利用Ⅲ型聚酮合酶CsyB起始單元的底物多樣性體內(nèi)合成csypyrone類化合物

潘麗霞，朱婧，王青艷，申乃坤，李億，楊登峰,2

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利用Ⅲ型聚酮合酶CsyB起始單元的底物多樣性體內(nèi)合成csypyrone類化合物

潘麗霞1，朱婧1，王青艷1，申乃坤1，李億1，楊登峰1,2

1 廣西科學(xué)院 非糧生物質(zhì)酶解國家重點實驗室 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心 廣西生物質(zhì)產(chǎn)業(yè)化工程院 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530007 2 廣西科學(xué)院 廣西北部灣海洋研究中心 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合合成生物化學(xué)重點實驗室，廣西 南寧 530007

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報, 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

作為新型Ⅲ型聚酮合酶，米曲霉來源的CsyB能夠依次接受一個起始單元為短鏈脂肪酰輔酶A、一個延伸單元為丙二酰輔酶A和另一個延伸單元為乙酰乙酰輔酶A的3個底物形成短鏈的csypyrone B1-3?；贑syB的晶體結(jié)構(gòu)分析，顯示它的活性中心存在一個長約16 ?的能夠接受脂肪酰輔酶A結(jié)合通道，這個通道很可能能夠接受多種底物。為了檢測該酶的底物多樣性，將基因?qū)氲酱嬖陂L鏈脂肪酰輔酶A前體的大腸桿菌中表達。高效液相結(jié)果顯示，相比對照菌株，重組菌株產(chǎn)生了一系列長鏈的csypyrone衍生物。利用紫外可見光特征吸收值和高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對這些新產(chǎn)物作了初步分析。對3個具有羥基的csypyrone產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行了核磁共振一維譜和二維譜的詳細鑒定，確定了其羥基的位置。上述結(jié)果顯示，CsyB具有廣泛的底物特異性，不但可以接受多種長鏈飽和或不飽和脂肪酰輔酶A，還可以接受具有羥基修飾的長鏈脂肪酰輔酶A作為底物。

Ⅲ型聚酮合酶，CsyB，底物多樣性，體內(nèi)合成，csypyrone

聚酮類化合物是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣、生物活性良好的天然產(chǎn)物。它廣泛存在于自然界中，具有抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲和免疫抑制等藥理活性[1-5]。常見的聚酮類藥物有洛伐他汀、阿霉素、紅霉素、四環(huán)素、兩性霉素等。盡管它們在結(jié)構(gòu)上是多樣的，但在其生物合成途徑中，其核心結(jié)構(gòu)均由聚酮合酶 (Polyketide synthase, PKS) 催化合成。根據(jù)聚酮合酶的結(jié)構(gòu)及其他性質(zhì)，其被分為模塊型的Ⅰ型PKS、迭代型的Ⅱ型PKS和查爾酮型的Ⅲ型PKS三大類[6-9]。

由于獨特的結(jié)構(gòu)、作用機制及催化活性，Ⅲ型PKS的研究備受矚目。Ⅲ型PKS和其他兩種PKS迥然不同，它在不需要?；d體蛋白 (Acyl carrier protein, ACP) 的情況下直接催化丙二酰輔酶A間的縮合，主要負責單環(huán)或雙環(huán)芳香類聚酮化合物的生物合成，如白藜蘆醇、花青素、查耳酮、二苯乙烯、苯甲酮、吖啶酮、間苯三酚、吡喃酮和苯并-γ-吡喃酮等含有黃酮類骨架結(jié)構(gòu)的化合物。這些化合物使植物擁有抗氧化、抗誘變、抗紫外輻射、抗病害侵擾等抵御外界脅迫的能力。目前研究表明，它們與人類的健康也有密切的關(guān)系，具有抗炎、抗癌、保護心腦血管系統(tǒng)等多種藥理作用[10-12]。Ⅲ型聚酮合酶的查爾酮合酶超家族 (CHS; EC 2.3.1.74) 是一類蛋白質(zhì)分子量為40–45 kDa的酶，一般是形成簡單的同源二聚體，以具有芳香基團或脂肪鏈基團的輔酶A為底物，連續(xù)地催化和丙二酰輔酶A的脫羧縮合反應(yīng)，形成一系列具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物[13-15]。盡管Ⅲ型聚酮合酶主要分布在植物中，但在微生物中也發(fā)現(xiàn)了它的存在，不僅有細菌還有像真菌這樣的真核微生物[16-18]。

來源于米曲霉的CsyB是一個獨特的Ⅲ型聚酮合酶，它存在于csypyrone B1-3的生物合成途徑中。CsyB是第一個Ⅲ型PKS的雙功能酶，不僅具有常規(guī)Ⅲ型PKS催化脫羧克萊森縮合反應(yīng)的能力，而且可以催化非脫羧的克萊森縮合反應(yīng)，一步法縮合兩個二酮輔酶A單元[19-23]。具體來說，CsyB能夠接受脂肪酰輔酶A、丙二酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A為底物。首先，將脂肪酰輔酶A與丙二酰輔酶A脫羧縮合產(chǎn)生β-酮?；s酮 (β-ketoacyl-diketide)，然后，再與乙酰乙酰輔酶A完成非脫羧的縮合反應(yīng)，產(chǎn)生3-乙?；?4-羥基-6-烷基-α-吡喃酮 (3-acetyl-4- hydroxy-6-alkyl-α-pyrone)，一個假定的csypyrone B的前體 (圖1A，1)。此外，CsyB可以催化兩個乙酰乙酰輔酶A分子或兩分子β-酮酰基二縮酮中間體的縮合反應(yīng)，分別產(chǎn)生脫氫乙酸 (3-acetyl- 4-hydroxy-6-methyl-α-pyrone) 和3-乙?；?4-羥基- 6-烷基-α-吡喃酮 (圖1A，2)[23]。

為了更好地了解該酶的催化特性，我們對該酶的晶體結(jié)構(gòu)進行了解析，得到了1.7 ?的晶體[24]。對晶體結(jié)構(gòu)的詳細分析顯示，它是一個典型的硫解酶結(jié)構(gòu)，如圖1B所示，活性口袋由三部分構(gòu)成：一是從活性中心一直延伸到酶表面的、狹長的接受起始單元脂肪酰輔酶A的結(jié)合通道；二是酶的催化中心，由三聯(lián)催化中心 (Cys-His-Asn，CHN) 所構(gòu)成，負責延伸單元與起始單元的碳碳鍵的形成；三是能夠容納乙?；蛘吒L側(cè)鏈的一個額外的底物接納口袋。雖然在米曲霉中，基因表達后的產(chǎn)物是接受四碳或者五碳的酰基輔酶A所產(chǎn)生的，但CsyB存在一個長約16 ?的底物起始單元結(jié)合通道，顯然從該通道的長度和大小上分析，可以容納更大的底物，這一特點與另外兩個接受長鏈底物的酶極為相似，即粗糙脈孢霉的2′-氧烷基雷瑣酸合成酶 (2′-oxoalkylresorcylic acid synthase，ORAS) 和米曲霉的CsyA[25]。這兩個酶的產(chǎn)物分別是五縮酮烷基間苯二酚酸(pentaketide alkylresorcylic acid)和二羥基苯甲酸(dihydroxybenzoic acid)。另外，CsyB與ORAS和米曲霉來源的CsyA分別具有37%和45%的氨基酸序列一致性。因此，有理由相信CsyB可以接受更多復(fù)雜長鏈的底物。為了進一步研究CsyB的底物多樣性，我們將CsyB在大腸桿菌中進行異源表達，希望借助大腸桿菌這個具有長鏈脂肪酸前體的系統(tǒng)，對CsyB的底物耐受性進行更為全面的考察。

圖1 CsyB催化的酶反應(yīng)(A) 及其蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)(B)

1 材料與方法

1.1 材料

表達質(zhì)粒pET28a和大腸桿菌BL21 (DE3) 購自美國NOVAGEN公司。氯化鈉、瓊脂、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropyl β-D- thiogalactoside, IPTG) 購自上海生物工程有限公司；乙腈、乙酸乙酯購自阿拉丁試劑 (上海) 有限公司；蛋白胨、酵母提取物購自英國OXOID公司；氘代氯仿、NMR核磁管購自美國NORELL公司；脫氫乙酸購自Sigma-Aldrich公司。培養(yǎng)基為Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基?；罨腆w培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，氯化鈉10 g，瓊脂10 g，去離子水定容至1 L?；罨后w培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，氯化鈉10 g，去離子水定容至1 L。發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，去離子水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 表達質(zhì)粒pET28a-CsyB的構(gòu)建

以米曲霉全基因組為模板，使用帶有限制性酶切位點Ⅰ的正向引物 (5′-CCTATCGAACCGTTACCGAC-3′) 和帶有Ⅰ的酶切位點的反向引物 (5′-AATTTATGC GTGCAGATACGAGC-3′)為引物，對基因進行擴增。擴增程序如下：預(yù)熱95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；最后，延伸72 ℃ 10 min。使用適量的快速限制性內(nèi)切酶FastDigestⅠ和Ⅰ，對質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進行雙酶切 (37 ℃ 3 h)，然后將酶切產(chǎn)物進行膠回收，在16 ℃下連接3 h，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌體PCR，對陽性克隆進行酶切和測序驗證，對測序正確的轉(zhuǎn)化子，擴大培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至表達宿主BL21 (DE3) 中待用。

1.2.2 重組大腸桿菌發(fā)酵液的制備

將保藏在–20 ℃冰箱甘油中的含有表達載體pET28-CsyB的大腸桿菌BL21 (DE3) 活化，使用接種環(huán)將甘油保藏的菌種在含有卡那霉素抗性 (50 μg/mL) 的活化固體培養(yǎng)基平板上劃線，置于37 ℃培養(yǎng)過夜。用滅菌牙簽挑取生長良好的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素抗性 (50 μg/mL) 的液體活化液體培養(yǎng)基5 mL中，置于37 ℃培養(yǎng)7–8 h，然后，按照0.1%的接種率接種到含有卡那霉素抗性 (50 μg/mL) 的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)基600值達到0.6時，將誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度設(shè)為 0.5 mmol/L進行誘導(dǎo)，在25 ℃條件下培養(yǎng)2–3 d。

1.2.3 重組大腸桿菌發(fā)酵提取物的提取與粗分

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，使用德國BECKMAN COULTER J-26 XP離心機，5 000 r/min離心20 min，將菌體與菌液分離，取上層菌液，使用分液漏斗，以乙酸乙酯為萃取溶劑，按體積比1∶1萃取3次，收集乙酸乙酯層，使用EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其減壓濃縮獲得粗浸膏，通過減壓硅膠柱層析，以氯仿甲醇 (體積比分別為10%、30%、50%、70%、90%和100%) 為流動相進行梯度洗脫，獲得6個組分。將主要含有新產(chǎn)物的3號和4號組分，使用Agilent 1260的半制備液相色譜儀進行分離，使用的是反相柱Agilent ZORBAX SB-C18 5 μm (9.3 mm× 250 mm)，程序為：20%乙腈，洗脫5 min；20%–55%乙腈，洗脫5 min；55%–65%乙腈，洗脫5 min；65%–100%乙腈，洗脫8 min；最后，100%乙腈洗脫10 min，紫外檢測器的吸收為310 nm。流動相分別為A：超純水 (0.05%三氟乙酸 (Trifluoroacetic acid，TFA))；B：乙腈 (0.05% TFA)，以3 mL/min的流速進行分離，將收集的各個產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，放于4 ℃冰箱保存。

1.2.4 重組大腸桿菌發(fā)酵提取物組分的HPLC以及LC-HRMS的分析

對粗浸膏以及劃段后的6個組分進行HPLC分析，使用分析液相色譜儀Ultimate 3000 Thermo Scientific Dionex公司進行分析，使用的是菲羅門反相柱Gemini?5 μm C18 (4.6 mm×250 mm)，程序：20%乙腈，洗脫5 min；20%–55%乙腈，洗脫 5 min；55%–65%乙腈，洗脫5 min；65%–100%乙腈，洗脫8 min；最后，100%乙腈洗脫10 min。紫外檢測器的吸收為310 nm，流動相分別為A：超純水 (0.05% TFA)；B：乙腈 (0.05% TFA)，以1 mL/min的流速進行分析。

對分離的新產(chǎn)物進行LC-HRMS分析，使用Water UPLC-QTOF-MS/MS型號液質(zhì)進行產(chǎn)物的分析，使用的是高效反相柱ACQUITY UPLC HSS T3 C18 (2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，程序為：20%乙腈，洗脫5 min；20%–55%乙腈，洗脫5 min；55%–65%乙腈，洗脫5 min；65%–100%乙腈，洗脫8 min；最后，100%乙腈洗脫10 min。紫外檢測器的吸收為310 nm，流動相分別為A：超純水 (0.5%乙酸)；B：乙腈 (0.5%乙酸)，以0.5 mL/min的流速進行分析。離子掃描模式為：ESI-正離子模式；掃描范圍：100–1 200 Da。

1.2.5 重組大腸桿菌發(fā)酵提取物組分的NMR分析

將分離得到的新產(chǎn)物稱重，溶解在200 μL的氘代氯仿中，用移液器小心地轉(zhuǎn)移入核磁管中，在800兆美國Agilent 1001核磁共振儀中進行一維核磁共振譜氫譜和碳譜，以及二維核磁共振譜COSY譜、HMQC譜和HMBC譜的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相的結(jié)果分析

從高效液相結(jié)果可以看出，與對照菌株相比，在含有CsyB基因的重組大腸桿菌的發(fā)酵液中，明顯出現(xiàn)了12個新峰，而且這些新峰的特征紫外吸收峰和之前報道的csypyrone B1-3化合物的紫外吸收峰完全一致，都出現(xiàn)在310 nm處，說明這些產(chǎn)生的新峰形成的都是csypyrone的結(jié)構(gòu)類似物。因此，這些產(chǎn)物都是CsyB在大腸桿菌中表達后，利用大腸桿菌中自身的代謝物中間體為底物所形成的新產(chǎn)物。為了便于說明，將其命名為化合物1–12 (圖2)。從這12個化合物的分布看，化合物1出峰時間較早，在11.6 min出峰，而其他11個產(chǎn)物均在大約30–40 min出峰。這說明化合物1的極性較大，而其他11個產(chǎn)物的極性相對較小，因此，化合物1可能是短鏈的產(chǎn)物，而其他產(chǎn)物可能是脂肪酸鏈較長的產(chǎn)物。從產(chǎn)量看，化合物1的產(chǎn)量明顯高于其他11個產(chǎn)物，而且呈現(xiàn)出一種逐漸遞減的趨勢，原因可能是酶的底物特異性所引起的或者是反應(yīng)前體在大腸桿菌中的產(chǎn)量差異所引起的。

圖2 含表達質(zhì)粒pET28a-CsyB的重組大腸桿菌的高效液相圖

2.2 LC-HRMS的結(jié)果分析

根據(jù)之前HPLC分析的結(jié)果，對重組大腸桿菌發(fā)酵提取物組分中的化合物1–12進行高分辨率分子量的測定。將分析的結(jié)果匯總在表1中，并根據(jù)csypyrone類化合物推測了這些化合物的分子式?；衔?的實測分子量是168.043 7，與預(yù)測分子量168.042 3符合，根據(jù)csypyrone的骨架可以判斷，它是由兩分子乙酰乙酰輔酶A自身縮合而成的最小的csypyrone化合物脫氫乙酸，通過與該已知化合物的標準品比較，1和脫氫乙酸完全一致?；衔?、7、9和11的實測分子量分別是280.165 3、308.196 4、336.231 2和364.263 2，與預(yù)測分子量280.167 5、308.198 8、336.230 1和364.261 4相符合，與脫氫乙酸相差分子量分別為112、140、168和196，因此，這4個化合物與脫氫乙酸分別相差4、5、6和7個碳二單元 (C2H4)，說明這4個化合物是在脫氫乙酸的基礎(chǔ)上，起始單元更加長的產(chǎn)物。根據(jù)分子量大小，可以推測化合物2、7、9和11是由起始單元分別為癸酰輔酶A、月桂酰輔酶A、肉蔻酰輔酶A以及軟脂酰輔酶A為起始底物合成出來的，它們都是飽和長鏈的csypyrone化合物。

表1 Csypyrone衍生物的分子量

化合物6、8和10的實測分子量分別是306.182 6、334.212 3和362.244 3，與預(yù)測分子量306.183 1、334.214 4和362.245 7相符合，比7、9和11分子量少2，因此，6、8和10分別比7、9和11多出一個雙鍵結(jié)構(gòu)。另外，化合物12的實測分子量是390.275 5，與預(yù)測分子量390.277 0相符合，分子量比11多出28，也就是說比化合物11多出一個碳二單元。值得一提的是，化合物12的起始底物是硬脂酰輔酶A，碳鏈長度達到18，是目前CsyB可以接受的最長起始底物。因此，化合物6、8、10和12都是由含一個雙鍵的癸酰輔酶A、月桂酰輔酶A、肉蔻酰輔酶A以及軟脂酰輔酶A為起始底物合成出來的，它們都是含有一個雙鍵的不飽和長鏈的csypyrone化合物。

化合物3、4和5的實測分子量分別為350.216 2、352.231 4和376.231 8，與預(yù)測分子量350.217 1、352.232 8和376.232 7相符合。化合物3、4和5分別比化合物8、9和10的分子量多出16，推測化合物3、4和5是化合物8、9和10的羥基化的產(chǎn)物。因此，化合物3和5是一類羥基化的飽和長鏈的csypyrone化合物，化合物4是一個羥基化的含有雙鍵的不飽和長鏈的csypyrone化合物。

2.3 NMR的結(jié)果分析

我們選取產(chǎn)量相對較高、結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的含有羥基的2個csypyrone化合物3和4進行了詳細的結(jié)構(gòu)鑒定，完成了氫譜、碳譜、COSY譜、HMBC譜以及HMQC譜的測定，結(jié)果見表2?；衔?和4推測的結(jié)構(gòu)如圖3所示，3和4的結(jié)構(gòu)是非常接近的，在氫譜上，3出現(xiàn)13個信號，4出現(xiàn)9個信號，吡喃酮環(huán)上的碳2、3、4、6位的氫沒有信號，碳5位分別在化學(xué)位移6.02和6.03處出現(xiàn)特征信號峰，在乙?；系?位碳沒有信號，從而確定了csypyrone的基本骨架。在3的氫譜中，化學(xué)位移5.32和5.36的位置多出兩個多重峰，這說明在3中存在一個雙鍵，而在4的氫譜中，由于沒有雙鍵，在化學(xué)位移1.25左右處出現(xiàn)了嚴重的重疊，另外，3和4分別在化學(xué)位移4.06、4.04處出現(xiàn)了信號，是連接羥基的特征峰。在碳譜上，它們都出現(xiàn)21個信號，化合物3的碳14位和15位的化學(xué)位移分別是128.95和130.98，這些結(jié)果都說明3在碳14位和碳15位之間比4多出一個雙鍵。另外，3和4的碳10位的化學(xué)位移分別出現(xiàn)在69.09和69.42，說明這個位置的碳原子可能連上了一個羥基基團。

表2 3和4的氫譜和碳譜數(shù)據(jù)

圖3 3和4的1H-1H COSY譜和HMBC譜中的相關(guān)

在二維譜COSY譜中，各相鄰近碳之間的氫發(fā)生相關(guān)，吡喃酮環(huán)上的數(shù)據(jù)和已經(jīng)報道的csypyrone化合物完全相同。在長鏈部分，可以檢測到明顯的1H-1H化學(xué)相關(guān) (圖3)，如9和10、11和12、12和13、13和14、15和16、16和18、18和19、19和20、20和21。HMBC的信號也較為清楚 (圖3)，可以看到相關(guān)發(fā)生在3和5、3和8、5和6、5和9、6和9、7和8、9和10、11和12、12和13、11和13、13和14、15和16、16和18、17和19、19和20、19和21、20和21。另外，HMQC的結(jié)果也歸納在表2中。這樣，化合物3和4的結(jié)構(gòu)就完成了解析。

2.4 新產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其生物合成途徑的推測

根據(jù)化合物3和4的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及前面各化合物的高分辨分子量的結(jié)果，可以對CsyB在大腸桿菌中表達所產(chǎn)生的新產(chǎn)物1–12的結(jié)構(gòu)作出推測，將這些結(jié)構(gòu)歸納到圖4中?；衔?是CsyB通過兩分子乙酰乙酰輔酶A一步縮合而成的，或者是由一分子乙酰輔酶A、一分子丙二酰輔酶A和一分子乙酰乙酰輔酶A反應(yīng)所得?；衔?、7、9和11是分別通過一分子不同的起始單元癸酰輔酶A、月桂酰輔酶A、肉蔻酰輔酶A或者軟脂酰輔酶A，然后接受一分子丙二酰輔酶A和一分子乙酰乙酰輔酶A縮合而成的?；衔?、8、10和12同樣是先由不同的起始單元，即都含有一個雙鍵的月桂酰輔酶A、肉蔻酰輔酶A、軟脂酰輔酶A或者硬脂酰輔酶A，然后接受一分子丙二酰輔酶A和一分子乙酰乙酰輔酶A縮合而成的。化合物4的起始單元換為一個含有羥基的肉蔻酰輔酶A，然后，接受一分子丙二酰輔酶A和一分子乙酰乙酰輔酶A縮合而成的?；衔?和5的起始單元換為一個既含有羥基又含有雙鍵的肉蔻酰輔酶A和軟脂酰輔酶A，然后接受一分子丙二酰輔酶A和一分子乙酰乙酰輔酶A縮合而成的。這些中間體都是來源于大腸桿菌的脂肪酸合成途徑，盡管對大腸桿菌的這些中間體研究較少，但是，通過本實驗的結(jié)果和之前的研究[26-28]，更加明確了大腸桿菌脂肪酸合成途徑和合成過程中的一些中間體。在這個脂肪酸合成的過程中，脂肪酸的延伸是通過眾多的Fab酶完成的，如FabH、FabB/F、FabG等。每次鏈伸長一個碳二單元要經(jīng)歷循環(huán)往復(fù)的過程，縮合一個來源于丙二酰輔酶A的含有羰基的碳二單元，然后還原羰基基團為羥基基團，接著，脫水去掉羥基基團形成雙鍵，最后，還原雙鍵形成單鍵，完成碳二單元的延伸。在這個過程中會出現(xiàn)含有雙鍵、羥基或同時含有雙鍵和羥基的中間體。這些與ACP蛋白連接的脂肪酰中間體通過與丙二酰輔酶A或者丙二酰ACP反應(yīng)，形成長鏈的二酮的中間體，這個中間體和乙酰乙酰輔酶A或乙酰乙酰ACP發(fā)生非脫羧的克萊森縮合反應(yīng)，生產(chǎn)最終csypyrone產(chǎn)物。

圖4 推測的化合物1–12的結(jié)構(gòu)

3 討論

米曲霉來源的CsyB是一個多功能的Ⅲ型PKS，它與結(jié)核分枝桿菌烷基吡喃酮合成酶 PKS18具有26%的序列一致性，與粗糙脈孢菌2′-氧烷基雷瑣酸合成酶 ORAS具有37%的同源性，它們通過脂肪酰輔酶A與丙二酰輔酶A的迭代縮合，產(chǎn)生長鏈的烷基吡喃酮和烷基雷瑣酸。PKS18和ORAS的晶體學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了一個狹長的綁定脂肪?；o酶A的疏水通道，研究表明這個通道具有廣泛的底物多樣性。在CsyB的晶體結(jié)構(gòu)中同樣發(fā)現(xiàn)了這樣的一個通道，這條通道從酶的活性中心延伸到蛋白質(zhì)的表面，使得蛋白質(zhì)可以接受多種不同類型的脂肪酰輔酶A作為底物。因此，Ⅲ型PKS酶功能的多樣性被認為是和其起始底物的兼容性密切相關(guān)。

本研究通過在大腸桿菌體內(nèi)表達CsyB蛋白，得到了一系列csypyrone的衍生物，這一類化合物具有乙?；拎奶脊羌埽拇呋^程是由連續(xù)的兩步縮合反應(yīng)完成，先接受一分子起始單元，然后，縮合一分子丙二酰輔酶A，最后，縮合一分子乙酰乙酰輔酶A。CsyB對起始單元的特異性上，表現(xiàn)出很寬的范圍和很強的容忍度，最短可以接受碳鏈長度為2的乙酰輔酶A，最長可以接受碳鏈長度為18的硬脂酰輔酶A。除了可以接受飽和脂肪酰輔酶A外，還可以接受不飽和脂肪酰輔酶A。另外，還可以接受3個具有羥基修飾的脂肪酰輔酶A。歸根到底，這些特點都與其特有的結(jié)構(gòu)密不可分，長且寬大的底物結(jié)合通道使其具有了可以跟更多底物結(jié)合的可能性。進而，在大腸桿菌體內(nèi)完成了csypyrone類化合物的合成，得到了一系列新的產(chǎn)物。同時，在這個過程中，對大腸桿菌中的脂肪酸代謝中的中間體也有了更加全面的了解。

[1] Gokhale RS, Sankaranarayanan R, Mohanty D. Versatility of polyketide synthases in generating metabolic diversity. Curr Opin Struct Biol, 2007, 17(6): 736–743.

[2] Quadri LEN. Biosynthesis of mycobacterial lipids by polyketide synthases and beyond. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2014, 49(3): 179–211.

[3] KuzmaKuzniarska M, Cornell HR, Moneke MC, et al. Lovastatin-mediated changes in human tendon cell. J Cell Physiol, 2015, 230(10): 2543–2551.

[4] Maksimenko A, Dosio F, Mougin J, et al. A unique squalenoylated and nonpegylated doxorubicin nanomedicine with systemic long-circulating properties and anticancer activity. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(2): E217–E226.

[5] Zhou H, Li YR, Tang Y. Cyclization of aromatic polyketides from bacteria and fungi. Nat Prod Rep, 2010, 27(6): 839–868.

[6] Staunton J, Weissman KJ. Polyketide biosynthesis: a millennium review. Nat Prod Rep, 2001, 18(4): 380–416.

[7] Hertweck C. The biosynthetic logic of polyketide diversity. Angew Chem Int Ed, 2009, 48(26): 4688–4716.

[8] Jing SS, Zhao SJ. A comprehensive overview of type III polyketide synthases from plants: molecular mechanism and application perspective-a review. Chin J Biotech, 2009, 25(11): 1601–1607 (in Chinese).晶生書, 趙樹進. 植物Ⅲ型聚酮合酶的分子機制與應(yīng)用前景. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(11): 1601–1607.

[9] Su SY, Teng C, Zhang W, et al. Progress on type III polyketide synthase from bacteria. J Agric Sci Technol, 2013, 15(6): 119–129 (in Chinese).蘇世友, 滕超, 張維, 等. 細菌Ⅲ型聚酮合酶研究進展. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2013, 15(6): 119–129.

[10] Jang MS, Cai LN, Udeani GO, et al. Cancer chemopreventive activity of resveratrol, a natural product derived from grapes. Science, 1997, 275(5297): 218–220.

[11] Frankel EN, German JB, Kinsella JE, et al. Inhibition of oxidation of human low-density lipoprotein by phenolic substances in red wine. Lancet, 1993, 341(8843): 454–457.

[12] Frankel EN, Waterhouse AL, Kinsella JE. Inhibition of human LDL oxidation by resveratrol. Lancet, 1993, 341(8852): 1103–1104.

[13] Abe I, Morita H. Structure and function of the chalcone synthase superfamily of plant type III polyketide synthases. Nat Prod Rep, 2010, 27(6): 809– 838.

[14] Austin MB, Noel JP. The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases. Nat Prod Rep, 2003, 20(1): 79–110.

[15] Katsuyama Y, Horinouchi S.Microbial type III polyketide synthases//Mander LM, Liu HW. Comprehensive Natural Products II: Chemistry and Biology,Volume 1: Natural Products Structural Diversity-I Secondary Metabolites: Organization and Biosynthesis. Oxford: Elsevier, 2010: 147–170.

[16] Sankaranarayanan R, Saxena P, Marathe UB, et al. A novel tunnel in mycobacterial type III polyketide synthase reveals the structural basis for generating diverse metabolites. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11(9): 894–900.

[17] Goyal A, Saxena P, Rahman A, et al. Structural insights into biosynthesis of resorcinolic lipids by a type III polyketide synthase in. J Struct Biol, 2008, 162(3): 411–421.

[18] Lv YY, Xiao J, Pan L. Type III polyketide synthase is involved in the biosynthesis of protocatechuic acid in. Biotechnol Lett, 2014, 36(11): 2303–2310.

[19] Seshime Y, Juvvadi PR, Kitamoto K, et al. Identification of csypyrone B1 as the novel product oftype III polyketide synthase CsyB. Bioorg Med Chem, 2010, 18(12): 4542–4546.

[20] Hashimoto M, Ishida S, Seshime Y, et al.type III polyketide synthase CsyB uses a fatty acyl starter for the biosynthesis of csypyrone B compounds. Bioorg Med Chem Lett, 2013, 23(20): 5637–5640.

[21] Hashimoto M, Koen T, Takahashi H, et al.CsyB catalyzes the condensation of two β-ketoacyl-CoAs to form 3-acetyl-4-hydroxy-6-alkyl-α-pyrone. J Biol Chem, 2014, 289(29): 19976–19984.

[22] Hashimoto M, Nonaka T, Fujii I. Fungal type III polyketide synthases. Nat Prod Rep, 2014, 31(10): 1306–1317.

[23] Mori T, Yang DF, Matsui T, et al. Structural basis for the formation of acylalkylpyrones from two β-ketoacyl units by the fungal type III polyketide synthase CsyB. J Biol Chem, 2015, 290(8): 4214–5225.

[24] Yang DF, Mori T, Matsui T, et al. Expression, purification and crystallization of a fungal type III polyketide synthase that produces the csypyrones. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2014, 70(6): 730–733.

[25] Seshime Y, Juvvadi PR, Kitamoto K, et al.type III polyketide synthase CsyA is involved in the biosynthesis of 3,5-dihydroxybenzoic acid. Bioorg Med Chem Lett, 2010, 20(16): 4785–4788.

[26] Feng SX, Ma JC, Yang J, et al.fatty acid composition is determined by interaction of two 3-ketoacyl-acyl carrier protein reductases encoded on separate replicons. BMC Microbiol, 2015, 15: 223.

[27] Brock DJH, Bloch K. Control of the synthesis of long-chain fatty acids and triacetic acid in. Biochem Biophys Res Commun, 1966, 23(5): 775–780.

[28] Kass LR, Bloch K. On the enzymatic synthesis of unsaturated fatty acids in. Proc Natl Acad Sci USA, 1967, 58(3): 1168–1173.

(本文責編 郝麗芳)

synthesis of csypyrone derivatives by exploring the substrate diversity of start units of type Ⅲ polyketide synthase CsyB

Lixia Pan1, Jing Zhu1, Qingyan Wang1, Naikun Shen1, Yi Li1, and Dengfeng Yang1,2

1 Guangxi Key Laboratory of Biorefinery, Guangxi Biomass Industrialization Engineering Institute, National Engineering Research Center of Non-food Biorefinery, State Key Laboratory of Non-Food Biomass and Enzyme Technology, Guangxi Academy of Sciences, Nanning 530007, Guangxi, China 2 Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and Combinatorial Biosynthesis Chemistry, Guangxi Beibu Gulf Marine Research Center, Guangxi Academy of Sciences,Nanning 530007, Guangxi, China

As a novel fungal type Ⅲ polyketide synthase, CsyB fromcan sequentially accept one molecular short chain fatty acyl CoA as start unit, one molecular malonyl-CoA and one molecular acetoacetyl-CoA as extend unit to produce the short chain csypyrone B1-3. On the basis of crystal structure of CsyB, a fatty acyl CoA binding tunnel of a length of about 16 ? is located in its active center that is proposed to accept diversified start units. In order to examine the substrate diversity of CsyB,gene was introduced and expressed inthat contained a number of precursors of long chain fatty acyl CoA. The results of HPLC revealed that a series of long chain csypyrone derivatives were detected in the recombinant strain in comparison with the control strain. These new csypyrone compounds were preliminarily analyzed by UV-visible spectroscopy and LC-HRMS. Three hydroxylated csypyrones were intensively determined by 1D and 2D NMR experiments, especially the position of the hydroxyl group in these compounds. These results demonstrate that CsyB exhibits a broad substrate specificity, which not only can accept the long chain saturated or unsaturated fatty acyl CoA as substrate, but also accept hydroxylated long chain fatty acyl CoA.

type Ⅲ polyketide synthase, CsyB, substrate diversity,synthesis, csypyrone

October 29, 2017;

December 11, 2017

National Natural Science Foundation of China (No. 31660251), Natural Science Foundation of Guangxi Province, China (No. 2017GXNSFAA198010).

10.13345/j.cjb.170426

Dengfeng Yang. Tel: +86-771-2503973; E-mail: yangdengfeng@gxas.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 31660251), 廣西自然科學(xué)基金 (No. 2017GXNSFAA198010) 資助。