鄭州市冬季霧霾空氣中細(xì)菌的多樣性及耐藥性檢測

李夢臣，劉俏麗，段廣才，晉樂飛，李 影，孫甜甜，吳慧穎，黨德建，劉慧瑩，徐亞珂，陳帥印，郗園林

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001

近年來，我國部分城市和地區(qū)的霧霾愈發(fā)嚴(yán)重，引起了廣泛的社會(huì)關(guān)注。據(jù)以往研究[1]報(bào)道，霧霾天氣多出現(xiàn)在秋冬季節(jié)，而夏季較少見。人體暴露于霧霾中，會(huì)使免疫系統(tǒng)受到抑制，從而引起慢性肺部疾病，還會(huì)增加人群心腦血管疾病的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。霧霾中空氣微生物的數(shù)量多達(dá)上千種[4]，霧霾越嚴(yán)重的空氣中含有的致病微生物就越多，這也是霧霾天氣人群患病人數(shù)增加的主要原因。有研究[5]認(rèn)為抗生素是治療細(xì)菌感染性疾病的有效藥物，但近年來細(xì)菌對抗生素的耐藥性有所增加，耐藥問題越來越引起重視。課題組前期研究[6]結(jié)果顯示，鄭州市城區(qū)空氣細(xì)菌濃度地理分布呈現(xiàn)城區(qū)中心高于城市外圍的特點(diǎn)，且城市中心附近人流密度大、空氣質(zhì)量較差，對霧霾天氣細(xì)菌種類的研究具有突出性，故本研究選取地理位置分布較集中的4處采樣點(diǎn)對鄭州市冬季霧霾空氣中細(xì)菌的多樣性和耐藥性進(jìn)行分析，了解不同區(qū)域細(xì)菌種屬類型的差異，通過藥敏試驗(yàn)進(jìn)一步反映抗生素的臨床用量，為抗生素的合理應(yīng)用提供思路。

1 對象與方法

1.1采樣地點(diǎn)與時(shí)間參照鄭州市城區(qū)空氣質(zhì)量信息發(fā)布系統(tǒng)中城區(qū)空氣質(zhì)量監(jiān)測點(diǎn)，選取4個(gè)不同方位的地點(diǎn)作為采樣點(diǎn)：鄭州市卷煙廠(簡稱煙廠，位于紫荊山路與隴海路交叉口附近)；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(簡稱一附院，位于中原路與大學(xué)路交叉口附近)；鄭州紡織機(jī)械廠(簡稱鄭紡機(jī)，位于南陽路與黃河路交叉口附近)；鄭州市環(huán)境保護(hù)局(簡稱市環(huán)保局，位于中原路與秦嶺路交叉口附近)。于2016年12月至2017年2月，每月21日下午15:00～17:00在選定的采樣點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌采集。每月分別于4個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行空氣細(xì)菌采樣，采樣平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。采樣當(dāng)天溫度、濕度如下，2016年12月21日：2～7 ℃、23%～42%；2017年1月21日：-5～9 ℃、12%～28%；2017年2月21日：5～17 ℃、13%～32%。

1.2主要試劑與儀器M-H培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)；藥敏紙片(杭州濱和微生物試劑有限公司)；細(xì)菌DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)；LabCycler PCR儀(德國SensoQuest公司)；16S rRNA引物(上海生工生物工程有限公司)；HI8564 便攜式溫濕度計(jì)( 上海精密儀器儀表有限公司) ； ETW-6型六級篩孔撞擊式微生物采樣器(江蘇金壇市億通電子有限公司)。

1.3采樣方法與計(jì)數(shù)使用ETW-6型六級篩孔撞擊式微生物采樣器以無菌式操作進(jìn)行采樣，在普通營養(yǎng)瓊脂平板上對細(xì)菌計(jì)數(shù)[7]。煙廠、一附院、鄭紡機(jī)、市環(huán)保局均采用扇形布點(diǎn)法，均設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)(每點(diǎn)重復(fù)3次，取其平均值)。該取樣器采樣高度1.5 m，采樣流量28.3 L/min，采樣時(shí)間 5 min，采樣體積為141.5 L。將采樣后的培養(yǎng)板于37 ℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)各級平板上的菌落數(shù)。采樣同時(shí)，溫濕度檢測儀對空氣溫度、 濕度進(jìn)行檢測。

1.4細(xì)菌的分離與鑒定將采集到的空氣中細(xì)菌樣本統(tǒng)計(jì)、分析后，經(jīng)生化反應(yīng)初步篩選，挑取樣本進(jìn)行分離純化，PCR擴(kuò)增并測序。通過BLAST將獲得的 DNA 序列與 GenBank 中的序列比對，鑒定細(xì)菌的屬性[8-9]。

1.5K-B紙片法進(jìn)行藥敏檢測藥敏實(shí)驗(yàn)用紙片瓊脂擴(kuò)散法[10]，選用氨芐西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、復(fù)方新諾明等。操作及結(jié)果判斷嚴(yán)格按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI)[11]。

2 結(jié)果

2.1鄭州市4個(gè)區(qū)的細(xì)菌濃度變化結(jié)果見表1。參照中科院生態(tài)研究中心發(fā)布的大氣微生物評價(jià)分級標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行評價(jià)。12月份一附院采樣點(diǎn)屬于較清潔級(1 000～2 500 cfu/m3)，其余時(shí)間各采樣點(diǎn)空氣細(xì)菌濃度均屬于清潔級(<1 000 cfu/m3)。4個(gè)采樣點(diǎn)12月份的細(xì)菌濃度均高于其他月份。

表1 各采樣點(diǎn)空氣細(xì)菌濃度 cfu/m3

2.2霧霾空氣細(xì)菌的分類與鑒定結(jié)果見表2。鑒定出的細(xì)菌以桿菌為主，其中蛾微桿菌和芽孢桿菌共25株，葡萄球菌1株，志賀菌 1 株，假單胞菌 1株。鑒定出所有菌與已知菌的同源性均在96%以上，且大多為條件致病菌，在正常條件下不會(huì)導(dǎo)致傳染類疾病的發(fā)生。煙廠區(qū)域檢出假單胞菌1株(14%)、芽孢桿菌6株(86%)；一附院區(qū)域檢出志賀菌1株(15%)、葡萄球菌1株(14%)、芽孢桿菌4株(57%)、蛾微桿菌1株(14%)；鄭紡機(jī)和市環(huán)保局區(qū)域檢出有芽孢桿菌各7株(100%)。

表2 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

續(xù)表2

2.3耐藥性分析28株細(xì)菌對氨芐西林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、復(fù)方新諾明等的耐藥率依次為7.1%、0%、0%、17.9%、7.1%、0%。檢測結(jié)果見表3。

表3 霧霾空氣細(xì)菌的耐藥性分析

R：耐藥，I：中介，S：敏感

3 討論

4個(gè)區(qū)域的細(xì)菌濃度顯示，鄭州市冬季霧霾空氣中細(xì)菌含量處于相對清潔的程度，剛?cè)攵緯r(shí)細(xì)菌濃度較高，應(yīng)注意避免細(xì)菌感染和空氣污染對身體帶來的不良影響。研究[13]表明，霧霾中包含有上千種微生物，其中絕大部分為非致病性的微生物，細(xì)菌至少占全部微生物的80%以上。本研究運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定鄭州市冬季霧霾空氣中28株細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬占85.7%，蛾微桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬和志賀菌屬均占3.5%。龔嬋娟等[14]研究表明，在國內(nèi)調(diào)查的城市中冬季共出現(xiàn)32屬空氣細(xì)菌，其中優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和微球菌屬。在城市公共場所室外空氣中，同樣分離到芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬為空氣細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬，其中芽孢桿菌屬較多[15]。這些報(bào)道與本研究結(jié)果基本一致，鄭州市冬季霧霾中細(xì)菌多樣，且不同地點(diǎn)空氣細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬基本相同。

在調(diào)查的4個(gè)區(qū)域中，鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院霧霾空氣中細(xì)菌種類較其他區(qū)域多樣，檢出芽孢桿菌屬、蛾微桿菌屬、葡萄球菌屬和志賀菌屬，其中葡萄球菌、志賀菌是臨床上常見的致病性菌株，存在著空氣傳播感染的危險(xiǎn)性?？赡茉蚴?，醫(yī)院人口密度大、流動(dòng)性強(qiáng)、車輛較多或通風(fēng)性差、消毒滅菌力度不夠、安全管理措施實(shí)施不到位等[16]。雖然其余時(shí)間各采樣點(diǎn)空氣細(xì)菌存在空氣傳播感染的危險(xiǎn)性很小，但對能引起人類過敏原性反應(yīng)的芽孢桿菌屬也應(yīng)該引起足夠的重視。

藥敏結(jié)果顯示，鄭州市冬季霧霾空氣中細(xì)菌對過去常用的抗生素如復(fù)方新諾明、氨芐西林的耐藥性達(dá)0%～7.1%，對現(xiàn)在常用的頭孢三代抗生素如頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性也達(dá)7.1%～17.9%。這與全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告[17]結(jié)果基本一致，考慮可能與臨床較早較多使用這類抗生素有關(guān)。新型喹諾酮類環(huán)丙沙星、四十多年前被臨床廣泛使用而近年來使用卻很少的氨基糖苷類慶大霉素對鄭州市冬季霧霾空氣中細(xì)菌敏感達(dá)100%。結(jié)果值得我們思考，是否較少抗生素的臨床使用可以提高細(xì)菌的敏感性。

此次監(jiān)測結(jié)果可以看出，鄭州市冬季霧霾天氣下不同區(qū)域空氣細(xì)菌的種屬分布與人群活動(dòng)密切相關(guān)，加強(qiáng)醫(yī)院附近霧霾空氣中細(xì)菌的監(jiān)測，鄭州市霧霾空氣細(xì)菌治理則達(dá)到事半功倍的效果。雖抗生素對臨床患者有較好的抗菌消炎作用,但大劑量使用反而會(huì)破壞人體的正常防御系統(tǒng)，造成多方面的影響，如不良反應(yīng)增多、抗生素耐藥，甚至導(dǎo)致條件性致病菌在人體身上增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[18]。合理使用抗生素對細(xì)菌感染防治意義重大,應(yīng)該避免盲目性。