人源SIRT4蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化

朱 紅,王 春,王 芳,鄒葉芳,陳曉雪,劉 亭,李 燕，何 彬

1)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 貴陽 550004 2)貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽 550004 3)貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 貴陽 550004 4)貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室 貴陽 550004 5)貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴陽 550004

存在于哺乳動(dòng)物的Sir2 又叫沉默信息調(diào)節(jié)子(Sirtuin，簡(jiǎn)稱SIRT)，人源的SIRT有7個(gè)亞型，即SIRT1～7，SIRT4定位于線粒體，涉及線粒體中糖脂代謝過程中許多通路的中間橋梁，廣泛作用于整個(gè)細(xì)胞的各個(gè)過程的調(diào)節(jié)，如能量代謝、細(xì)胞凋亡等[1-7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)被SIRT4抑制活性，且SIRT4的缺失或過度表達(dá)會(huì)影響胰島素的分泌。研究[9-10]表明SIRT4在養(yǎng)分充足的條件下，可以促進(jìn)脂肪代謝及抑制脂肪酸氧化。還有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，SIRT4的缺失會(huì)增加谷氨酰胺依賴的增殖和應(yīng)激誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致腫瘤表型的發(fā)生。綜上所述，SIRT4 是糖尿病、癌癥及其他代謝疾病的新型治療靶點(diǎn)。然而以SIRT4 為靶向的藥物開發(fā)并沒有取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展[12-17]。所以作者擬采用巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系，希望獲得表達(dá)量高且有活性的SIRT4蛋白，為后期的高通量篩選方法打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 巴斯德畢赤酵母菌株 X33購自武漢普因特生物工程有限公司，感受態(tài)細(xì)胞TOP10購自索萊寶公司，pPICZA質(zhì)粒購自Invitrogen 公司，PCMV-flag-SIRT4質(zhì)粒來自貴州醫(yī)科大學(xué)微生物與生化藥實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒庫。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 酵母氮源YNB(批號(hào)Y8040)、LB培養(yǎng)基(批號(hào)20160527)、YPD液體培養(yǎng)基(批號(hào)20170309)、YPDA固體培養(yǎng)基(批號(hào)20160708)、卡拉霉素(批號(hào)140B047)、ECL Plus超敏發(fā)光液(批號(hào)20151020)、彩虹蛋白Marker(批號(hào)PR1910)、考馬斯亮藍(lán) R-250(批號(hào)416B0330)、PMSF(批號(hào)P8340)均購自索萊寶公司；酵母提取物(批號(hào)LP0021)購自O(shè)XOID公司，蛋白胨(批號(hào)170515)購自上海博微生物科技有限公司，抗生素Zeocine購自上海生物風(fēng)公司，BMGY、BMMY參照Invitrogen 公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)制備，DNA 15 000 bp Marker購自TaKaRa公司，色譜甲醇(批號(hào)67-56-2)購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，BCA 蛋白濃度測(cè)試試劑盒(批號(hào)20151225)及限制性內(nèi)切酶Fast DigestNotI、Fast DigestXhoI (批號(hào) FD0593、FD0694)、T4 DNA Ligase連接酶(批號(hào)15224041)購于Thermo 公司，Pfu 和Taq 酶(批號(hào)KP201、KT201)購自大連寶生物公司，質(zhì)粒抽提試劑盒(批號(hào)18116KA1)購自 AXYGEN公司，PCR引物由北京博邁德公司合成，HisTrapTMHP柱(批號(hào)10252565)購自GE公司，兔抗His-tag多抗(批號(hào) RG001020)購自索萊寶公司，山羊抗兔IgG(H+L)HRP(批號(hào)AB00151)購自巴傲得生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)用多肽由上海沐晉公司合成。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀(伯樂公司，型號(hào)Model 680)，蛋白快速轉(zhuǎn)印儀(伯樂公司，型號(hào)Trans-BlotTurbo)，凝膠成像儀(SYNGENE公司，型號(hào) G-BOX)，蛋白電泳儀(伯樂公司，型號(hào)Mini Trans-Blot Cell)，蛋白核酸分析儀(賽默飛公司，型號(hào)Biomata 3s)，高速冷凍離心機(jī)(賽默飛公司，型號(hào)X3R)，渦旋振蕩器(大龍牌，型號(hào)MX-S)。

1.1.4 引物信息 見表1。

表1 引物信息

25～314表示克隆從25位氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基序列開始，314位氨基酸結(jié)束；下劃線為酶切位點(diǎn)

1.1.5 多肽信息 GDH-K(生物素?；?的分子式為C86H124N22O25S，[M-2H]2-實(shí)測(cè)值為947.933 4。GDH-K(硫辛?；?的分子式為C88H127N19O24S2，[M-2H]2-實(shí)測(cè)值為948.431 0。GDH的分子式為C76H110N20O23，[M-2H]2-實(shí)測(cè)值為834.393 9。

1.1.6 試劑配制 Buffer A：pH 8.0 Tris-HCl 20 mL、5 mol/L NaCl 100 mL，ddH2O定容至1 L；10×電泳液：30.3 g Tris、144.1 g 甘氨酸、10 g SDS，定容至1 L；轉(zhuǎn)移液：3.03 g Tris、14.42 g 甘氨酸，150 mL甲醇定容至1 L；考馬斯亮藍(lán)染液：1.0 g R-250、500 mL甲醇、100 mL乙酸，定容至1 L；脫色液：500 mL ddH2O、400 mL甲醇、100 mL乙酸；100 mmol/L PMSF：0.017 4 g溶于1 mL異丙醇；1 mol/L咪唑：68.08 g 咪唑溶于1 L Buffer A，使用時(shí)逐級(jí)稀釋；多肽用DMSO配制成濃度為10 mmol/L的母液，使用時(shí)稀釋。

1.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定以PCMV-flag-SIRT4為模板，用特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目的基因。PCR程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸 5 min。分別將pPICZA載體和擴(kuò)增的SIRT4 PCR產(chǎn)物用NotⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA ligase于22 ℃連接2 h。用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細(xì)胞TOP10中，于37 ℃ 180 r/min振搖2 h，涂布于含有Zeocine的LB固體平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取菌落于5 mL LB培養(yǎng)基(含Zeocine)37 ℃ 180 r/min振搖過夜，用試劑盒提取質(zhì)粒，用載體引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用10 g/L凝膠電泳驗(yàn)證。將陽性克隆送上海美吉公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用BstXⅠ內(nèi)切酶線性化，通過電轉(zhuǎn)的方法將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到巴斯德畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞中，于28 ℃放置2 h后，涂布于YPDA(含Zeocine)平板。30 ℃培養(yǎng)72 h，挑取單克隆與未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的X33菌落用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序同1.2。

1.4SIRT4蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化挑取測(cè)序正確的單克隆，接種于10 mL BMGY(含Zeocine)，30 ℃ 210 r/min培養(yǎng)48 h，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值在2.0～6.0之間。5 000 r/min收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體后于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值在0.8～1.0之間，30 ℃ 210 r/min培養(yǎng)96 h，每隔24 h添加甲醇至終濃度分別為體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%，同時(shí)以未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的X33 作為陰性對(duì)照進(jìn)行同樣操作。收集相同體積的菌體，高壓破碎后12 000 r/min離心30 min，取上清 10 μL 加入5 μL 3×SDS Loading Buffer，97 ℃水浴中煮沸7 min，12 000 r/min、4 ℃離心5 min，用150 g/L的SDS-PAGE 電泳對(duì)其檢測(cè)。后期選擇最佳甲醇濃度對(duì)蛋白進(jìn)行表達(dá)。

1.5SIRT4蛋白的表達(dá)及純化根據(jù)1.4考察的最佳誘導(dǎo)條件對(duì)SIRT4進(jìn)行蛋白表達(dá)。收集菌液，將菌液于4 ℃ 10 000 r/min 離心20 min，輕輕去掉上清液，沉淀用60 mL Lysis Buffer(含1 mmol/L PMSF)重懸，于1 000 Pa高壓破碎，循環(huán)10次。12 000 r/min 離心30 min，保留沉淀，收集上清液，用鎳柱HisTrapTMHP進(jìn)行純化，上樣量60 mL，流速2 mL/min，以Buffer A緩沖液配制濃度為25、50、100、150、200、250、500 mmol/L的咪唑進(jìn)行洗脫，通過電泳觀察純化效果。

1.6重組SIRT4蛋白的驗(yàn)證純化后的目的蛋白分別取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μL，用水補(bǔ)足體積至10 μL，加入 5 μL 3×SDS Loading Buffer 混勻，置于97 ℃水浴中煮5 min，12 000 r/min、4 ℃離心5 min，經(jīng) SDS-PAGE 凝膠電泳，通過半干轉(zhuǎn)(25 V、30 min)轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上，加入4 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的BSA封閉2 h，用TBST洗4次，5 min/次，加入用體積分?jǐn)?shù)為5%的BSA稀釋后的一抗于4 ℃孵育過夜，用TBST洗4次，5 min/次，再加入用TBST稀釋后的二抗室溫孵育2 h，用TBST洗4次，10 min/次，將膜取出加入 0.3 mL的ECL Plus 超敏發(fā)光液，立即進(jìn)行顯影。

1.7重組SIRT4蛋白的活性驗(yàn)證SIRT4蛋白的活性反應(yīng)處理體系為：1 mmol NAD、1 mmol DTT、20 mmol Tris-HCl、10 mol SIRT4蛋白、167 mol GDH-K多肽，37 ℃孵育1 h，用Quench Buffer猝滅反應(yīng)，于4 ℃ 10 000 r/min 離心20 min，取上清50 μL進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定質(zhì)粒構(gòu)建完成后，用載體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果顯示，跟空載體對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組增加了約900 bp的基因片段(圖1)。將陽性克隆送上海美吉公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因模板匹配(GenBank序列號(hào)AAD40852.1)。

M：Marker；1：空質(zhì)粒；2～11：挑取的10個(gè)單克隆

2.2重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)及鑒定將電轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的菌落進(jìn)行PCR，電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入pPICZA-SIRT4質(zhì)粒在1 000 bp下方均明顯擴(kuò)增條帶，且相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期相同(圖2)。將陽性克隆提基因組，送上海美吉公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與SIRT4基因模板匹配。

M：Marker；1：陰性對(duì)照；2：陽性對(duì)照；3～8：6個(gè)不同單克隆菌落

圖2菌落PCR結(jié)果

2.3重組SIRT4蛋白的表達(dá)及條件優(yōu)化結(jié)果(圖3)顯示，加入甲醇后在33 000處有一條明顯的目的條帶，且甲醇為體積分?jǐn)?shù)2%時(shí)的效果最好。

M：Marker;1：不加甲醇;2～6:分別為加入體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%甲醇

圖3甲醇濃度考察結(jié)果

2.4重組SIRT4蛋白的表達(dá)及純化結(jié)果(圖4)顯示，編號(hào)9、10兩管純化效果較好，測(cè)定其濃度為3.2 g/L，表達(dá)量約為每升發(fā)酵液8.0 mg。

M：Marker；1：破碎后上清混懸液；2：過柱液；3：Buffer A沖洗；4～13：分別為25、50、100、100、150、150、200、200、250、500 mmol/L咪唑洗脫

圖4SIRT4純化結(jié)果

2.5重組SIRT4蛋白的驗(yàn)證結(jié)果見圖5?？芍?，檢測(cè)到目標(biāo)蛋白的His標(biāo)簽，表明SIRT4成功在畢赤酵母X33中表達(dá)。

1～6：分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μL SIRT4蛋白；7：陽性對(duì)照

圖5重組蛋白SIRT4的Westernblot結(jié)果

2.6重組SIRT4蛋白的活性驗(yàn)證將處理后的蛋白多肽反應(yīng)體系用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，能分別同時(shí)從反應(yīng)體系的總離子流圖里面提取到生物素?；土蛐刘；漠a(chǎn)物GDH，說明表達(dá)的SIRT4蛋白有一定的去生物素?；腿チ蛐刘；钚?。

3 討論

在分子克隆的時(shí)候，由于SIRT4目的基因末尾帶有TGA終止密碼子，為了不影響載體上His標(biāo)簽的表達(dá)，作者在設(shè)計(jì)下游引物的時(shí)候，去掉了TGA終止密碼子，另外考慮到克隆全長(zhǎng)基因會(huì)影響蛋白的活性，所以作者是從25位氨基酸對(duì)應(yīng)的堿基序列開始設(shè)計(jì)上游引物。后期作者對(duì)蛋白表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，在甲醇為體積分?jǐn)?shù)2%時(shí)誘導(dǎo)效果最佳，1 L發(fā)酵液經(jīng)純化后可得到8.0 mg SIRT4蛋白。并且作者對(duì)酵母表達(dá)的SIRT4蛋白進(jìn)行了活性檢測(cè)，從質(zhì)譜結(jié)果來看，酵母表達(dá)的SIRT4蛋白有一定的去生物素酰化和去硫辛?；钚?，這些都為后面建立篩選方法提供了基礎(chǔ)。