基于懸浮電極介質(zhì)阻擋放電的低溫等離子體滅菌實(shí)驗(yàn)研究

江 敏 易志健 黃逸凡 朱劍豪 喻學(xué)鋒

1(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所 深圳 518055)2(深圳市中科摩方科技有限公司 深圳 518114)

1 引 言

低溫等離子體是部分電離的氣體，含有帶電離子、高能電子、激發(fā)態(tài)的活性原子、分子和自由基等多種化學(xué)成分，可被廣泛應(yīng)用在材料制備、表面改性處理、生物醫(yī)學(xué)、空氣凈化、食品等領(lǐng)域。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，低溫等離子體最初的應(yīng)用主要是對(duì)食物和器械的滅菌消毒。自 1996年 Laroussi[1]證實(shí)了大氣壓輝光放電等離子體對(duì)細(xì)菌有強(qiáng)烈的滅活作用后，低溫等離子體在滅菌方面的應(yīng)用越來(lái)越多。

Montie 等[2]利用輝光放電等離子體處理材料，發(fā)現(xiàn)材料表面附著的革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、真菌、孢子等含量均呈指數(shù)趨勢(shì)迅速降低，并提出了活性氧致使細(xì)胞膜破碎的假設(shè)。Lu 等[3]采用一種單電極射流裝置對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行滅菌機(jī)理研究，表明活性氧粒子在細(xì)菌滅活過(guò)程中起到重要的作用。同時(shí)，他們利用該裝置對(duì)白色念珠球菌進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明具有明顯的滅活效果[4]。Matthes 等[5]6 次重復(fù)利用氬氣等離子體射流對(duì)金黃色葡萄球菌微生物膜進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，等離子體造成細(xì)菌失活效果很穩(wěn)定，且金黃色葡萄球菌微生物膜不會(huì)產(chǎn)生等離子體抗體。華中科技大學(xué)的盧新培課題組研制出一種微細(xì)大氣壓低溫等離子體射流裝置，能夠快速地殺死根管內(nèi)部的糞腸球菌[6]。范明陽(yáng)與郝小龍[7]研究了氮氧源大氣壓等離子體射流對(duì)表面大腸桿菌的滅活作用，發(fā)現(xiàn)處理3 min 后，氮氧 1∶4 的大氣壓等離子體射流對(duì)大腸桿菌的滅活率達(dá)到 98.4%，其中 NO-γ、OI、·OH 等活性物質(zhì)在表面大腸桿菌滅活過(guò)程中起到了重要作用。

目前，很多研究都表明低溫等離子體對(duì)常見(jiàn)的細(xì)菌、真菌均具有顯著的滅活效果[8-13]。然而這些研究大部分采用的是等離子體射流裝置，對(duì)其他產(chǎn)生等離子體的裝置涉及比較少。同時(shí)，射流結(jié)構(gòu)作用面積小、功耗高、需外加氣體等，在一定程度上也束縛了等離子體射流的應(yīng)用推廣。而懸浮式電極介質(zhì)阻擋放電(Floating-Electrode Dielectric Barrier Discharge，F(xiàn)E-DBD)的低溫等離子體裝置基于介質(zhì)阻擋放電原理進(jìn)行設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，具有等離子體射流無(wú)可比擬的柔和、大面積均勻放電等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用在殺菌消毒、美容、凝血、傷口愈合、皮膚疾病、腫瘤治療等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文搭建了一款簡(jiǎn)易的 FE-DBD低溫等離子體裝置，旨在對(duì) FE-DBD 低溫等離子體在滅菌時(shí)的放電特性和滅菌效果進(jìn)行初步研究。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置的搭建

本文實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所述。整個(gè)裝置的負(fù)載是由前蓋、高壓電極和殼體組成。其中，前蓋和殼體采用直徑 35 mm 的聚四氟乙烯制成，兩者采用螺紋連接；高壓電極為直徑 30 mm、0.5 mm厚的圓形銅板并內(nèi)置于聚四氟乙烯中，有效防止在放電過(guò)程中發(fā)生爬電、邊緣擊穿等現(xiàn)象。圓形銅板連接高壓交流電源。當(dāng)人體或金屬物質(zhì)靠近聚四氟乙烯前蓋時(shí)，在兩者之間間隙處就會(huì)發(fā)生放電產(chǎn)生等離子體。其中，產(chǎn)生的等離子體面積的大小取決于高壓電極銅板的面積，等離子體密度取決于所施加電源的電壓和頻率。本文采用南京蘇曼的 CTP-2000K 低溫等離子體實(shí)驗(yàn)電源，放電電壓檢測(cè)采用 Tektronix P6015A 高壓探頭，放電電流檢測(cè)采用 Pearson 6585 電流探頭，示波器采用 Tektronix TBS1102。

2.2 細(xì)菌制備及滅菌方法

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，先進(jìn)行培養(yǎng)基制備和金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的培養(yǎng)。

(1)培養(yǎng)基配制：取 40 g 的 Luria-Bertani 營(yíng)養(yǎng)瓊脂，溶解定容到 1 000 mL；

細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)液配制：取 25 g 的 Luria-Bertani 肉湯，溶解定容到 1 000 mL。

(2)實(shí)驗(yàn)器材及其培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)液的滅菌：將上述配制的培養(yǎng)基、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)液及相關(guān)器材進(jìn)行 121℃ 的高壓滅菌處理。

(3)制備待涂培養(yǎng)皿：在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置15 mL 的培養(yǎng)基，均勻涂覆，待其凝固備用。

(4)細(xì)菌傳代與濃度確定：首先各挑取一個(gè)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別放置于 5 mL 經(jīng)滅菌后的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)液中，在 37℃ 細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 8 h；然后用活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法測(cè)得金黃色葡萄球菌和大腸桿菌濃度均為 3.2×105mL。

(5)滅菌方法：首先，取上述金黃色葡萄球菌和大腸桿菌濃度的菌懸液均勻地涂在經(jīng)滅菌的蓋玻片上(2 cm×2 cm)，二者各涂 6 片，每片涂50 μL 菌懸液；其次，按圖1所示，將涂有菌懸液的蓋玻片進(jìn)行等離子體處理；最后，將每組參數(shù)處理后的蓋玻片放置于 10 mL 的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)液浸泡，反復(fù)搖動(dòng)使蓋玻片的細(xì)菌充分融入營(yíng)養(yǎng)液中。

(6)細(xì)菌培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：從上述(5)中充分洗滌蓋玻片的細(xì)菌菌液中各取 100 μL 菌液分別涂覆在帶培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后放置于 37℃ 細(xì)菌培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，用活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)存活的菌落數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 放電特性

利用電壓、電流探頭和示波器對(duì) FE-DBD 低溫等離子體裝置的電氣參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。未放電時(shí)的電壓、電流波形如圖2所示，此時(shí)施加的電壓峰值為 19.6 kV，電流峰值為 16 mA。隨著蓋玻片靠近裝置的前蓋時(shí)，在兩者之間的間隙處逐漸產(chǎn)生等離子體。當(dāng)蓋玻片與裝置前蓋距離為 3 mm時(shí)，此時(shí)放電的電壓、電流波形如圖3所示，此時(shí)電壓峰值為 20 kV，電流峰值為 50 mA。

從圖2和圖3可以看出，F(xiàn)E-DBD 低溫等離子體裝置放電的電壓、電流均比放電前升高，且電流變化相對(duì)明顯，從 16 mA 升高到 50 mA。這是因?yàn)楫?dāng)與蓋玻片上菌懸液作用時(shí)，放電能量需先將裝置前蓋與蓋玻片之間的氣體擊穿，引起氣體分子發(fā)生電離，產(chǎn)生大量帶電粒子。在外加電場(chǎng)的作用下，這些帶電粒子漂移到陽(yáng)極產(chǎn)生電流細(xì)絲，從而導(dǎo)致電流明顯升高。此外，從電壓電流波形中可見(jiàn)，F(xiàn)E-DBD 低溫等離子體的放電方式為典型的空氣介質(zhì)阻擋絲狀放電類型。

3.2 滅菌結(jié)果分析

圖2 懸浮電極介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體裝置未放電前電壓、電流波形Fig. 2 The waveforms of voltage and current before FE-DBD plasma device discharging

圖3 懸浮電極介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體裝置對(duì)菌懸液放電的電壓、電流波形圖Fig. 3 The waveforms of voltage and current as FE-DBD plasma device discharging

利用 FE-DBD 低溫等離子體滅菌裝置對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進(jìn)行滅活試驗(yàn)，并通過(guò)活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)存活菌落數(shù)來(lái)評(píng)估作用時(shí)間和作用距離對(duì)滅菌效果的影響。圖4 和圖5 分別顯示了經(jīng)不同作用時(shí)間、不同作用距離處理后在37℃ 培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng) 24 h 的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的滅活現(xiàn)象。

從圖4可以看出，當(dāng)放電電壓峰值為 20 kV、電流峰值為 50 mA、距離為 3 mm 時(shí)，F(xiàn)E-DBD低溫等離子體對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用 5 s 時(shí)間，部分細(xì)菌已開(kāi)始失活。隨著作用時(shí)間的增加，被滅活的細(xì)菌數(shù)量也急劇增加。當(dāng)作用時(shí)間為 30 s 時(shí)，金黃色葡萄球菌滅活效率達(dá)到99.9%，而大腸桿菌滅活效率達(dá)到 100%。

從圖5可以看出，當(dāng)放電電壓峰值為 20 kV、電流峰值為 50 mA、作用時(shí)間為 10 s 時(shí)，不同作用距離對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的滅活效果趨勢(shì)是一致的：滅菌效果隨著作用距離的增加而逐漸變差。當(dāng)裝置端面與蓋玻片的距離為 1 mm時(shí)，金黃色葡萄球菌滅活效率為 98.33%，而大腸桿菌滅活效率為 100%；當(dāng)作用距離調(diào)整到 5 mm，金黃色葡萄球菌的滅活效率僅為19.44%，大腸桿菌滅活效率為 52.34%。這是因?yàn)榈入x子體中高能粒子(如活性粒子、激發(fā)態(tài)離子等)本身比較容易失活，在等離子體產(chǎn)生過(guò)程中也伴隨著不斷地消失衰減，故隨著作用距離的增大，滅菌效果逐漸變差。此外，F(xiàn)E-DBD 等離子體對(duì)大腸桿菌滅活效果優(yōu)于金黃色葡萄球菌，這與細(xì)菌的結(jié)構(gòu)有關(guān)：大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁較?。欢瘘S色葡萄球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁較厚，強(qiáng)度較堅(jiān)韌。

圖4 作用時(shí)間對(duì)滅菌效果的影響Fig. 4 Effect of different action time on sterilization

圖5 作用距離對(duì)滅菌效果的影響Fig. 5 Effect of different distance on sterilization

4 與國(guó)內(nèi)外相似研究對(duì)比分析

在裝置設(shè)計(jì)上，Kim 等[14]設(shè)計(jì)了幾種適合人體不同部分處理的 FE-DBD 電極結(jié)構(gòu)和放電裝置：主要采用石英或絕緣橡膠為阻擋介質(zhì)，且放電端的阻擋介質(zhì)厚度均為 1 mm，鎳金屬為電極，裝置整體安全性能高，產(chǎn)生的等離子體能夠與人皮膚直接接觸。張波等[15]利用紫銅圓柱體作為高壓電極，石英玻璃為阻擋介質(zhì)搭建了一款FE-DBD 等離子體，并通過(guò)電氣和光學(xué)特性診斷了其放電特性，表明其放電形式為空氣介質(zhì)阻擋絲狀放電類型。在應(yīng)用上，F(xiàn)ridman 等[16]研究了FE-DBD 低溫等離子體在凝血和滅菌的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明 FE-DBD 能夠有效地滅活細(xì)菌和促進(jìn)血液凝固。隨后其團(tuán)隊(duì)又利用 FE-DBD 低溫等離子體對(duì)黑色素瘤癌細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn) FE-DBD 能夠有效地引起癌細(xì)胞的凋亡[17]。趙會(huì)超等[18]利用自行搭建的 FE-DBD 低溫等離子體殺菌消毒儀進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)表明該裝置能夠有效地滅活大腸桿菌。FE-DBD 低溫等離子體具有低溫、柔和，能夠與人體直接接觸且不產(chǎn)生疼痛感等優(yōu)勢(shì)，但目前針對(duì) FE-DBD 低溫等離子體的放電特性和應(yīng)用研究還比較少。本工作主要是搭建一款簡(jiǎn)易的 FE-DBD 低溫等離子體裝置，對(duì)其滅活細(xì)菌效果和放電特性進(jìn)行了研究，為 FE-DBD 低溫等離子體的應(yīng)用推廣積累理論基礎(chǔ)。對(duì)比現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了 FE-DBD 低溫等離子體的放電形式為空氣介質(zhì)阻擋絲狀式放電，且具有優(yōu)異的滅菌性能，能夠高效滅活以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌和以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌。

5 結(jié)論與展望

本文基于介質(zhì)阻擋原理，研制了一款 FEDBD 低溫等離子體裝置，并用此裝置進(jìn)行金黃色葡萄球菌和大腸桿菌滅活的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該裝置對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的滅活作用。作用時(shí)間、作用距離對(duì)兩種細(xì)菌滅活效果趨勢(shì)是一致的。其中，隨著作用時(shí)間從5 s 增加到 30 s，細(xì)菌滅活效率逐漸增大；當(dāng)作用時(shí)間為 30 s 時(shí)，細(xì)菌滅活效率達(dá)到 99.99% 以上。隨著作用距離的增加，對(duì)兩種細(xì)菌的滅菌效果均是遞減的，即作用距離為 1 mm 時(shí)的滅菌效果優(yōu)于 3 mm 和 5 mm。

目前對(duì) FE-DBD 低溫等離子體的研究，大多數(shù)以實(shí)驗(yàn)探索為主，理論研究和在臨床應(yīng)用中推廣尚有諸多問(wèn)題亟待進(jìn)一步解決，如 FE-DBD 低溫等離子體與生物組織的作用機(jī)制，對(duì)正常組織細(xì)胞的影響，如何設(shè)計(jì)高效且符合醫(yī)用的等離子體裝置等。