w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究進展

高新星，韋平和

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w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究進展

高新星，韋平和

泰州學(xué)院 醫(yī)藥與化學(xué)化工學(xué)院 江蘇省手性醫(yī)藥化學(xué)品生物制造重點建設(shè)實驗室，江蘇 泰州 225300

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報, 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

w-轉(zhuǎn)氨酶能催化羰基化合物發(fā)生不對稱還原胺化反應(yīng)，在制備手性胺類化合物方面具有較好的應(yīng)用前景。由于底物結(jié)合區(qū)域特殊的空間結(jié)構(gòu)，野生型w-轉(zhuǎn)氨酶在合成大位阻手性胺方面的應(yīng)用受到了限制。此外，在立體選擇性和穩(wěn)定性方面這一類酶也存在一些不足，目前滿足工業(yè)應(yīng)用需求的w-轉(zhuǎn)氨酶仍較為有限。文中首先介紹了w-轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)特征和催化機制，并探討S型和R型酶在結(jié)構(gòu)特征方面的主要差異。然后對w-轉(zhuǎn)氨酶的分子改造研究進行了綜述，重點闡述了基于結(jié)構(gòu)特征和催化機制進行的分子改造研究，包括底物特異性改造、立體選擇性改造和穩(wěn)定性改造三方面。最后，對w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究進展進行總結(jié)和展望。

w-轉(zhuǎn)氨酶，結(jié)構(gòu)，分子改造，底物特異性，穩(wěn)定性

手性胺是手性藥物的重要組成部分，隨著手性藥物市場的不斷擴大，手性胺的需求迅速增長。w-轉(zhuǎn)氨酶能催化羰基化合物不對稱還原胺化生成手性胺，反應(yīng)過程中將氨基供體 (如D/L-丙氨酸或異丙胺) 的氨基轉(zhuǎn)移至氨基受體 (羰基化合物)，生成手性胺及副產(chǎn)物 (如丙酮酸或丙酮)，其中氨基供體或氨基受體通常至少有一個不是a-氨基酸或a-酮酸[1-2]。利用w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺能夠避免現(xiàn)有手性胺合成技術(shù)存在的缺陷，如重金屬污染、立體選擇性差、產(chǎn)率低等，因而受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注和深入研究[3-6]。

w-轉(zhuǎn)氨酶在合成手性胺方面具有較好的應(yīng)用前景，但由于野生型酶在底物特異性、穩(wěn)定性、催化效率等方面存在諸多不足，目前滿足工業(yè)應(yīng)用需求的w-轉(zhuǎn)氨酶仍較為有限?；诜抢硇?、理性及半理性設(shè)計策略的蛋白質(zhì)工程技術(shù)能有效改善w-轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用性能，為手性胺的高效制備提供了可能。隨著w-轉(zhuǎn)氨酶蛋白結(jié)構(gòu)和催化機制相關(guān)研究的深入，利用理性或半理性設(shè)計策略對w-轉(zhuǎn)氨酶進行分子改造的研究備受關(guān)注。文中主要對w-轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)特征、催化機制及分子改造研究進行概述，以期為開發(fā)滿足工業(yè)應(yīng)用需求的w-轉(zhuǎn)氨酶提供理論依據(jù)。

1 w-轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)及催化機制

1.1 w-轉(zhuǎn)氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)

w-轉(zhuǎn)氨酶通常是由相同亞基組成的二聚體或四聚體，活性中心位于兩個亞基的交界面，包括5′-磷酸吡哆醛 (Pyridoxal-5-phosphate，PLP) 結(jié)合區(qū)域、底物結(jié)合區(qū)域及關(guān)鍵催化殘基 (賴氨酸)。根據(jù)空間位置和形狀的不同，底物結(jié)合區(qū)域可分為兩個結(jié)合口袋：大口袋和小口袋，分別用于結(jié)合底物結(jié)構(gòu)中羰基或氨基兩側(cè)的基團，其中大口袋可以結(jié)合底物結(jié)構(gòu)中的芳環(huán)、脂肪鏈以及羧基等體積較大或帶電性基團，而小口袋由于空間位阻、帶電性及疏水性等因素的影響只能容納體積較小的基團 (如甲基)。

根據(jù)手性選擇性的不同，w-轉(zhuǎn)氨酶可分為S型和R型，其中S型w-轉(zhuǎn)氨酶能以L-丙氨酸為氨基供體通常生成S型手性胺，而R型w-轉(zhuǎn)氨酶能以D-丙氨酸為氨基供體通常生成R型手性胺。在PLP依賴型酶的分類中，S型和R型w-轉(zhuǎn)氨酶分別屬于折疊類型Ⅰ類和Ⅳ類[7-9]，兩者在結(jié)構(gòu)方面既有相似之處又有明顯差別。

來源于河流弧菌的w-轉(zhuǎn)氨酶 (AT) 屬于S型酶，有關(guān)該酶的研究報道較多，其晶體結(jié)構(gòu) (圖1A) 已被解析[10-11]。該酶底物結(jié)合區(qū)域位于兩個亞基的交界面，其中小口袋由兩個亞基的8個位點組成，包括19Phe (A亞基)、150Tyr (A亞基)、165Tyr (A亞基)、85Phe (B亞基)、86Phe (B亞基)、320Gly (B亞基)、321Phe (B亞基)、322Thr (B亞基)，而大口袋由A亞基上不同位點組成，包括57Trp、228Ala、258Val、259Ile、415Arg。活性中心關(guān)鍵催化殘基285Lys位于PLP的面 (相對于C4′)。相比S型w-轉(zhuǎn)氨酶而言，R型w-轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)現(xiàn)和研究起步則較晚。來源于土曲霉的w-轉(zhuǎn)氨酶 (AT) 屬于R型酶，其晶體結(jié)構(gòu) (圖1B) 已被解析[12]。在兩個亞基交界面的底物結(jié)合區(qū)域中，小口袋由A亞基上不同位點組成，包括62Val、274Thr、275Thr、276Ala，而大口袋由兩個亞基的7個位點組成，包括60Tyr (A亞基)、115Phe (A亞基)、117Glu (A亞基)、182Leu (A亞基)、184Trp (A亞基)、55His (B亞基)、128Arg (B亞基)。活性中心關(guān)鍵催化殘基180Lys位于PLP的面 (相對于C4′)。S型和R型w-轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)中關(guān)鍵催化殘基 (Lys) 相對輔酶PLP或結(jié)合底物的空間位置成鏡像關(guān)系，這是引起酶立體選擇性差異的關(guān)鍵因素。

圖1 w-轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)及活性中心示意圖

1.2 w-轉(zhuǎn)氨酶的催化機制

w-轉(zhuǎn)氨酶屬于PLP依賴型轉(zhuǎn)移酶，其催化的轉(zhuǎn)胺過程由兩步可逆反應(yīng)組成，遵循雙底物乒乓反應(yīng)機理[13-14]，催化機制如圖2所示。首先活性中心催化殘基Lys的氨基與PLP的醛基通過形成內(nèi)部醛亞胺 (Ⅰ) 的形式相連，然后由氨基供體的氨基取代Lys的氨基與PLP形成一個外部醛亞胺 (Ⅱ)；在催化殘基Lys作用下發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，先后形成醌型結(jié)構(gòu)中間體 (Ⅲ) 和酮亞胺中間體 (Ⅳ)；最后由酮亞胺中間體水解生成產(chǎn)物酮和5′-磷酸吡哆胺 (PMP)。第二步反應(yīng)將PMP的氨基轉(zhuǎn)移至潛手性酮上生成手性胺，同時完成輔酶循環(huán)再生。這一步反應(yīng)中當催化殘基Lys位于醌型結(jié)構(gòu)中間體的面 (相對于PLP的C4′) 時 (S型轉(zhuǎn)氨酶) 主要生成S型手性胺，而位于面時 (R型轉(zhuǎn)氨酶) 主要生成R型手性胺。

2 w-轉(zhuǎn)氨酶的分子改造

野生型w-轉(zhuǎn)氨酶在不對稱催化合成手性胺方面存在諸多不足，通過分子改造研究能有效提升w-轉(zhuǎn)氨酶的催化特性，主要包括底物特異性、立體選擇性及穩(wěn)定性三方面。

2.1 w-轉(zhuǎn)氨酶的底物特異性改造

2.1.1w-轉(zhuǎn)氨酶的底物偏好性改造

根據(jù)催化底物類型的不同，轉(zhuǎn)氨酶可分為a-轉(zhuǎn)氨酶和w-轉(zhuǎn)氨酶。與a-轉(zhuǎn)氨酶不同，w-轉(zhuǎn)氨酶的底物范圍不僅限于a-氨基酸或a-酮酸，還包括酮類和醛類化合物[15-16]。由于底物結(jié)合區(qū)域空間結(jié)構(gòu)的限制，尤其是小口袋只能容納體積較小的基團，野生型w-轉(zhuǎn)氨酶最適反應(yīng)底物通常為a-酮酸或甲基酮類化合物，但對于不同結(jié)構(gòu)的a-酮酸或甲基酮類化合物，其催化活性差別也較大。通過探究影響w-轉(zhuǎn)氨酶底物偏好性的主要因素，并在此基礎(chǔ)上開展的底物偏好性改造研究取得一定進展。

圖2 w-轉(zhuǎn)氨酶的催化機制

w-轉(zhuǎn)氨酶對脂肪胺類底物的催化活性通常比芳香胺類底物要低得多，Cho等[17]以AT為研究對象，通過同源建模和構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)底物結(jié)合區(qū)域大口袋中第57位和147位的色氨酸影響酶與脂肪胺類底物的結(jié)合，將其突變?yōu)閭?cè)鏈基團較小的甘氨酸后，兩個突變體對不同結(jié)構(gòu)的脂肪胺和芳香胺均展現(xiàn)出更好的催化活性，其中對苯基- 4-丁胺的催化活性分別提高至野生型酶的40.6倍和14.3倍，對6-甲基-2-庚胺的催化活性分別提高至野生型酶的14.6倍和1.4倍。來源于新月柄桿菌的S型w-轉(zhuǎn)氨酶與AT具有相似的底物特異性，Hwang等[18]將該酶底物結(jié)合區(qū)域第227位纈氨酸和285位天冬酰胺分別突變?yōu)閭?cè)鏈較小的甘氨酸和丙氨酸后，酶底物特異性發(fā)生明顯改變。兩種突變體對3-氨基-3-苯基丙酸的催化活性分別提高了1.4倍和1.9倍，而對3-氨基丁酸的催化活性降低至野生型酶的56%和28%。嗜鹽單胞菌來源的S型w-轉(zhuǎn)氨酶能夠催化不同結(jié)構(gòu)的芳環(huán)類底物，Contente等[19]結(jié)合計算機輔助設(shè)計和實驗檢測分析手段探究底物結(jié)合區(qū)域立體電子效應(yīng)對該酶催化芳環(huán)類底物的影響，將底物結(jié)合區(qū)域第56位色氨酸突變?yōu)楦拾彼岷?，降低了立體電子效應(yīng)和空間位阻效應(yīng)對酶結(jié)合芳環(huán)類底物的影響，突變體W56G對鄰硝基苯乙酮的催化活性較野生型酶提高2倍以上，同時對苯乙酮、間硝基苯乙酮、對硝基苯乙酮的催化活性較野生型酶未降低?？臻g位阻效應(yīng)是影響w-轉(zhuǎn)氨酶底物偏好性的重要因素，將影響酶與底物相互作用的氨基酸殘基突變?yōu)閭?cè)鏈基團更小的氨基酸殘基，能夠有效拓寬底物結(jié)合區(qū)域的空間，進而改變酶的底物偏好性。

盡管w-轉(zhuǎn)氨酶的底物譜相對較廣，然而對于酮類和醛類化合物的催化活性通常要遠遠低于其天然底物丙酮酸，這也限制了w-轉(zhuǎn)氨酶在合成手性胺方面的應(yīng)用。為提高w-轉(zhuǎn)氨酶對不同結(jié)構(gòu)酮類化合物的催化活性，Han等[20]對人蒼白桿菌來源的S型w-轉(zhuǎn)氨酶 (AT) 的底物偏好性進行改造，利用丙氨酸掃描技術(shù)對酶活性中心附近 (<3 ?) 的8個氨基酸殘基進行突變，發(fā)現(xiàn)突變體W58A的催化活性較野生型酶明顯提高。通過對該位點進行飽和突變和篩選，獲得的單點突變體W58L對不同結(jié)構(gòu)酮類底物的催化活性分別提高至野生型酶的41?760倍，而對丙酮酸的催化效率降至野生型酶的0.41倍。Genz等[21]基于同源序列比對和蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果對AT的底物特異性改造進行半理性設(shè)計，在底物結(jié)合區(qū)域的大口袋中，Leu56、Trp57、Arg415、Leu417四個位點對酶結(jié)合a-酮酸或醛的選擇性有重要影響，通過組合突變和篩選獲得不同突變體的底物偏好性由丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槲烊?，在分別以 (S)-1-苯基乙胺、(S)-1-苯基丙胺或 (S)-1-苯基丁胺為氨基供體催化戊醛轉(zhuǎn)胺的反應(yīng)中，突變體M3 (W57F、R415L、417V) 的酶活提高至野生型酶的2.8、3.0、5.1倍。Han等[22]發(fā)現(xiàn)AT對于a-酮酸和醛類底物的催化活性要遠遠高于大部分潛手性酮類底物，基于蛋白結(jié)構(gòu)特征和酶催化機制分析發(fā)現(xiàn)潛手性酮與酶分子的結(jié)合取向不利于反應(yīng)過程中的親核攻擊，從而導(dǎo)致催化效率較低。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合計算機輔助分析和虛擬篩選技術(shù)開發(fā)出一種活性中心改造策略，利用該策略獲得雙點突變體 (L57A、W58A) 對苯乙酮、苯丙酮及苯丁酮的催化活性較野生型酶分別提高188倍、2 500倍和130 000倍。本研究團隊發(fā)現(xiàn)AT對4-羥基丁酮的催化活性遠遠低于天然底物丙酮酸。利用同源建模和底物對接技術(shù)確定該酶底物結(jié)合區(qū)域內(nèi)影響酶與底物相互作用的關(guān)鍵位點，通過單點飽和突變和多點組合突變，獲得不同的突變體對4-羥基丁酮的催化活性較野生型酶至少提高2倍以上，其中突變體H55A/S215P底物結(jié)合區(qū)域較野生型酶發(fā)生明顯變化 (圖3)，在不對稱催化合成 (R)-3-氨基丁醇的反應(yīng)中，底物濃度高達50 g/L，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景[23]。酮類和醛類化合物是w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺的重要原料，提高w-轉(zhuǎn)氨酶對這一類化合物的催化活性能夠更好地推動w-轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)化應(yīng)用。

除了上述研究之外，通過分子改造使得w-轉(zhuǎn)氨酶具備a-轉(zhuǎn)氨酶催化特性的研究也引起了人們的興趣。Deszcz等[24]結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)比對、系統(tǒng)進化分析、酶與底物相互作用分析等方法對來源于紫色色桿菌的S型w-轉(zhuǎn)氨酶(AT) 的底物特異性改造進行半理性設(shè)計，利用定點飽和突變技術(shù)對底物結(jié)合區(qū)域的14個位點進行突變，通過篩選發(fā)現(xiàn)第60位、第88位和第153位的部分單點突變體展現(xiàn)出更高的絲氨酸/丙酮酸催化活性，較野生型酶提高2?4倍。具備催化不同結(jié)構(gòu)類型底物的能力，即“底物雜泛性”，是酶的另一重要特性[25]。通過分子改造研究使得w-轉(zhuǎn)氨酶具備“底物雜泛性”，對w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺的理論研究和應(yīng)用研究均有重要意義。

圖3 AtAT及突變體H55A/S215P底物結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)

2.1.2w-轉(zhuǎn)氨酶對大位阻底物催化性能的改造

通過底物偏好性改造能有效改善w-轉(zhuǎn)氨酶對a-酮酸、甲基酮類和醛類化合物的催化能力，然而作為藥物中間體的手性胺通常在手性基團兩側(cè)含有較大的基團，對于這一類化合物，w-轉(zhuǎn)氨酶通常無法合成或者效率極低，這也成為制約w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺技術(shù)發(fā)展的主要瓶頸。影響w-轉(zhuǎn)氨酶催化大位阻底物的關(guān)鍵因素是底物結(jié)合區(qū)域的空間結(jié)構(gòu)，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)手段對底物結(jié)合區(qū)域進行合理改造，能有效提高w-轉(zhuǎn)氨酶對大位阻底物的催化性能，進而拓寬w-轉(zhuǎn)氨酶在手性胺合成方面的應(yīng)用空間。

在不同來源的w-轉(zhuǎn)氨酶中，有關(guān)AT催化大位阻底物的分子改造研究最多。起初由于缺乏蛋白結(jié)構(gòu)和催化機制等信息，人們主要采用非理性設(shè)計方法對AT進行改造。Hwang等[26]利用易錯PCR技術(shù)對目的基因進行隨機突變，以3-氨基-3-苯基丙酸為唯一氮源進行初篩培養(yǎng)，然后通過反應(yīng)過程中生成的a-氨基酸與銅離子發(fā)生的顯色反應(yīng)進行高通量篩選，獲得不同突變體對3-氨基-3-苯基丙酸的轉(zhuǎn)化率提高至野生型酶的1.3?3.1倍。Yun等[15]利用易錯PCR技術(shù)構(gòu)建突變體庫，以2-氨基庚烷作為唯一氮源進行富集培養(yǎng)，同時添加丁酮作為轉(zhuǎn)氨酶的抑制產(chǎn)物，通過逐步提高丁酮濃度進行篩選，獲得的突變體w-Tamla (P233L、V297A) 對2-氨基庚烷、2-氨基- 6-甲基庚烷及2-氨基辛烷的催化活性分別提高至野生型酶的1.7?2倍，同時對產(chǎn)物丁酮和2-庚酮的抑制常數(shù)分別提高至野生型酶的6倍和4.5倍。盡管非理性改造無需事先了解目的蛋白的空間結(jié)構(gòu)和催化機制，但研究過程中需結(jié)合有效的高通量篩選方法對數(shù)量龐大的突變體庫進行篩選，耗時耗力。

隨著AT蛋白結(jié)構(gòu)和催化機制相關(guān)研究的深入，基于理性或半理性設(shè)計策略的分子改造研究日益增多。在催化 (R)-5-甲基-3-氧代辛酸乙酯合成 (3S,5R)-3-氨基-5-甲基辛酸乙酯的分子改造研究中，Midelfort等[11]基于同源序列比對、結(jié)構(gòu)分析及ProteinGPSTM統(tǒng)計分析等方法將突變位點限制在AT活性中心附近，經(jīng)過4輪突變共構(gòu)建約450個突變體，經(jīng)篩選獲得最佳突變體r414 (F19W、W57F、F85A、R88K、V153A、K163F、I259V、R415F) 的催化活性較野生型酶提高60倍。為進一步提高分子改造效率，Sirin等[27]結(jié)合分子動力學(xué)模擬、分子對接及分子力學(xué)評分等方法開發(fā)了一種可以預(yù)測不同突變對酶催化活性影響的計算機程序，利用該程序?qū)T進行理性設(shè)計，有效提高了實驗效率，從構(gòu)建的89個不同突變體中獲得兩個最佳突變體，催化活性較野生型酶分別提高20和60倍，其中包括上述研究中獲得的突變體r414。此外，AT還被用于催化其他不同結(jié)構(gòu)大位阻底物的研究，Dourado等[28]利用蛋白結(jié)構(gòu)分析、分子對接、分子動力學(xué)模擬、量子力學(xué)計算、計算機輔助蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究、共進化網(wǎng)絡(luò)分析及體外篩選等技術(shù)手段對AT進行理性分子改造，共構(gòu)建113個不同突變體，獲得最佳突變體有7個位點發(fā)生突變 (W57F、R88H、V153S、K163F、I259M、R415A、V422A)，在不對稱催化合成 (1S)-1-(2-聯(lián)苯) 乙胺的反應(yīng)中反應(yīng)速率較野生型酶提高1 716倍。Nobili等[10]發(fā)現(xiàn)AT對于含有大位阻基團的a-羥基酮類和芳基-烷基酮類底物的催化活性較低，將底物結(jié)合區(qū)域小口袋內(nèi)的部分位點進行單點飽和突變和組合突變，通過篩選獲得突變體F85L/V153A對 (S)-苯丁胺的催化活性是野生型酶的26倍，突變體Y150M/V153A對 (R)-苯甘氨醇的催化活性是野生型酶的53倍。Genz等[29]將AT底物結(jié)合區(qū)域中的7個不同位點進行組合突變，在拓寬結(jié)合口袋空間的同時保持其疏水環(huán)境，通過篩選獲得不同突變體能夠催化含有支鏈烷烴結(jié)構(gòu)的手性胺，其中突變體H3_RAV (L56V、W57C、F85V、V153A) 在不對稱催化合成 (R)-2,2-二甲基-1-苯丙胺反應(yīng)中具有較好的催化活性和立體選擇性，而野生型酶無明顯催化活性。

除AT之外，有關(guān)其他來源的w-轉(zhuǎn)氨酶的分子改造研究亦較多。來源于脫氮副球菌的S型w-轉(zhuǎn)氨酶底物結(jié)合區(qū)域的小口袋能夠容納體積較大的基團 (如丁基或丙基)，Park等[30]對該酶底物結(jié)合區(qū)域小口袋中6個不同位點進行丙氨酸掃描突變分析，發(fā)現(xiàn)突變體V153A對不同結(jié)構(gòu)大位阻底物均展現(xiàn)出一定的催化活性，在以2-氧代辛酸和 (S)-苯乙胺為底物的反應(yīng)中，突變體V153A的催化活性較野生型酶提高3倍。Martin等[31]以來源于檸檬節(jié)桿菌的S型w-轉(zhuǎn)氨酶 (AT) 為研究對象，利用易錯PCR構(gòu)建突變體庫，以 (S)-2-四氫萘胺類化合物和丙酮酸為篩選反應(yīng)底物，產(chǎn)物2-四氫萘酮類化合物接觸空氣易發(fā)生顏色變化，根據(jù)反應(yīng)溶液顏色深淺可判斷酶活高低，從而實現(xiàn)高通量篩選。經(jīng)過5輪突變和篩選獲得的突變體有17個位點發(fā)生突變，催化活性較野生型酶提高268倍，能滿足 (S)-2-四氫萘胺類化合物的工業(yè)生產(chǎn)需求。2010年美國總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎的綠色反應(yīng)條件獎授予了Merck和Codexis公司，以表彰它們在Ⅱ型糖尿病治療藥物-西他列汀 (Sitagliptin) 的綠色生產(chǎn)中所作的貢獻，這也是利用w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺技術(shù)發(fā)展的重要里程碑[32-33]。西他列汀潛手性酮在羰基兩側(cè)均含有大位阻基團，野生型酶對該化合物幾乎無催化活性，Savile等[32]以節(jié)桿菌sp.來源的R型w-轉(zhuǎn)氨酶ATA117為研究對象，首先利用定點飽和突變技術(shù)對底物結(jié)合區(qū)域大口袋進行改造，獲得突變體1 (S223P) 對西他列汀潛手性酮結(jié)構(gòu)類似物 (甲基酮) 展現(xiàn)一定的催化活性。然后結(jié)合定點飽和突變、組合突變及隨機突變技術(shù)對底物結(jié)合區(qū)域小口袋及附近位點進行改造，獲得突變體2 (S223P/Y26H/V65A/V69G/F122I/A284G)首次對西他列汀潛手性酮展現(xiàn)出催化活性。在此基礎(chǔ)上將底物結(jié)合區(qū)域其他不同位點的正向突變進行組合，獲得突變體3 (突變體2+H62T/G136Y/ E137I/V199I/A209L/T282S) 對西他列汀潛手性酮的催化活性較突變體2提高75倍，經(jīng)過11輪突變最終獲得突變體Rd11TA，其底物結(jié)合區(qū)域能有效結(jié)合西他列汀潛手性酮 (圖4)，催化活性較野生型酶提高了28 000倍以上。

不同來源的w-轉(zhuǎn)氨酶在蛋白結(jié)構(gòu)方面存在明顯差異，針對單個酶的分子改造研究結(jié)果往往難以復(fù)制到其他來源的酶中。因此，系統(tǒng)研究w-轉(zhuǎn)氨酶在催化含有大取代基底物方面的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，并確定影響酶與底物結(jié)合的關(guān)鍵因素，有助于推進w-轉(zhuǎn)氨酶對大取代基底物的催化性能改造。Pavlidis等[7]基于酶與底物相互作用關(guān)系對魯杰氏菌sp. TM1040來源的S型w-轉(zhuǎn)氨酶進行理性改造，獲得的突變體能夠不對稱催化合成一類大位阻手性胺，其中對1,3-二苯基- 1-丙胺的催化活性較野生型酶提高了8 900倍。在此基礎(chǔ)上鑒定出底物結(jié)合區(qū)域中影響酶催化合成含有大位阻手性胺的關(guān)鍵基序 (Y59W、Y87F、Y152F、T213A、P423H)，并驗證該基序在不同來源的S型w-轉(zhuǎn)氨酶中具有較好的適用性?；谏鲜鲅芯浚琖ei?等[34]通過分子改造研究首次將w-轉(zhuǎn)氨酶用于不對稱催化合成雙環(huán)胺類化合物，他們以上述研究中的突變體3FCR_QM作為起始框架，結(jié)合定點突變、飽和突變及易錯PCR等方法構(gòu)建突變體庫，經(jīng)篩選獲得5個正向突變體，在不對稱催化合成外向-3-氨基-8-氮雜雙環(huán)[3.2.1]辛-8-基-苯基-甲酮的反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率為起始框架3FCR_QM的2.2?4.2倍。在另一項研究[35]中，該團隊基于相同的策略對前期研究中構(gòu)建的突變體3FCR_Y59W/T231A進行分子改造，獲得突變體3FCR_WLAMA (Y59W、Y87L、T231A、L382M、G429A) 能夠不對稱催化2,2-二甲基苯丙酮合成 (R)-2,2-二甲基-1-苯丙胺，而原始突變體3FCR_Y59W/T231A無明顯催化活性。

圖4 節(jié)桿菌來源的w-轉(zhuǎn)氨酶及突變體Rd11TA底物結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)[32]

2.2 w-轉(zhuǎn)氨酶的立體選擇性改造

在w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化過程中，生成何種構(gòu)型的手性產(chǎn)物取決于底物在酶活性中心的結(jié)合取向。當?shù)孜锏拿?(相對于底物中的潛手性羰基碳原子) 朝向關(guān)鍵催化殘基Lys時生成S型產(chǎn)物，反之則生成R型產(chǎn)物 (圖5)。w-轉(zhuǎn)氨酶通常具有較好的立體選擇性，但部分結(jié)構(gòu)特殊的底物在底物結(jié)合區(qū)域存在不同的結(jié)合取向，能生成不同構(gòu)型的手性產(chǎn)物，從而影響產(chǎn)物的手性純度。

通過對w-轉(zhuǎn)氨酶底物結(jié)合區(qū)域空間結(jié)構(gòu)的改造能夠改變底物的結(jié)合取向，使其傾向于生成單一構(gòu)型的手性產(chǎn)物，從而有效提高或轉(zhuǎn)變酶的立體選擇性。Svedendahl等[36]以突變體CNB05-01為研究對象，基于同源建模及蛋白結(jié)構(gòu)分析推測活性中心的一個loop結(jié)構(gòu)可能對酶的立體選擇性存在影響，對該區(qū)域3個位點 (E326、V328、Y331) 進行定點突變研究，結(jié)果顯示突變體CNB05-01/Y331C對4-氟苯基丙酮的立體選擇性 (值) 由98% (S) 提高至99.5% (S)，而突變體CNB05-01/V328A對4-氟苯基丙酮的立體選擇性發(fā)生翻轉(zhuǎn)，R型產(chǎn)物ee值達到58%。Skalden等[37]通過分析AT與反應(yīng)中間體 (內(nèi)部醛亞胺中間體) 的相互作用確定底物結(jié)合區(qū)域第56位亮氨酸影響酶催化的立體選擇性，根據(jù)同源序列比對結(jié)果將突變目標氨基酸鎖定為異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸，以 (S) - 3-甲基環(huán)己酮為底物對6種單點突變體檢測，結(jié)果顯示突變體L56V較野生型酶展現(xiàn)出更好的R型選擇性，非對映體過剩值由12%提高至66%，而突變體L56I立體選擇性則轉(zhuǎn)變?yōu)镾型，非對映體過剩值為71%。

圖5 w-轉(zhuǎn)氨酶中底物結(jié)合取向示意圖[22]

此外，Humble等[38]嘗試不同策略對AT的立體選擇性進行理性改造。首先，根據(jù)同源結(jié)構(gòu)比對結(jié)果將底物結(jié)合區(qū)域第60位色氨酸突變?yōu)閭?cè)鏈基團較小的半胱氨酸，突變體W60C對甲基芐胺、1-四氫萘胺及2-四氫萘胺的對映體特異性 (E值) 較野生型酶分別提高1.3倍、7.9倍和14倍。然后，通過底物對接分析發(fā)現(xiàn)底物苯乙酮與酶的結(jié)合取向更傾向于生成S構(gòu)型的產(chǎn)物，將結(jié)合底物兩側(cè)的位點F88和A231分別突變?yōu)楸彼岷捅奖彼岷?，底物與酶的結(jié)合取向發(fā)生翻轉(zhuǎn)，使其更傾向于生成R構(gòu)型產(chǎn)物，結(jié)果顯示突變體F88A/A231F對1-四氫萘胺的立體選擇性 (E值) 分別由6.7 (S) 轉(zhuǎn)變?yōu)?.9 (R)，對2-四氫萘胺的立體選擇性 (E值) 分別由3.9 (S) 轉(zhuǎn)變?yōu)?3 (R)。最后，基于蛋白結(jié)構(gòu)和催化機制分析結(jié)果，將關(guān)鍵催化殘基Lys與底物相對位置由面改為面，以期轉(zhuǎn)變酶的立體選擇性，然而由于突變體酶活喪失或下降嚴重并未取得理想結(jié)果。

從理論上講，改變w-轉(zhuǎn)氨酶活性中心關(guān)鍵催化殘基與底物的相對位置 (面與面轉(zhuǎn)換) 可以轉(zhuǎn)變酶的立體選擇性，但是這需要大范圍改造酶活性中心的空間結(jié)構(gòu)，單純改變關(guān)鍵催化殘基的位置極易導(dǎo)致酶活性下降或喪失。相比這種策略，通過改造酶底物結(jié)合區(qū)域來改變底物結(jié)合取向更能有效提高或轉(zhuǎn)變酶的立體選擇性。

2.3 w-轉(zhuǎn)氨酶的穩(wěn)定性改造

w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成手性胺的過程中，通常需要承受高溫 (提高酶催化速率及底物溶解性)、高鹽 (高濃度氨基供體)、高濃度有機溶劑 (提高底物溶解性) 等反應(yīng)條件。因此，提升w-轉(zhuǎn)氨酶的穩(wěn)定性具有重要意義。

酶分子的穩(wěn)定性與蛋白結(jié)構(gòu)的剛性有著密切聯(lián)系，通常蛋白結(jié)構(gòu)的剛性越強其維持活性構(gòu)象的能力也越強，因此，合理增強酶分子柔性區(qū)域的剛性有助于提高酶分子的穩(wěn)定性。Huang等[39]依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)溫度因子 (B因子) 和折疊自由能參數(shù)開發(fā)了一種提高酶溫度穩(wěn)定性的策略，利用該策略對AT進行半理性改造，通過增強結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域 (Gly129-Asp134) 的剛性使得酶分子溫度穩(wěn)定性明顯提高，獲得的最佳突變體T130M/E133F由于分子內(nèi)部疏水作用 (M130與I135、P132與F133) 和氫鍵作用 (M130與I135) 的增強 (圖6)，其穩(wěn)定性明顯提高，半衰期由6.9 min提高至22.7 min，解鏈溫度由38.5 ℃提高至43.5 ℃。

影響酶分子穩(wěn)定性的因素較多，包括蛋白結(jié)構(gòu)柔性、酶分子內(nèi)部疏水作用、亞基之間結(jié)合程度、蛋白表面帶電性等，針對單一因素改善酶穩(wěn)定性的效果往往并不理想。因此，結(jié)合多種影響因素的分子改造研究對提升酶穩(wěn)定性有著重要作用。在w-轉(zhuǎn)氨酶不對稱催化合成西他列汀手性胺中間體的研究[32]中，通過對w-轉(zhuǎn)氨酶ATA117的11輪突變和篩選最終獲得的突變體 (Rd11TA) 包含27個突變點，其中活性中心附近的突變S223P能夠穩(wěn)定底物結(jié)合區(qū)域loop結(jié)構(gòu)，位于蛋白結(jié)構(gòu)表面的突變G215C有助于提高酶的穩(wěn)定性，位于亞基交界面的突變L61Y、V65A、M94I、Y150S、V152C能夠加強二聚體的相互作用。最終突變體Rd11TA在溫度穩(wěn)定性、有機溶劑耐受性以及高鹽耐受性方面的能力大幅提升，在嚴苛的反應(yīng)條件 (50% DMSO、1 mol/L異丙胺、250 g/L底物、反應(yīng)溫度45 ℃) 下仍能保持較好的催化活性，能夠滿足西他列汀手性胺中間體的生產(chǎn)制備需求。在近期一項關(guān)于熒光假單胞菌來源的S型w-轉(zhuǎn)氨酶的穩(wěn)定性改造研究中，B?rner等[40]基于底物誘導(dǎo)酶失活的機理將突變區(qū)域限制在輔酶結(jié)合區(qū)域，對該區(qū)域32個位點進行定點飽和突變和組合突變，通過篩選獲得的突變體ATA-v2 (S51G、N161I、Y164L) 由于分子內(nèi)部氫鍵作用和疏水作用的增強而在有機溶劑耐受性、異丙胺耐受性、溫度穩(wěn)定性及催化效率等方面展現(xiàn)出更好的性能。

圖6 AtAT及突變體T130M/E133F分子內(nèi)部相互作用模型分析[39]

3 總結(jié)與展望

隨著w-轉(zhuǎn)氨酶相關(guān)研究的深入，人們對其催化特性、結(jié)構(gòu)特征及催化機制有著較清晰的認識，在此基礎(chǔ)上進行的w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究也取得了快速發(fā)展。一方面，有關(guān)w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造的設(shè)計理念發(fā)生轉(zhuǎn)變，由建立在大量篩選工作基礎(chǔ)之上的非理性設(shè)計向基于蛋白結(jié)構(gòu)功能關(guān)系和計算機輔助設(shè)計的理性或半理性設(shè)計轉(zhuǎn)變，使得酶分子改造的目的性更強、有效性更高。另一方面，在關(guān)于w-轉(zhuǎn)氨酶底物特異性的分子改造研究中，目標化合物由結(jié)構(gòu)簡單、接近天然底物 (甲基酮或a-酮酸) 結(jié)構(gòu)的潛手性酮向結(jié)構(gòu)復(fù)雜、附加值更高的藥物中間體潛手性酮轉(zhuǎn)變，從而進一步拓寬w-轉(zhuǎn)氨酶在手性藥物制造行業(yè)的應(yīng)用空間。

盡管有關(guān)w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造的研究較多，然而大部分研究尚處于實驗室階段，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求的案例并不多見。因此，拓寬w-轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用空間并推動其工業(yè)化應(yīng)用將成為w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究的努力方向。在文中概述的26篇分子改造研究中，針對R型w-轉(zhuǎn)氨酶的研究僅有3篇，加強R型w-轉(zhuǎn)氨酶的分子改造研究，尤其是改善對大位阻底物催化性能的研究，能夠拓寬w-轉(zhuǎn)氨酶在R型手性胺制備方面的應(yīng)用空間。此外，酶分子改造過程中不可避免地涉及大量挑選和篩選工作，充分利用自動化技術(shù)，如高通量菌落挑選儀、自動移液工作站等設(shè)備，將大大提高工作效率，縮短酶分子改造周期。隨著基因組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)等技術(shù)的迅速發(fā)展，基于蛋白序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和計算機輔助設(shè)計驅(qū)動的理性或半理性改造技術(shù)將會更加成熟，充分結(jié)合非理性、理性及半理性設(shè)計的優(yōu)勢有助于提升w-轉(zhuǎn)氨酶分子改造研究成效，加快推進w-轉(zhuǎn)氨酶在手性藥物工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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(本文責編 陳宏宇)

Advances in molecular modification ofw-transaminase

Xinxing Gao, and Pinghe Wei

Jiangsu Key Laboratory of Chiral Pharmaceuticals Biosynthesis, College of Pharmacy and Chemistry and Chemical Engineering, Taizhou University, Taizhou 225300, Jiangsu, China

w-Transaminase catalyzes the asymmetric reductive amination of carbonyl compounds, and has great application prospect in the preparation of chiral amines. The application in synthesis of bulky chiral amines is limited by the special structure of substrate binding region in the wild-type enzyme. Moreover, there are also some drawbacks in the stereoselectivity and stability ofw-transaminase. So far,w-transaminase satisfying the industrial requirements is still rare. In this review, we first introduce the structure and catalytic mechanism ofw-transaminase, and then discuss the structural differences between S-selective and R-selective enzymes. Molecular modification ofw-transaminase was introduced in detail, by focusing on the structure and mechanism-based molecular modification, including substrate specificity, stereoselectivity, and stability.

w-transaminase, structure, molecular modification, substrate specificity, stability

November 20, 2017;

January 16, 2018

Scientific Research Starting Foundation of Taizhou University (No. TZXY2017QDJJ008), Open Foundation of Jiangsu Key Laboratory of Chiral Pharmaceuticals Biosynthesis, Taizhou University (No. SX1701).

10.13345/j.cjb.170455

Pinghe Wei. Tel/Fax: +86-523-80769295; E-mail: phwei2011@126.com

泰州學(xué)院科研啟動基金項目 (No. TZXY2017QDJJ008)，江蘇省手性醫(yī)藥化學(xué)品生物制造重點建設(shè)實驗室 (泰州學(xué)院) 開放課題基金 (No. SX1701) 資助。