化合物具有多種生物活性，包括增強(qiáng)體液免疫功能、促進(jìn)吞噬作用、抗菌、抗補(bǔ)體、抗腫瘤、抗病毒以及對(duì)未感染的細(xì)胞無(wú)毒副作用等[6-7]，同時(shí)可以改善動(dòng)物機(jī)體代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、提高機(jī)體免疫力等[8]。董永軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)甘草多糖能促進(jìn)肉仔雞體質(zhì)量增加，提高其血清中新城疫抗體水平和血液中巨噬細(xì)胞吞噬功能。另外一項(xiàng)針對(duì)甘草多糖影響雛雞生長(zhǎng)性能的研究結(jié)果顯示，甘草多糖對(duì)雛雞生長(zhǎng)性能有一定的促進(jìn)作用，能夠增強(qiáng)雛雞的免疫力，其中質(zhì)量濃度為10 g/L的甘草多糖作用效果最顯著[10]。

雖然本研究結(jié)果顯示，甘草多糖對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能無(wú)顯著性影響，且對(duì)鼠傷寒沙門菌體外生長(zhǎng)具有有限的促進(jìn)作用，但可以提高小鼠抵抗鼠傷寒沙門菌感染的能力。這可能是由于甘草多糖對(duì)機(jī)體的非特異性和特異性免疫功能具有促進(jìn)作用[11]。鄭堯等[12]通過(guò)口服和注射不同劑量的甘草多糖研究其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，初步探討了甘草多糖對(duì)試驗(yàn)小鼠的非特異性免疫功能方面的影響，結(jié)果顯示，甘草多糖對(duì)小鼠非特異性免疫功能具有一定的促進(jìn)作用。程安瑋[4]研究證明甘草多糖具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用，并且促進(jìn)作用隨著劑量的增加而增加，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)甘草多糖能有效刺激機(jī)體的內(nèi)皮系統(tǒng)，活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖，同時(shí)還可以增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。董永軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加1.0 g/kg的甘草多糖對(duì)動(dòng)物消化道微生物區(qū)系的影響明顯，主要由于其促進(jìn)了腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，抑制了有害菌大腸桿菌和沙門氏菌的增殖。

甘草多糖從中藥甘草中提純而出，易獲取和生產(chǎn)，具有廣泛的藥理作用，且對(duì)動(dòng)物機(jī)體無(wú)毒副作用[14]，擁有廣闊的市場(chǎng)前景。本試驗(yàn)研究了不同劑量的甘草多糖對(duì)小鼠抵抗鼠傷寒沙門菌感染的影響，為甘草多糖的抗菌能力提供臨床依據(jù)，但甘草多糖抗菌能力的具體機(jī)制尚未明確，相信隨著眾多科研工作者對(duì)甘草多糖研究的不斷深入，甘草多糖的抗菌機(jī)制會(huì)被逐漸探索出來(lái)。