黑曲霉組成型表面展示南極假絲酵母脂肪酶B及其發(fā)酵調(diào)控

李遠(yuǎn)鋒，靳珅，王登剛，梁書利，鄭穗平，林影

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黑曲霉組成型表面展示南極假絲酵母脂肪酶B及其發(fā)酵調(diào)控

李遠(yuǎn)鋒，靳珅，王登剛，梁書利，鄭穗平，林影

華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 廣東省發(fā)酵與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006

金城. 2018酶工程?？蜓? 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(7): 1021?1023.Jin C. Preface for special issue on enzyme engineering (2018). Chin J Biotech, 2018, 34(7): 1021?1023.

黑曲霉表面展示南極假絲酵母脂肪酶B (CALB) 可有效應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。以黑曲霉SH-1為宿主細(xì)胞構(gòu)建誘導(dǎo)型糖化酶基因啟動(dòng)子表面展示CALB，在較高濃度葡萄糖碳源的發(fā)酵中CALB表達(dá)會(huì)受到抑制，發(fā)酵后期菌體容易出現(xiàn)菌絲斷裂和展示酶活力下降等問題。采用組成型3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子替代誘導(dǎo)型糖化酶基因啟動(dòng)子的細(xì)胞表面展示CALB黑曲霉菌株可有效解決上述問題，該菌株不但可以利用葡萄糖，而且還能利用木糖為發(fā)酵碳源，以木糖為碳源發(fā)酵在144 h展示酶水平達(dá)到1 100.28 U/g。文中探討了甘蔗渣水解液發(fā)酵生產(chǎn)黑曲霉表面展示CALB，初步達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，為甘蔗渣的綜合利用提供了新途徑。

黑曲霉，脂肪酶，細(xì)胞表面展示，組成型啟動(dòng)子

脂肪酶不但催化脂肪水解，而且在非水相中能高效催化轉(zhuǎn)酯和酯化等反應(yīng)，具有反應(yīng)條件溫和等特性[1-2]，由此脂肪酶被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。南極假絲酵母脂肪酶B (lipase B, CALB) 因具有與其他脂肪酶不同的性質(zhì)和特殊的結(jié)構(gòu)，如對水溶性以及非水溶性底物都有很強(qiáng)的催化活性，可用于催化合成反應(yīng)、油脂轉(zhuǎn)化等[3-4]，同時(shí)還具有很顯著的手性選擇性和區(qū)域選擇性，可以在有機(jī)相中催化不對稱的水解、胺解、酯化和酯交換等反應(yīng)[5-6]，使其成為研究熱點(diǎn)。

絲狀真菌具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力和較完備的蛋白質(zhì)裝配加工運(yùn)輸途徑，并具有蛋白質(zhì)胞外分泌量大、表達(dá)蛋白有天然活性的優(yōu)點(diǎn)[7-8]。其中黑曲霉作為一種通用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，特別適合于食品和藥品的生產(chǎn)，并被美國食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 定義為通常認(rèn)為安全 (Generally regarded as safe, GRAS) 的微生物[9]。食品加工行業(yè)已經(jīng)認(rèn)可通過黑曲霉生產(chǎn)的酶制劑[10]。細(xì)胞表面展示技術(shù)通過外源蛋白與錨定蛋白融合表達(dá)在細(xì)胞表面上，簡化了蛋白純化和固定化步驟，具有較大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值[11]。目前僅有少數(shù)關(guān)于絲狀真菌表面展示系統(tǒng)的報(bào)道，如米曲霉細(xì)胞表面展示系統(tǒng)[12-13]和筆者實(shí)驗(yàn)室從頭構(gòu)建的黑曲霉細(xì)胞表面展示系統(tǒng)[14]，在黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子 (pGlaA) 操控下，將帶有FLAG標(biāo)簽的CALB與內(nèi)源的壁蛋白CwpA[15]融合，實(shí)現(xiàn)了CALB在黑曲霉菌絲表面的活性展示。盡管pGlaA已被應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)中，但其作為一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在淀粉或其衍生物的培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在木糖培養(yǎng)基中不能誘導(dǎo)產(chǎn)酶[16]。在利用葡萄糖及其類似物等碳源時(shí)，僅在較低濃度時(shí)有強(qiáng)誘導(dǎo)作用，而在高濃度誘導(dǎo)的作用受到抑制[17-18]，使得工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)控制困難。

甘油醛3-磷酸脫氫酶是糖酵解第6步的酶，該基因啟動(dòng)子 (pGpdA) 為組成型啟動(dòng)子，無需添加任何誘導(dǎo)物，可自發(fā)調(diào)控結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行表達(dá)[19]。已有許多成功利用該啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白的報(bào)道，例如在醬油曲霉中使用pGpdA克隆表達(dá)來自煙曲霉菌的α-半乳糖苷酶[20]；在黑曲霉中表達(dá)大腸桿菌來源的β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶[21]以及葡萄糖氧化酶[22]等。

本研究基于實(shí)驗(yàn)室已有的黑曲霉表面展示CALB (AN-GlaA) 菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造[14]，將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pGlaA替換為組成型啟動(dòng)子pGpdA (AN-GpdA)，通過對所構(gòu)建菌株的發(fā)酵控制研究，擬解決發(fā)酵過程中高濃度葡萄糖、木糖等抑制產(chǎn)酶、發(fā)酵后期菌絲裂解造成展示酶活力嚴(yán)重下降等問題，初步探討了甘蔗渣水解液為碳源發(fā)酵產(chǎn)品的條件，為甘蔗渣的綜合利用提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)中所用的菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 酶與試劑

KOD FX 聚合酶購自東洋紡 (上海) 生物技術(shù)有限公司。CloneEZ重組克隆試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司。各種限制性內(nèi)切酶 (如Ⅰ、Ⅰ) 購自NEB公司。鼠抗FLAG單抗Mouse anti-FLAG購自美國Agilent公司。Alexa Fluor488標(biāo)記羊抗鼠IgG購自美國Invitrogen公司。酵母提取物和胰蛋白胨購自O(shè)xoid公司。對硝基苯酚丁酸酯 (NPB) 和聚乙烯醇 (PVA-124) 購自Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白 (BSA) 購自北京普博欣生物公司。其余分析純試劑均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

表1 本實(shí)驗(yàn)用菌株及質(zhì)粒

對硝基苯酚丁酸酯 (NPB) 底物配制：25 mmol/LNPB與1%曲拉通-100溶解于50 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)，使用均質(zhì)機(jī)乳化至均勻，于–20 ℃保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani (LB)：1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% NaCl。乙酰胺CD種子培養(yǎng)基：2%蔗糖，0.2% KCl，0.05% MgSO4，0.1% K2HPO4，0.001% FeSO4·7H2O，0.05% 瓊脂，85% H3PO4調(diào)節(jié)pH至5.5，使用前加入經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后的乙酰胺至10 mmol/L。乙酰胺蔗糖CD高滲固體培養(yǎng)基：乙酰胺CD種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，更換瓊脂為2%，并加入1.5 mmol/L CsCl。

三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基：0.2% PVA-124，0.5%三丁酸甘油酯，0.3% NaNO3，0.1% K2HPO4，0.05% KCl，0.05% MgSO4，1%葡萄糖，2%瓊脂，0.25%曲拉通，調(diào)節(jié)pH至5.5。APY：1%酵母提取物，0.75%蛋白胨，1.5% (NH4)2SO4，0.84% KH2PO4，0.18% Na2HPO4·12H2O。GAPY：在APY添加葡萄糖至終濃度為6%。XAPY：在APY添加木糖母液至終濃度為6%。AN-GlaA發(fā)酵在APY誘導(dǎo)產(chǎn)酶，每12 h添加葡萄糖至終濃度為0.25%。

甘蔗渣水解液發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取適量甘蔗渣用4.5%氫氧化鈉 (S/L=1∶25) 在80 ℃預(yù)處理4 h，水洗至中性，再加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 (pH 4.8, S/L=1∶20) 和纖維素酶 (20 FPU/g底物)，48 ℃酶解反應(yīng)80 h。過濾后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到終濃度為6% 甘蔗渣水解液，再添加APY中的各成分。

1.2 黑曲霉細(xì)胞表面展示載體的構(gòu)建

從SH-1細(xì)胞中提取全基因組，設(shè)計(jì)引物gpdA1261F/SsglaAF (表2)。PCR擴(kuò)增出pGpdA的編碼基因。以pCALB-C質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物gpdARnew/SSglaAR (表2)。PCR擴(kuò)增出信號肽SSglaA的編碼基因。PCR反應(yīng)體系與PCR擴(kuò)增pGpdA的編碼基因相同。上述兩種產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，共同作為模板，以gpdA1261F/SSglaAR為引物，進(jìn)行融合PCR，得到pGpdA-SSgla的編碼基因。PCR反應(yīng)體系與PCR擴(kuò)增pGpdA的編碼基因相同。利用限制性內(nèi)切酶 (Ⅰ、Ⅰ) 處理pCALB-C，切除pGlaA-SSGla片段，得到產(chǎn)物回收純化后與上述融合PCR的產(chǎn)物用CloneEZ重組克隆試劑盒連接。隨后轉(zhuǎn)化TOP 10，得到構(gòu)建的質(zhì)粒pCALB-D (圖1)。

表2 用于基因擴(kuò)增的引物

圖1 pCALB-D質(zhì)粒圖譜

1.3 重組黑曲霉菌展示CALB菌構(gòu)建和產(chǎn)酶驗(yàn)證

提取pCALB-D質(zhì)粒，進(jìn)行SH-1原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，涂布于乙酰胺蔗糖CD高滲平板獲得菌落，再轉(zhuǎn)移至三丁酸甘油酯平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑取水解圈明顯的轉(zhuǎn)化子接至乙酰胺蔗糖CD液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，將乙酰胺CD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液離心，棄去上清，菌體用生理鹽水洗滌2次，然后接種到50 mL GAPY中，用500 mL搖瓶發(fā)酵，裝液量10%，30 ℃，250 r/min。從第48 h開始取樣，每24 h取樣1次，檢測相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)酶指標(biāo)。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定

發(fā)酵液經(jīng)過適當(dāng)稀釋后，于595 nm波長下測定吸光度，該數(shù)值反應(yīng)菌體生物量。在一定的范圍內(nèi)，隨著生物量的積累，595線性增加。

1.4.2 酶活力測定

采用吸光光度法測定展示脂肪酶活力[14]。發(fā)酵菌液用Tris-HCl 緩沖液 (pH 8.0) 洗滌2次，再用等體積Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0) 重懸，用于檢測菌絲展示脂肪酶活性。菌液稀釋至合適的倍數(shù)后，以對硝基苯酚丁酸酯 (NPB) 作為底物，在pH 8.0、45 ℃條件下反應(yīng)5 min，酶標(biāo)儀測定吸光度 (405)?？瞻资褂肨ris-HCl緩沖液 (pH 8.0) 替代樣品，在相同條件下反應(yīng)檢測。展示脂肪酶活力測定體系：900 μL Tris-HCl緩沖液 (pH 8.0)，50 μL稀釋合適倍數(shù)的菌液，50 μLNPB底物，反應(yīng)體系共計(jì) 1 mL，反應(yīng)后取 200 μL檢測吸光度 (405)。展示脂肪酶活力單位 (1 U) 定義為：在pH 8.0、45 ℃條件下，每1 min水解NPB生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

計(jì)算公式：酶活力 (U/g)=(405?blank) ×M× K×1 000/(W×595×T)。

其中405：待測樣品在405 nm波長的吸光值；blank：空白對照品在405 nm波長的吸光值；M：樣品的稀釋倍數(shù)；K：水解生成對硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)，數(shù)值上等于標(biāo)準(zhǔn)曲線方程=1時(shí)的值 (μmol/L)，實(shí)驗(yàn)室測得該系數(shù)的值為0.12；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；W：1 L發(fā)酵液1595對應(yīng)的菌體干重 (g/L)，本實(shí)驗(yàn)所用的系數(shù)值為0.33；595：待測樣品的生物量。

1.4.3 表面展示脂肪酶黑曲霉細(xì)胞免疫熒光分析

構(gòu)建的質(zhì)粒pCALB-D帶有FLAG標(biāo)簽，所以可以通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測經(jīng)熒光染色的表面展示脂肪酶黑曲霉細(xì)胞[23]。菌體用冰冷的磷酸鹽緩沖液洗 (pH 7.4) 2次后，用含1% BSA的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 重懸菌體，加入適量鼠抗FLAG單抗Mouse anti-FLAG，輕敲混勻，孵育2 h。再用含1% BSA的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 洗滌并重懸菌體，加入適量Alexa Fluor488標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，輕敲混勻，避光孵育1 h。然后用含1% BSA的磷酸鹽緩沖液 (pH 7.4) 洗滌并重懸菌體，用Carl Zeiss LSM710 激光共聚焦顯微鏡對黑曲霉菌體進(jìn)行熒光顯微鏡檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面展示脂肪酶黑曲霉細(xì)胞免疫熒光分析

表面展示CALB黑曲霉菌株AN-GpdA利用葡萄糖為碳源培養(yǎng)后洗滌菌體，用免疫熒光染色處理，宿主菌SH-1作為對照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察 (圖2)。在488 nm光源的激發(fā)下，重組菌細(xì)胞表面呈現(xiàn)明顯的特異性綠色熒光。因?yàn)镕LAG標(biāo)簽被設(shè)計(jì)在CALB和細(xì)胞壁錨定蛋白之間，這一結(jié)果可以從蛋白質(zhì)水平表明外源蛋白CALB已經(jīng)成功地展示在細(xì)胞表面。

圖2 A. niger菌絲激光掃描共聚焦顯微鏡免疫熒光分析

圖3 AN-GlaA和AN-GpdA利用葡萄糖為碳源發(fā)酵展示CALB酶活力

2.2 利用葡萄糖為碳源黑曲霉生長形態(tài)及展示脂肪酶產(chǎn)酶分析

分別研究了黑曲霉AN-GlaA菌株 (誘導(dǎo)型表達(dá)) 和AN-GpdA菌株 (組成型表達(dá)) 在APY發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)168 h的展示酶產(chǎn)酶情況，其發(fā)酵展示酶活力曲線如圖3所示。在96 h前隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，兩株菌展示的CALB活力均在升高，其中在96 h AN-GpdA的展示CALB酶活力達(dá)466.40 U/g，比同時(shí)期的AN-GlaA展示CALB酶活力 (322.35 U/g) 提高了約45%，且AN-GpdA繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵到 168 h展示CALB酶活力較為穩(wěn)定，而AN-GlaA展示酶活力在168 h下降22%。說明AN-GpdA展示CALB產(chǎn)酶效果較AN-GlaA更具優(yōu)勢，在發(fā)酵后期 (96–168 h) AN-GlaA展示的酶活力明顯下降，推測其與碳源限制和菌絲形態(tài)相關(guān)。本研究使用的宿主菌SH-1為無孢黑曲霉，在液體發(fā)酵中呈現(xiàn)出菌絲較短、多分支的現(xiàn)象。在葡萄糖限制 (0.3–0.6 mmol/L) 發(fā)酵后期 (168 h) AN-GlaA菌株出現(xiàn)了菌絲斷裂并裂解 (圖4A和4B) 致使展示酶活力下降。AN-GpdA菌株在發(fā)酵過程中含有充足的葡萄糖，緩解AN-GlaA在發(fā)酵過程中碳源匱乏的問題，維持菌絲較為良好的形態(tài) (圖4C和4D) 大部分菌絲體健壯，輪廓清晰。

2.3 利用木糖為碳源黑曲霉生長形態(tài)及展示脂肪酶產(chǎn)酶分析

AN-GlaA菌株可利用木糖生長，但不能誘導(dǎo)生產(chǎn)展示CALB酶，只有當(dāng)洗去木糖后，轉(zhuǎn)入APY培養(yǎng)基并添加適量葡萄糖才恢復(fù)誘導(dǎo)產(chǎn)酶 (數(shù)據(jù)未顯示)；而AN-GpdA菌株不僅可以利用葡萄糖產(chǎn)酶，也可以在木糖為唯一碳源時(shí)進(jìn)行產(chǎn)酶。AN-GpdA菌株利用木糖為碳源發(fā)酵展示CALB酶活力生產(chǎn)曲線如圖5所示，發(fā)酵到144 h時(shí)展示CALB活力最高，達(dá)到1 100.28 U/g，其展示酶活力明顯高于其利用葡萄糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)酶。推測可能原因是無孢黑曲霉在利用木糖和葡萄糖代謝存在差異，利用前者為碳源時(shí)，糖轉(zhuǎn)化率、胞內(nèi)還原力 (NADH/NAD+) 和ATP含量均比后者高，且有機(jī)酸積累量少，有利于產(chǎn)物積累[24]；同時(shí)木糖作為唯一碳源對細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，從而改變菌絲的形態(tài)、長度、區(qū)室多少和結(jié)團(tuán)等，如圖6所示，相比于利用葡萄糖為碳源的細(xì)胞培養(yǎng) (圖6A、6B)，利用木糖為碳源 (圖6C、6D) 培養(yǎng)發(fā)酵，形成的菌絲體更纖細(xì)、更長，區(qū)室也更多，且部分區(qū)室膨大、更粗壯，這對展示CALB活力影響至關(guān)重要。對于黑曲霉來說，其生長形態(tài)與蛋白產(chǎn)量受到能量輸入的較大影響，隨著能量輸入的增大，菌體形態(tài)由球狀向絲狀轉(zhuǎn)變，繼而帶來了較高的蛋白產(chǎn)量[25-26]。

圖4 AN-GlaA和AN-GpdA利用葡萄糖為碳源發(fā)酵168 h的細(xì)胞形態(tài)

圖5 AN-GpdA利用木糖為碳源展示CALB酶活力

圖6 AN-GpdA發(fā)酵144 h的菌絲形態(tài)

圖7 AN-GpdA利用甘蔗渣水解液為碳源展示CALB酶活力

2.4 利用甘蔗渣水解液為碳源發(fā)酵黑曲霉展示脂肪酶產(chǎn)酶分析

葡萄糖和木糖作為木質(zhì)纖維素中主要的單糖成分，本研究利用木質(zhì)纖維素甘蔗渣的水解液作為碳源，添加相應(yīng)營養(yǎng)成分用于研究AN-GpdA菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶，其發(fā)酵展示CALB酶活力曲線如圖7所示，168 h時(shí)展示CALB活力達(dá)到600.42 U/g。相比利用葡萄糖或木糖等單一碳源，利用甘蔗渣水解液達(dá)到最高展示酶活力的時(shí)間較晚，可能是纖維素水解物中存在著乙酸、羥甲基糠醛、糠醛、甲酸等有害物質(zhì)，影響了細(xì)胞的生長與產(chǎn)酶，因此延長了菌體產(chǎn)酶時(shí)間[27]。

3 討論

本研究通過替換黑曲霉表面展示CALB菌株 (AN-GlaA) 的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pGlaA為組成型啟動(dòng)子pGpdA，所構(gòu)建黑曲霉表面展示CALB菌株AN-GpdA，有效改善了其展示CALB的發(fā)酵性能，使其在發(fā)酵過程中生長的同時(shí)進(jìn)行產(chǎn)酶，無需添加誘導(dǎo)劑，操作簡便。利用葡萄糖為碳源發(fā)酵至 96 h其展示脂肪酶活力達(dá)到466.40 U/g，與同時(shí)期的AN-GlaA相比提高了接近45%，而且酶活力更加穩(wěn)定。AN-GpdA還可利用木糖產(chǎn)酶，因木糖具有較高的代謝效率以及菌體形態(tài)發(fā)生變化，達(dá)到較高的展示酶活力 (1 100.28 U/g)。最后以水解制備的甘蔗渣水解液為碳源發(fā)酵，獲得了良好的產(chǎn)酶性能。利用高效分泌蛋白的無孢黑曲霉作為宿主構(gòu)建蛋白展示細(xì)胞具有表達(dá)量高及絲狀真菌表面疏水性對脂肪酶酯化催化的促進(jìn)作用，本研究采用組成型啟動(dòng)子，有利于改善無孢黑曲霉的生長穩(wěn)定和酶的展示表達(dá)效率，拓展了黑曲霉木糖及木質(zhì)纖維素水解物等碳源的利用，在華南地區(qū)利用廢棄甘蔗渣水解物為發(fā)酵原料，符合地方綠色工業(yè)發(fā)展需求。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Constitutive display oflipase B on the cell surface ofand regulation of its fermentation

Yuanfeng Li, Shen Jin, Denggang Wang, Shuli Liang, Suiping Zheng, and Ying Lin

Guangdong Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering, School of Biology and Biological Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong, China

Displayinglipase B (CALB) on the cell surface ofis effectively applied for the industries of food, cosmetics, pharmaceutical and so on. Displaying CALB using induced promoter of glucoamylase on the cell surface ofSH-1 has some problems such as inhibiting its expression under high concentration of glucose, mycelium cleavage and decreasing enzyme activity in the later period of fermentation process. Displaying CALB manipulated by constitutive promoter from glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase instead of glucoamylase on the cell surface ofSH-1, called AN-GpdA, could solve the above problems effectively. Furthermore, it can not only use glucose, but also xylose as a sole carbon source. Enzyme activity of AN-GpdA using xylose for fermentation reached 1 100.28 U/g of dry cell. We also used lignocellulose such as the hydrolysate of bagasse for fermentation with good performance. The result would provide a novel strategy for the utilization of bagasse.

, lipase, cell surface display, constitutive promoter

December 4, 2017;

March 19, 2018

Science and Technology Planning Project of Guangzhou City (No. 201607010307).

Ying Lin. Tel: +86-20-39380698; E-mail: feylin@scut.edu.cn

10.13345/j.cjb.170477

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