微生物尿酸氧化酶的篩選、酶學(xué)性質(zhì)及重組表達(dá)

咸靜女，郭鑫，李波，彭海波，汪小龍，張建業(yè)，陳剛

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微生物尿酸氧化酶的篩選、酶學(xué)性質(zhì)及重組表達(dá)

咸靜女，郭鑫，李波，彭海波，汪小龍，張建業(yè)，陳剛

中國(guó)海洋大學(xué)，山東 青島 266007

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

尿酸氧化酶 (Urate oxidase，Uox) 是一種催化尿酸氧化為尿囊素的酶，常用于尿酸的檢測(cè)以及痛風(fēng)和高尿酸血癥治療。文中從土壤中篩選出一株Uox高產(chǎn)菌株OUC-1，經(jīng)16S rRNA部分基因序列分析，與苛求芽孢桿菌序列相似度達(dá)99%。OUC-1的Uox經(jīng)純化后，分析表明該酶反應(yīng)最適pH和溫度分別為10.0和40 ℃；Uox以尿酸為底物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)m值為 (0.15±0.04) mmol/L (=5)。Mg2+能夠提高該酶性活性，而Zn2+和SDS能強(qiáng)烈抑制該酶的酶活。參考GenBank中苛求芽孢桿菌基因組中的基因序列，成功擴(kuò)增出基因，通過(guò)SWISS-MODEL對(duì)Uox空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，推測(cè)該酶是同源四聚體，單亞基分子量為35.38 kDa。文中將基因克隆并在大腸桿菌中表達(dá)，為后續(xù)的Uox的性能改造提供條件和技術(shù)支持。

尿酸氧化酶，苛求芽孢桿菌OUC-1，酶學(xué)性質(zhì)，重組尿酸氧化酶

尿酸氧化酶(Urate oxidase, Uox, EC1.7.3.3)是生物體內(nèi)嘌呤代謝的關(guān)鍵酶，催化尿酸氧化形成尿囊素。研究發(fā)現(xiàn)許多物種中有Uox存在，然而在高等哺乳動(dòng)物尤其是猿和人類體內(nèi)卻缺乏具有生物活性的Uox[1]，尿酸在人體內(nèi)的累積可導(dǎo)致痛風(fēng)癥[2-4]。近年來(lái)隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，攝入嘌呤成分的增多，調(diào)查發(fā)現(xiàn)成年人痛風(fēng)發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)[5]，同時(shí)流行病學(xué)和臨床研究證實(shí)了血液中尿酸升高與心血管疾病的發(fā)生有重要的關(guān)聯(lián)[6-7]。

隨著研究的深入，在尿酸的檢測(cè)、痛風(fēng)和高尿酸癥治療方面，Uox的應(yīng)用潛力也逐漸被發(fā)現(xiàn)[8-9]。利用Uox檢測(cè)尿酸的方法具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)而成為常用的臨床檢測(cè)方法[10]。此外Uox在疾病治療方面可通過(guò)直接注射Uox快速降低血液中的尿酸含量，用于痛風(fēng)癥的長(zhǎng)期治療[11]。研究發(fā)現(xiàn)自然界中存在大量的微生物來(lái)源的Uox資源[12-14]，這些野生菌產(chǎn)生的Uox雖然在體外具有一定降解尿酸活性，但由于結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性上的缺陷，限制了其在檢測(cè)和臨床的應(yīng)用。因此利用工程菌株異源表達(dá)基因，并通過(guò)分子雜交和理性設(shè)計(jì)等手段改造Uox是獲得具有臨床價(jià)值藥物的重要途徑。

本研究通過(guò)從環(huán)境微生物中篩選高產(chǎn)Uox菌株，發(fā)酵后純化Uox，并對(duì)最適溫度、pH等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究。通過(guò)合理設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該菌的基因，進(jìn)行克隆和在大腸桿菌中異源表達(dá)，為后續(xù)基因突變表達(dá)庫(kù)的構(gòu)建及篩選高穩(wěn)定性和高底物親和力的Uox奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

本研究采用的菌株大腸桿菌DH5α、BL21和質(zhì)粒pET28a等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

尿酸降解微生物富集培養(yǎng)基(g/L)：硫酸鎂0.5，氯化鈉0.1，磷酸氫二鉀0.5，磷酸二氫鉀0.5，尿酸2，pH 7.0；固體分離培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

產(chǎn)尿酸氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基(/L)：蛋白胨10 g，蔗糖20 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂1 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸亞鐵10 mg，尿酸1.5 g，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)尿酸氧化酶菌株的篩選

稱取5 g不同環(huán)境來(lái)源的土壤樣品，加入到富集培養(yǎng)基于30 ℃、120r/min振蕩富集培養(yǎng)3–5 d。 梯度稀釋后涂布在含有尿酸的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取含有透明圈的菌落，經(jīng)分離純化后，接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3–5 d，檢測(cè)發(fā)酵液中Uox的活性，篩選出高產(chǎn)Uox的菌株進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)和尿酸氧化酶酶活性檢測(cè)

產(chǎn)酶發(fā)酵過(guò)程中定時(shí)取樣檢測(cè)菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵液Uox酶活。菌體生長(zhǎng)通過(guò)檢測(cè)600的值確定。Uox活性根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]，將每分鐘轉(zhuǎn)換1 μmol尿酸的量定義為單位酶活。檢測(cè)反應(yīng)液尿酸溶液在293nm紫外光下吸光值單位時(shí)間的減少量來(lái)確定。具體公式如下：

1.2.3 產(chǎn)酶菌株16S rRNA基因測(cè)序及鑒定

提取產(chǎn)酶菌株的基因組DNA，利用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17-18]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化測(cè)序后，序列通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast工具與GenBank中核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定與已知菌種的相似關(guān)系。DNA測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.4 產(chǎn)酶菌株Uox的純化

產(chǎn)酶菌株發(fā)酵結(jié)束后，離心分別獲取菌體和發(fā)酵液。菌體經(jīng)超聲破碎離心收集上清液，即粗酶液。將胞內(nèi)外粗酶液經(jīng)50 mL透析管 (10 kDa)初步脫鹽濃縮后，通過(guò)AKTA蛋白純化系統(tǒng)依次經(jīng)DEAE-52陰離子交換層析[19]和丙烯基葡聚糖Sephacryl S-300凝膠過(guò)濾層析[20]對(duì)Uox酶進(jìn)行進(jìn)一步純化。

1.2.5 Uox酶學(xué)性質(zhì)分析

將純化好的Uox酶液加入合適的反應(yīng)體系中，分析溫度 (25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃、45 ℃、48 ℃、50 ℃、52 ℃、55 ℃、58 ℃、60 ℃)、pH (7–12)、常見(jiàn)離子 (Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Fe3+和Ca2+) 及酶抑制劑(EDTA、咪唑、SDS) 對(duì)Uox酶活的影響，每組實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置3個(gè)平行組。

在酶熱穩(wěn)定性研究中，反應(yīng)液分別經(jīng)不同溫度處理10、20、30min后檢測(cè)酶活變化；檢測(cè)金屬離子對(duì)Uox影響實(shí)驗(yàn)中，離子的濃度設(shè)置為 0–6mmol/L，除Ca2+使用CaCl2外，其他金屬離子都使用其硫酸鹽化合物；檢測(cè)酶抑制劑EDTA、咪唑、SDS對(duì)Uox活性的影響，抑制劑的濃度分別設(shè)置為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0 mmol/L。

1.2.6 苛求芽孢桿菌OUC-1的Uox米氏常數(shù) (m) 測(cè)定

在25 ℃條件下，0.2 mmol/L硼酸鈉反應(yīng)體系(pH 9.0)中，測(cè)試不同濃度的尿酸(0.1–0.5 mmol/L)底物，在293nm處1min內(nèi)光吸收的減少量。根據(jù) Lineweaver Burk法[21]作圖計(jì)算該尿酸酶的m。

1.3 苛求芽孢桿菌B. fastidiosus OUC-1來(lái)源的uox基因的克隆、表達(dá)

基因擴(kuò)增：根據(jù)GenBank中已知的保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增OUC-1菌的基因全序列的引物[22-23]，為便于克隆測(cè)序，分別在正向和反向引物序列的5?端引入酶HⅠ和dⅢ酶切位點(diǎn)，具體引物序列如下。正向引物UoxF：5?-CGGG ATCCATGTTTTATGGTAAAGGCG-3?；反向引物UoxR：5?-CCCAAGCTTTCATAGTGCA ACATACTCCG-3?。PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[24-25]進(jìn)行。

表達(dá)載體pET28a/uox的構(gòu)建：基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a分別用HⅠ和d Ⅲ雙酶切后回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET28a/，重組質(zhì)粒序列測(cè)定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

大腸桿菌重組表達(dá)Uox蛋白的分離純化：含有Uox重組子表達(dá)的工程大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后48 h收獲菌體，7 500 r/min離心 20 min后收集菌體，菌體經(jīng)超聲波破菌后離心，上清和重懸的沉淀分別經(jīng)12% SDS-PAGE 分析來(lái)確定其為胞內(nèi)可溶或包涵體表達(dá)，重組蛋白通過(guò)AKTA蛋白純化系統(tǒng)，經(jīng)親和層析柱純化[26]后檢測(cè)酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)尿酸氧化酶菌株的篩選和鑒定

經(jīng)過(guò)富集篩選從環(huán)境樣品中純化出9株具有產(chǎn)透明圈的菌株，經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rRNA部分序列并測(cè)序進(jìn)行序列比對(duì)后，根據(jù)GenBank中菌落序列的相似性比對(duì)結(jié)果 (序列相似度>98％)，初步鑒定uo-331、uo-332、uo-333、uo-334、uo-335、uo-338為芽孢桿菌屬，uo-336、uo-411為假單胞菌屬，uo-412為微桿菌屬。根據(jù)透明圈的大小和發(fā)酵液酶活的初步測(cè)試，uo-338菌株的酶活最高，其16S rRNA序列與苛求芽孢桿菌基因序列(NR_113989) 相似性>99%。菌株經(jīng)進(jìn)一步的生理生化分析后確認(rèn)為苛求芽孢桿菌OUC-1，以下實(shí)驗(yàn)將針對(duì)該菌Uox酶進(jìn)行研究。

2.2 B. fastidiosus OUC-1的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖1) 顯示，OUC-1 經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)36 h時(shí)生長(zhǎng)量達(dá)到最高，隨后菌株的600值趨于穩(wěn)定。發(fā)酵液酶活在培養(yǎng)12 h前未檢測(cè)到Uox活性，24 h酶活達(dá)0.128 U/mL，到30 h時(shí)酶活性最高，達(dá)到0.183 U/mL，隨后酶活性逐漸下降。

圖1 B. fastidiosus OUC-1的生長(zhǎng)和酶活測(cè)定

2.3 B. fastidiosus OUC-1產(chǎn)Uox的純化

實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵液及菌體內(nèi)都檢測(cè)出Uox酶活性，發(fā)酵后細(xì)胞粗酶液經(jīng)超濾濃縮和進(jìn)一步的離子交換、凝膠層析純化后，胞內(nèi)外Uox酶活都有不同程度的提高 (表1)，胞內(nèi)Uox的比酶活提升了5倍，胞外Uox的比酶活則提升了13倍。SDS-PAGE結(jié)果(圖2) 也表明Uox經(jīng)純化后純度明顯提高，且主要分布在35–40 kDa之間。

表1 純化過(guò)程的酶活和比酶活

圖2 OUC-1胞外(A)、胞內(nèi) (B) 純化Uox的SDS-PAGE圖譜

2.4 苛求芽孢桿菌B. fastidiosus OUC-1來(lái)源Uox的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 Uox的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性研究

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 (圖3)，40 ℃為該酶的最適反應(yīng)溫度。溫度從25 ℃升高到40 ℃時(shí)，OUC-1 的Uox活性隨溫度的升高處于較平穩(wěn)的狀態(tài)，在40 ℃熱處理10 min后達(dá)到最高。當(dāng)溫度從48 ℃增高到55 ℃以上時(shí)，酶活從高點(diǎn)快速下降到8%左右，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其酶的 熱穩(wěn)定性也呈下降趨勢(shì)，尤其是在50 ℃和52 ℃熱處理30 min后酶活衰減較快。溫度繼續(xù)升高到60 ℃，酶活一直保持在較低的水平，此時(shí)延長(zhǎng)熱處理時(shí)間并不能使酶活快速降低。

2.4.2 pH對(duì)Uox酶活性的影響

以pH 9.0為參照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，反應(yīng)體系的pH從7.0升高到10.0過(guò)程中，Uox的相對(duì)酶活從30%升高到120%，之后隨pH從10.0升高到12.0，酶活呈快速下降趨勢(shì)，該Uox酶的最適pH應(yīng)在10.0左右。

圖3 溫度對(duì)Uox酶活的影響

圖4 pH對(duì)Uox酶活的影響

2.4.3 不同金屬離子對(duì)Uox活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5) 顯示出Zn2+對(duì)Uox酶活性有明顯的抑制作用，在較低濃度(0.5 mmol/L)時(shí)Uox相對(duì)酶活為11.15%；而Mg2+隨著濃度的增加能顯著提高Uox酶的活性，當(dāng)濃度達(dá)到6 mmol/L時(shí)，相對(duì)酶活高達(dá)163.27%。K+和Ca2+在測(cè)試濃度范圍內(nèi)對(duì)酶活無(wú)明顯影響。而Cu2+和Fe3+隨著濃度升高，其對(duì)Uox的抑制作用明顯，金屬M(fèi)n2+離子在測(cè)試濃度范圍可能對(duì)Uox活性略有抑制。

2.4.4 抑制劑對(duì)Uox活性的影響

圖6結(jié)果表明Uox酶活隨著SDS濃度升高而迅速降低，尤其當(dāng)SDS濃度高于3 mmol/L時(shí)，Uox幾乎沒(méi)有活性。咪唑在0.5–8 mmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)Uox無(wú)明顯影響。EDTA作為常見(jiàn)的金屬螯合劑，在0.5 mmol/L時(shí)相對(duì)酶活高達(dá)134%，對(duì)Uox具有明顯促進(jìn)作用，但隨著濃度的持續(xù)升高(>4 mmol/L)，其促進(jìn)作用減弱到對(duì)照的酶活水平。

圖5 不同離子對(duì)Uox酶活的影響

圖6 常見(jiàn)酶抑制劑對(duì)Uox酶活的影響

2.5 Uox的米氏常數(shù)(Km) 和Vmax測(cè)定

根據(jù)Lineweaver Burk作圖法求得苛求芽孢桿菌OUC-1尿酸氧化酶的m為(0.15± 0.04) mmol/L(=5)(圖7)，max為0.021 mol/(L·min)。米氏方程為：1/=7.01/+46.57。

2.6 uox基因的克隆和重組表達(dá)

2.6.1基因的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建

以苛求芽孢桿菌OUC-1的基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出大小約為900 bp的DNA片段，測(cè)序后序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站的ORF Finder轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)序列，利用SWISS-MODEL建模推測(cè)該酶為同源四亞基，單亞基的分子量為35.38 kDa，等電點(diǎn)pI為5.1。OUC-1的基因序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站的blastn和blastp分析工具與GenBank中的已知基因和Uox酶蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道[27]的29604的基因和Uox序列高度相似，同源性分別達(dá)到96%和97.5%，但單亞基的氨基酸序列上存在7個(gè)氨基酸的差別：D103S、K118Q、K207Q、A215P、T230S、N234T、E236D。

通過(guò)進(jìn)化樹(shù)分析 (圖8) 可看出OUC-1的Uox與其他種類Uox的同源性相對(duì)較低。利用UniProt網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白比對(duì)推測(cè)該菌的Uox活性位點(diǎn)為65位蘇氨酸 (T) 和66位的天冬氨酸 (D)、175位的苯丙氨酸 (F) 以及192位的精氨酸 (R)。

圖7 雙倒數(shù)作圖法測(cè)定Km

圖8 基于氨基酸序列的鄰接法 (N-J) 構(gòu)建的Uox系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)化樹(shù)

2.6.2 苛求芽孢桿菌.OUC-1的基因克隆及大腸桿菌異源表達(dá)

的基因在大腸桿菌重組表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)化后涂布在含有尿酸的固體培養(yǎng)基上，與對(duì)照組相比，含有尿酸氧化酶菌落的周?chē)炎兺该鳎f(shuō)明該重組子能分解Uox，進(jìn)一步對(duì)重組子測(cè)序分析證明Uox已在大腸桿菌中異源表達(dá)成功。重組子發(fā)酵液菌體超聲波破碎后所得上清液經(jīng)Ni柱親和層析純化獲得重組表達(dá)的Uox。酶活測(cè)試顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和未加誘導(dǎo)皆有Uox產(chǎn)生(圖9)，但未加IPTG的對(duì)照組全菌裂解液上清酶活為0.07 U/mL，而加入IPTG誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組酶活達(dá)2.32 U/mL，酶活提升30多倍。

3 討論

Uox作為醫(yī)學(xué)檢測(cè)試劑和治療用酶具有廣闊的市場(chǎng)前景。微生物是尿酸氧化酶的一個(gè)重要來(lái)源，具有易于培養(yǎng)和代謝類型多樣的特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外已有許多微生物尿酸酶研究報(bào)道[28-33]，本研究從土壤等環(huán)境樣品中篩選得到了多株產(chǎn)Uox的菌株，有假單胞菌、微桿菌、芽孢桿菌等菌株。其中苛求芽孢桿菌OUC-1產(chǎn)酶較高。OUC-1具有同時(shí)產(chǎn)生分泌性和細(xì)胞內(nèi)Uox酶的特點(diǎn)，但野生菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶依賴尿酸誘導(dǎo)，并且可同化的底物少，這提高了Uox的生產(chǎn)成本，尚需遺傳改良得以提高產(chǎn)率。野生菌株的遺傳背景相對(duì)復(fù)雜，提高酶活和改進(jìn)酶學(xué)性質(zhì)存在一定難度。將基因克隆到表達(dá)載體，一方面可利用工程菌直接生產(chǎn)Uox，也利于分子進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等分子改造快速改善酶的性能。本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的重組后Uox發(fā)酵產(chǎn)酶量達(dá)到了野生菌株的30倍，同時(shí)省去了添加價(jià)格昂貴的尿酸。

圖9 Uox表達(dá)的SDS-PAGE分析

本研究篩選的OUC-1產(chǎn)Uox由同源四聚體構(gòu)成，與1978年Bongaerts報(bào)道的 由2個(gè)36 kDa和2個(gè)39 kDa的亞基組成的SMG83 Uox異四聚體不同，后者只存在菌體胞內(nèi)，兩者在最適溫度上也存在差異[10,28]。在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上與ATCC 29604同源性非常高，僅有7個(gè)氨基酸差異，可能是同一種酶。其中有3個(gè)氨基酸T230S、N234T、E236D位于α螺旋 (225–238) 中，另外幾個(gè)氨基酸的電性和疏水性等性質(zhì)都存在變化，這些變化可能通過(guò)靜電網(wǎng)絡(luò)和空間結(jié)構(gòu)的改變對(duì)酶活性產(chǎn)生一定的影響。

OUC-1來(lái)源Uox的m為 0.15 mmol/L，明顯低于ATCC 29604 (0.22 mmol/L)[27]，也低于Bongaerts等早期報(bào) 道的SMG83產(chǎn)生的尿酸酶 (0.18 mmol/L)[28]，另外相對(duì)于Kai等[34]報(bào)道的一種微桿菌屬尿酸酶(0.31 mmol/L)，以及李想等[35]報(bào)道的芽孢桿菌胞內(nèi)尿酸酶(0.29 mmol/L)，OUC-1尿酸酶的m值較低，說(shuō)明其與底物親和性更強(qiáng)。

研究報(bào)道不同金屬離子對(duì)不同微生物來(lái)源的Uox活性的作用不同[36]。本研究設(shè)置了0.5–6.0 mmol/L 的不同離子濃度梯度，發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)Uox有明顯的促進(jìn)作用，并且隨著濃度的提高促進(jìn)作用更明顯，這在其他文獻(xiàn)中很少報(bào)道。而Zn2+對(duì)Uox活性有明顯的抑制作用，與報(bào)道的Zn2+對(duì)球形節(jié)桿菌[36]、SMG83[28]和微桿菌sp. ZZJ4-1[37]的尿酸酶抑制作用相似。之前研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對(duì)不同微生物尿酸酶也存在不同的作用，本研究隨Cu2+濃度升高，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，但仍與Cu2+表現(xiàn)出對(duì)FERM BP-360、sp. TB-90和來(lái)源[37]的Uox的強(qiáng)抑制作用有區(qū)別。

雖然OUC-1來(lái)源的Uox與ATCC 29604的Uox相似性非常高，但兩者在底物的親和力、離子對(duì)酶的影響方面還是有很大的差異，并且這些酶有些性質(zhì)的差異與氨基酸的變化之間可能存在關(guān)聯(lián)，尚需進(jìn)一步研究。

當(dāng)前應(yīng)用于檢測(cè)和臨床治療的Uox普遍存在熱穩(wěn)定差和免疫原性問(wèn)題，在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和應(yīng)用過(guò)程中容易失活。目前對(duì)熱穩(wěn)定性好的Uox研究較少。因此以重組表達(dá)的苛求芽孢桿菌基因?yàn)榛A(chǔ)，采用易錯(cuò)PCR或與其他尿酸氧化酶進(jìn)行分子進(jìn)化等技術(shù)，構(gòu)建Uox基因突變庫(kù)篩選和設(shè)計(jì)具有高耐熱和pH穩(wěn)定性Uox是今后研究的方向。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Screening, characterization and expression of microbial urate oxidase

Jingnü Xian, Xin Guo, Bo Li, Haibo Peng, Xiaolong Wang, Jianye Zhang, and Gang Chen

Ocean University of China, Qingdao 266007, Shandong, China

Urate oxidase (Uox), an enzyme catalyzing oxidation of uric acid to allantoin, is widely used as diagnostic reagents and for treatments of uarthritis and hyperuricemia diseases. In our study, a higher Uox producer, bacterial strain OUC-1, was isolated from soil samples. The 16S rRNA gene sequence of strain OUC-1 showed 99% identity to the homologous fragments of. After purification, Uox showed the optimal pH and temperature was 10.0 and 40 °C. Themvalue of Uox was (0.15±0.04) mmol/L (=5) with uric acid as the substrate. Uox activity was enhanced by Mg2+, and seriously inhibited by Zn2+and SDS. Then thegene ofOUC-1 was amplified and sequenced. The 3D structures of Uox, predicted with SWISS-MODEL, showed a homotetramer structure with a subunit molecular weight of 35.38 kDa. Finally, the gene coding for theUox was successfully cloned and heterologously expressed in,which provides theoretical basis and technical support for improvement of Uox in the future.

urate oxidase,OUC-1, enzymatic properties, recombinant urate oxidase

December 27, 2017;

February 26, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 41476090).

Gang Chen. E-mail: chengang@ouc.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 41476090) 資助。

2018-03-26

http//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180326.0926.002.html

10.13345/j.cjb.170524