云芝NADPH-細胞色素P450還原酶在大腸桿菌中表達及酶學特性分析

孫雪娃，何超，方澤民，肖亞中

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云芝NADPH-細胞色素P450還原酶在大腸桿菌中表達及酶學特性分析

孫雪娃1,2,3，何超1,2,3，方澤民1,2,3，肖亞中1,2,3

1 安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230601 2 現(xiàn)代生物制造安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601 3 安徽省微生物與生物催化工程技術研究中心，安徽 合肥 230601

金城. 2018酶工程專刊序言. 生物工程學報, 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

云芝具有很強的環(huán)境有機污染物降解能力，其煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細胞色素P450還原酶 (NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR) 為細胞色素P450酶 (Cytochrome P450s，CYPs) 提供電子，參與有機污染物的降解過程。序列分析顯示，云芝基因組擁有1個潛在CPR序列和多個潛在CYP序列。為深入研究云芝CPR參與細胞降解有機污染物的分子機制，實驗進行了云芝CPR在大腸桿菌中異源表達和酶學特性分析。結果表明，經IPTG誘導后，去除預測的N端膜錨定區(qū)域 (氨基酸殘基1–24) 的CPR蛋白 (CPRΔ24) 可在重組菌中實現(xiàn)可溶性表達，且表達蛋白的分子量與理論值 (78 kDa) 一致。鎳離子親和層析和分子篩層析純化后測得其比活性為5.82 U/mg。酶學性質分析顯示，重組CPRΔ24的最適溫度和pH分別為35 ℃和8.0，并對一些金屬離子及有機溶劑具有不同程度的耐受性。酶在35 ℃、pH 8.0反應條件下對NADPH的動力學參數(shù)m和cat分別為19.7 μmol/L、3.31/s；對底物細胞色素c的動力學參數(shù)m和cat分別為25.9 μmol/L、10.2/s。以上研究為探究云芝CPR在環(huán)境有機污染物降解途徑中的功能機制奠定基礎。

云芝，NADPH-細胞色素P450還原酶，大腸桿菌，異源表達，酶學特性

白腐真菌能夠降解許多難降解有機污染物，除了其胞外木質素降解酶系，其胞內的細胞色素P450酶系 (Cytochrome P450s，CYPs) 的降解功能也越來越引起人們的關注。白腐真菌可以依賴CYP酶系脫毒和降解環(huán)境中的各種外源化合物[1-2]，如多環(huán)芳烴、酚類、固醇類和烷烴等化合物。云芝是白腐真菌的一種，能降解多種農藥[3]、廢水中的藥物殘留[4-5]以及其他環(huán)境污染物[6-7]，其CYP系統(tǒng)同樣參與這些污染物的降解[4,6-7]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-細胞色素P450還原酶 (NADPH-cytochrome P450 reductase，CPR) 是一類以FMN (黃素單核苷酸) 和FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸) 為輔基的氧化還原酶，是CYP系統(tǒng)中的重要組成部分。CPR從電子供體NADPH獲得電子之后傳遞給CYPs，而后CYPs才能與底物發(fā)生氧化還原反應，發(fā)揮代謝活性。CPR是CYP的主要電子供體，與CYP的電子傳遞反應是CYP氧化還原反應的限速步驟[1]。真核細胞的CPR通常錨定在內質網上而其催化活性中心位于胞質一側。CPR從N端到C端包括N端膜錨定區(qū)、FMN結合域、中間連接域、FAD和NADPH結合域。連接域調節(jié)兩個黃素輔因子正確的空間構象，使其有效傳遞電子[8-9]。CPR作為雙黃素還原酶，對底物提供電子，使其參與氧化還原反應，其底物包括細胞色素c、微粒體CYPs、細胞色素b5氧化還原酶、血紅素氧化酶等[10]。

基因組序列分析表明，模式菌黃孢原毛平革菌有149個和1個[2,11]。釀酒酵母只有3個和1個[12]。云芝中目前也只鑒定出一個[13]，而有多個[14]。一些受到外來化合物的刺激會上調表達[14]，表明云芝化學壓力響應系統(tǒng)參與異生物的代謝。另一方面，的mRNA水平在有無化學壓力的細胞中幾乎不變，表明組成型表達，該CPR對CYP的專一性要求可能不高，可以對一系列的CYPs起到提供電子的作用，也可能支持來源于近源物種的CYP電子傳遞途徑。

一個CPR如何驅動那么多CYPs和其他類型的底物參與氧化還原反應是一個重要的研究領域。已有的研究發(fā)現(xiàn)，CPR和CYPs主要通過靜電力相互作用[15-16]。電子從FMN轉移到CYP的血紅素的過程中，CPR經歷大的構象變化，使FMN輔因子暴露在溶劑中[9,17]。有研究推測一些膜上的CYPs在一個CPR分子周圍集結成簇，CPR在不同CYPs分子間穿梭，與CYPs接觸反應很 快[18-19]。磷脂雙分子層也會影響CPR和CYPs的相互作用，它可能通過和CPR正電荷區(qū)域的弱相互作用而調節(jié)CPR的還原電勢[20]。目前，對CPR和不同CYPs之間相互作用機制的研究還在發(fā)展階段[21]。

為了體外研究CPR和各種底物之間的相互作用，以及構建CYP生物反應酶系，需對CPR進行單獨表達和純化。目前已有一些關于CPR在大腸桿菌中異源表達和功能鑒定的報道[22-24]。為利于CPR在大腸桿菌細胞內高效可溶性表達，通常的策略是對其N端膜結合的疏水區(qū)域進行序列改造或者截除[22-24]。真核生物的CYP也是膜結合蛋白，通常也利用N端疏水區(qū)域替換或去除的策略實現(xiàn)其在大腸桿菌中的可溶且活性形式的表達[25-27]。

本研究通過將云芝的全長和去除預測的N端膜錨定區(qū)域 (第1–24個氨基酸殘基) 的分別在大腸桿菌中異源表達，最終獲得可溶性表達的CPRΔ24蛋白，對該蛋白進行純化，并對其酶學特性進行分析，為體外構建CYP生物反應酶系，研究云芝CPR和不同底物之間的相互作用，以及進一步探究云芝CPR在環(huán)境有機污染物降解途徑中的功能機制提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保藏。質粒pET-28_TEV為本實驗室在pET-28a(+)基礎上改造，即將凝血酶 (Thrombin) 酶切位點替換成煙草蝕紋病毒蛋白酶 (Tobacco etch virus protease，TEV) 酶切位點后保藏 (圖1)。

1.1.2 試劑及儀器

DNA marker 2K Plus Ⅱ、DNA聚合酶、DNA連接酶、限制內切酶均為TaKaRa產品。柱純化試劑盒Ni-NTA、蛋白濃度測試試劑盒Bradford為生工生物工程 (上海) 股份有限公司產品。質粒提取試劑盒以及膠回收試劑盒購自康寧生命科學 (吳江) 有限公司；其他試劑為國產和進口分析純試劑。所用儀器：Eppendorf PCR儀 (Thermo Fisher Scientific-US)、DYY-6C電泳儀 (上海天能科技公司)、水平式電泳槽以及垂直電泳槽 (上海天能科技公司)、超聲波細胞粉碎機SCIENTZ-IID (寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.3 引物

云芝全長(GenBank Accession No. AB065368.1，2 190 bp，編碼全長CPR蛋白730個氨基酸) 由生工生物工程 (上海) 股份有限公司進行全基因合成，并將酶切位點Ⅰ、Ⅰ引入，與pET-22b(+)載體連接，導入感受態(tài)細胞BL21 (DE3)。設計去除N端膜錨定區(qū)域的的上下游引物分別命名為N1、N2，將酶切位點Ⅰ、Ⅰ分別引入，引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成 (表1)。

1.2 方法

1.2.1 獲取目的片段

片段由全長序列經PCR擴增獲得。PCR體系為：模板即公司合成的包含全長質粒 (94 ng/μL) 1 μL；上下游引物 (10 μmol/L) 各1 μL；Premix DNA聚合酶 (2×) 25 μL；加水補齊至50 μL。PCR反應條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min 30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應完成后以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并對目的產物進行柱純化回收。

圖1 pET-28_TEV質?？寺?表達區(qū)域圖

表1 引物序列

The underlined letters indicate recognition site of specific restriction enzyme.

1.2.2 云芝CPR氨基酸序列分析

云芝CPR N端24個氨基酸殘基組成的疏水膜錨定區(qū)域通過TMHMM Server v. 2.0 (http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預測得到。應用Clustal X2軟件對已獲得的云芝CPR氨基酸序列與GenBank已登錄的黃孢原毛平革菌、肉質顯絲菌、綿腐臥孔菌、干朽菌、新型隱球菌、黑曲霉、粗糙脈孢霉、釀酒酵母和裂殖酵母的CPR氨基酸序列進行多序列對比分析。

1.2.3 構建重組表達質粒pET28-和pET28-

將含有空載質粒pET-28_TEV和公司提供的含有質粒pET22b(+)-的分別搖瓶過夜培養(yǎng)并提取質粒。將所得pET-28_TEV空載質粒、pET22b(+)-質粒和PCR擴增獲得的分別進行Ⅰ、Ⅰ雙酶切，酶切條件為37 ℃反應4 h。膠回收相應的基因片段和pET-28_TEV載體。載體與片段按摩爾比約1:17連接獲得重組表達質粒pET28-和pET28-；連接體系為：載體pET-28_TEV (約30 ng/μL) 1 μL，或酶切回收片段 (約50 ng/μL) 4 μL，T4 DNA連接酶 1 μL，T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，加入超純水補齊至10 μL，16 ℃連接過夜。

1.2.4 重組質粒pET28-和pET28-的轉化和鑒定

將上述獲得的重組表達載體pET28-和pET28-轉化至新鮮制備的表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞中，并涂布于含有終濃度為30 μg/mL卡那霉素的抗性平板，37 ℃恒溫隔夜培養(yǎng)，用已滅菌牙簽挑取抗性單克隆菌落，15%甘油保菌并將菌株送樣至生工生物 (上海) 股份有限公司測序鑒定。

1.2.5 重組蛋白的誘導表達

取經驗證無誤并冷凍保藏pET28-和pET28-大腸桿菌轉化子各50 μL，分別接入含有30 μg/mL卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床過夜培養(yǎng)后轉接到含有30 μg/mL卡那霉素的400 mL LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至菌體600達到0.6–0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導劑IPTG，轉入16 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)，并誘導目的蛋白表達16?24 h。4 ℃、8 000 r/min離心收集菌體，各用80 mL結合緩沖液 (20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0) 重懸菌體并超聲破碎，超聲功率250 W，開2 s，關3 s，破碎30 min。將菌體破碎液12 000 r/min離心30 min后對上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白純化

取出保存在4 ℃冰箱的鎳柱，用酒精重懸填料并在填料完全下沉后將柱內酒精全部放出。先用3個柱體積去離子水沖洗柱子，然后加入約5 mL的電荷緩沖液 (0.2 mol/L NiSO4)，使Ni2+結合至柱材料上，然后用適量的去離子水洗去多余的Ni2+，最后用至少3個柱體積的結合緩沖液平衡鎳柱。待鎳柱平衡好后，緩慢上樣破碎上清液。上樣結束后用2個柱體積的結合緩沖液洗去非特異性結合在柱子上的雜蛋白，接著用20 mmol/L和50 mmol/L的咪唑洗脫吸附在柱子上的雜蛋白，至洗脫液無蛋白 (280<0.05) 后，再用 200 mmol/L咪唑洗下目的蛋白并收集洗脫液，至目的蛋白完全被洗脫下來 (最后一滴洗脫液280<0.05)。用分子篩預裝柱Hiload 16/60 Superdex200 column (GE healthcare) 繼續(xù)純化目的蛋白，分子篩所用緩沖液為：20 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，pH 8.0。

1.2.7 重組酶酶學特性分析

最適作用pH：分別在不同pH緩沖液 (pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0) 下測定酶活性。pH 5.0–8.0 (1/15 mol/L KH2PO4-Na2HPO4)、pH 7.5–9.0 (50 mmol/L Tris-HCl)、pH 9.0–10.0 (100 mmol/L NaHCO3-Na2CO3)。其他條件按方法1.2.8，計算相對酶活。將pH梯度中對應的最高酶活定義為100%。

最適作用溫度：分別在不同的溫度 (25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃) 下測定酶活性。其他條件按照方法1.2.8，計算相對酶活。將溫度梯度中對應的最高酶活定義為100%。

添加劑 (金屬離子、添加物) 對酶活的影響：在標準反應體系中分別加入金屬離子Na+、K+、Ca2+、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+和EDTA終濃度為5 mmol/L，甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮的終濃度為10% (體積比)。對照組無任何添加劑并將其酶活定義為100%，其他條件按方法1.2.8，計算相對酶活。

1.2.8 重組酶比酶活測定

酶活以氧化型細胞色素c作為重組酶的底物。根據(jù)最適pH和最適溫度以及動力學參數(shù)確定飽和底物濃度 (見方法1.2.9)，定義標準酶反應體系為：1 mL酶活反應體系中加入4 μg的重組酶，氧化型細胞色素c終濃度為100 μmol/L，NADPH終濃度為120 μmol/L，測定在35 ℃、pH 8.0的反應條件下在5 min初始反應階段產物還原型細胞色素c在550 nm處的吸收值。550的增長速率換算成細胞色素c由氧化型向還原型的轉變速率。還原型細胞色素c的消光系數(shù)為 21.1 mmol/(L·cm)。

1.2.9 重組酶動力學參數(shù)的表征

測定重組酶對細胞色素c和NADPH的動力學表征參照Warrilow等的方法[23]。在酶反應體系中加入不同濃度 (終濃度為0–200 μmol/L) 的氧化型細胞色素c和4 μg的重組酶，添加終濃度為120 μmol/L的NADPH啟動反應，測定并記錄開始與在35 ℃、pH 8.0反應條件下反應5 min后的550。在酶反應體系中加入終濃度為100 μmol/L的氧化型細胞色素c和4 μg的重組酶，添加不同濃度 (終濃度為0–200 μmol/L) 的NADPH啟動反應，測定并記錄開始與在35 ℃、pH 8.0反應條件下反應5 min后的550。550的增長速率換算成細胞色素c由氧化型向還原型的轉變速率。以上數(shù)據(jù)均重復測定3次。利用Origin Pro 9.0和公式 (1) 對測定的數(shù)據(jù)進行擬合，由公式 (1)、(2) 計算CPRΔ24對細胞色素c和NADPH的max、m和cat值。

2 結果與分析

2.1 目的基因獲得和重組表達質粒構建

云芝全長(GenBank Accession No. AB065368.1) 由公司合成并連接到pET-22b載體上，導入感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3) 細胞。去除由N端24個氨基酸殘基組成的膜錨定區(qū)域的序列的獲得是以全長基因為模板，經PCR擴增實現(xiàn)。

將云芝去除膜錨定區(qū)域的擴增片段插入到表達載體。經菌落PCR及對重組質粒酶切驗證 (圖2)，顯示成功構建重組質粒pET28-，同時證明重組質粒pET28-成功導入表達宿主大腸桿菌細胞中。

2.2 云芝CPR氨基酸序列分析

云芝CPR的氨基酸序列和其他物種多序列比對結果如圖3所示。云芝與白腐菌黃孢原毛平革菌、肉質顯絲菌及褐腐菌綿腐臥孔菌、干朽菌的氨基酸序列同源性較高，分別為83%、81%和81%、78%。與非木腐菌新型隱球菌黑曲霉和粗糙脈孢菌的同源性分別為57%、45%、42%。與釀酒酵母和裂殖酵母的CPR氨基酸序列同源性較低，分別為37%和39%。

圖2 重組質粒pET28-CPRΔ24的構建和雙酶切鑒定

圖3 云芝CPR和其他物種CPR的氨基酸序列比對

2.3 重組蛋白的誘導表達及分離純化

SDS-PAGE檢測分析結果顯示，未見有重組CPR蛋白在大腸桿菌BL21 (DE3) 中可溶性表達 (圖4A)，而重組CPRΔ24獲得了明顯的可溶性表達，且表達蛋白的分子量與理論值 (78.35 kDa) 吻合 (圖4B)。利用重組CPRΔ24的N端His標簽，通過鎳柱法分離純化目的蛋白，并利用分子篩層析法進一步分離純化目的蛋白。重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果見圖5和圖6。

2.4 活性測定及酶學特性分析

2.4.1 比酶活

在35 ℃、pH 8.0的反應條件下測定5 min內550的變化，擬合重組CPRΔ24反應初速度階段，定義酶活單位 (U) 為在35 ℃、pH 8.0的反應條件下每分鐘產生1 μmol還原型的細胞色素c所需要的酶量。計算得出重組酶比酶活為5.82 U/mg。

2.4.2 最適pH和最適溫度

測定云芝重組CPRΔ24的最適溫度為35 ℃。由圖7分析得出溫度在25?35 ℃間酶活逐漸升高，當溫度大于40 ℃酶活明顯降低，表明該酶不適合在溫度較高條件下使用。酶的最適pH為8.0，當pH低于6.5或高于9.0后酶活性均低于60%。

2.4.3 金屬離子和有機溶劑等對酶活性的影響

經測定 (圖8)，沒有發(fā)現(xiàn)對重組CPRΔ24具有明顯促進作用的金屬離子，其中5 mmol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+對酶活影響較小，Co2+和Ni2+使酶活明顯降低，Zn2+、Cu2+、Fe2+使酶失活，EDTA使酶活保持在80%以上。同時，加入不同的有機溶劑對酶活都有不同程度的抑制作用。10%的乙醇、異丙醇和丙酮使酶活降低50%多，10%甲醇存在時酶活保持在60%以上。

圖5 重組CPRΔ24鎳柱純化的SDS-PAGE分析

圖6 重組CPRΔ24分子篩純化結果圖

圖7 溫度(A) 和pH (B) 對重組CPRΔ24酶活的影響

圖8 添加劑對重組CPRΔ24酶活的影響

2.4.4 對底物細胞色素c和NADPH的動力學表征

酶動力學分析表明，重組CPRΔ24對底物細胞色素c的m為 (25.9±2.09) μmol/L，cat為10.2/s。對NADPH的m為 (19.7±1.33) μmol/L，cat為3.31/s (圖9)。

3 討論

白腐真菌能利用細胞色素P450酶系代謝一系列內源和外源的化合物。黃孢原毛平革菌[11]、肉質顯絲菌[28]靈芝[29]和毛栓孔菌[30-31]等真菌已完成基因組測序，已有多個得到鑒定，而關于白腐真菌CPR異源表達和酶學特性的研究還較少。實驗成功構建云芝CPRΔ24 (去除N端膜錨定區(qū)域) 的表達載體pET-，并實現(xiàn)其在大腸桿菌中的異源表達，利用鎳柱親和純化和分子篩層析后測得重組CPRΔ24的比酶活為5.82 U/mg，酶的最適溫度與最適pH分別為35 ℃和8.0；金屬離子Zn2+、Cu2+、Fe2+使酶失活，Co2+和Ni2+使酶活明顯降低，Na+、K+、Ca2+、Mg2+對酶活影響較小，EDTA使酶活保持在80%以上。同時，加入不同的有機溶劑對酶活都有不同程度的抑制作用。乙醇、異丙醇和丙酮使酶活降低50%以上，而甲醇存在時相對酶活保持在60%以上。重組CPRΔ24對細胞色素c的動力學參數(shù)m和cat分別為25.9 μmol/L和10.2 /s；對NADPH的動力學參數(shù)m和cat分別為19.7 μmol/L和3.31/s。

黃孢原毛平革菌重組CPRΔ23 (去除N端膜錨定區(qū)域) 在25 ℃、pH 7.8的反應條件下對細胞色素c的動力學參數(shù)m為 (11.54±0.29) μmol/L，比酶活為14.76 U/mg[23]；而云芝重組CPRΔ24在35 ℃、pH 8.0的反應條件下對細胞色素c的動力學參數(shù)m為 (25.9±2.09) μmol/L，比酶活為5.82 U/mg。二者在動力學參數(shù)和比酶活數(shù)值上的差異可能與測試溫度和pH條件，以及二者因氨基酸序列上的不同導致的酶學特性的差異相關。

云芝的CPR在大腸桿菌中重組表達、純化和酶學特性的研究為體外構建CYP酶反應系統(tǒng)，以及體外研究云芝CPR和不同CYPs及其他類型底物之間的相互作用奠定基礎。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)一些不依賴于CPR的CYP電子傳遞體，如細胞色素b5和NADH依賴的細胞色素b5還原酶[32-34]。本研究也為分析云芝中其他類型的CYP電子傳遞體和CPR之間的差異和聯(lián)系提供指導。

基于CPR和CYPs之間的作用關系及其電子供體的特性，CPR已被運用到生物轉化及藥物代謝等多個研究領域。例如，在酵母細胞中共表達酵母的CPR和擔子菌的CYPs從而構建有毒異生物轉化的功能篩選系統(tǒng)[35-36]；在酵母細胞中構建人源CPR和CYP共表達的體系用作體外藥物代謝的篩選[37]等。雖然將某個CPR和一系列的編碼蛋白共表達以構建功能篩選體系是對CYPs催化潛力更為系統(tǒng)的評價，但是在研究某個CYP的具體功能和電子傳遞路徑時往往需要將該CYP和特定的CPR分別表達、純化以進行體外酶活檢測[27,38]。本實驗室前期異源表達和純化了來源于毛栓菌AH28-2的一個編碼蛋白。鑒于云芝的CPR專一性不高，我們正在將該編碼蛋白和本研究中的CPR適配，進行體外酚化合物脫毒反應體系的構建。這也為進一步探究云芝CPR在環(huán)境有機污染物降解途徑中的功能機制提供幫助。

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(本文責編 陳宏宇)

Expression and characterization of NADPH-cytochrome P450 reductase fromin

Xuewa Sun1,2,3, Chao He1,2,3, Zeming Fang1,2,3, and Yazhong Xiao1,2,3

1 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China 2 Anhui Key Laboratory of Modern Biomanufacturing, Hefei 230601, Anhui, China 3Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230601, Anhui, China

has strong ability to degrade environmental organic pollutants. NADPH-cytochrome P450 reductase (CPR) oftransfers electron to cytochrome P450s (CYPs) and participates in the degradation process of organic pollutants. Sequence analysis showed that the genome ofcontains 1 potentialand multiple potentialsequences. To further study the molecular mechanism for the involvement ofCPR in the cellular degradation of organic pollutants, agene fromwas cloned and heterologously expressed in. Subsequently, the main properties of the recombinant enzyme were investigated. A truncated CPR protein lacking the predicted membrane anchor region (residues 1-24), named CPRΔ24, was overexpressed as a soluble form in. The recombinant CPRΔ24 protein showed a molecular weight consistent with the theoretical value of 78 kDa. Recombinant CPRΔ24 was purified using a Ni2+-chelating column followed by size exclusion chromatography. The specific activity of the purified CPRΔ24 was 5.82 U/mg. The CPRΔ24 enzyme displayed the maximum activity at 35 ℃ and pH 8.0. It has different degrees of tolerance against several types of metal ions and organic solvents.The apparentmandcatvalues of recombinant CPRΔ24 for NADPH were 19.7 μmol/L and 3.31/s, respectively, and those for the substrate cytochrome c were 25.9 μmol/L and 10.2/s, respectively, under conditions of 35 ℃ and pH 8.0. The above research provides the basis for exploring the functional mechanism ofCPR in the degradation pathway of environmental organic pollutants.

, NADPH-cytochrome P450 reductase,, heterologous expression, enzymatic properties

December 25, 2017;

February 8, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos.31370114, 31170056).

Yazhong Xiao. E-mail: yzxiao@ahu.edu.cnChao He. E-mail: chaohe@ahu.edu.cn

國家自然科學基金(Nos. 31370114, 31170056) 資助。

2018-06-08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180607.1128.002.html

10.13345/j.cjb.170517