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    低溫等離子體輔助聚乳酸表面接枝乳酸鏈球菌素及抗菌性

    2018-07-25 06:27:10戶帥鋒王潔卿李鵬輝韋宗偉王懷雨
    集成技術(shù) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:抗菌劑接枝等離子體

    戶帥鋒 王潔卿 李鵬輝 高 明 韋宗偉 王懷雨 王 喆

    1(深圳市中科摩方科技有限公司 深圳 518114)2(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

    1 引 言

    抗菌活性包裝是目前食品及材料領(lǐng)域研究開發(fā)的一個前沿和熱點,是將抗菌劑混入高聚物包裝材料中,使其具有抗菌活性的包裝方法??咕钚园b可以緩慢地釋放出抗菌劑,在包裝內(nèi)部維持長期穩(wěn)定的抗菌劑濃度,達(dá)到抗菌防腐的目的,以逐漸減少或代替向食品中加入的防腐劑[1]。其替代了傳統(tǒng)的向食品中添加抗菌劑的食品保藏方法,能長時間保持食品的營養(yǎng)和風(fēng)味,延長貨架期,提高安全性,能夠有效解決高水分活度食品的抗菌防腐難題。

    目前應(yīng)用的抗菌活性包裝分為兩類:(1)將抗菌劑包埋在基材內(nèi)部或直接涂抹在表面,通過向食品表面釋放抗菌劑實現(xiàn)抗菌活性,同時又通過控制抗菌劑的遷移溶出速率,實現(xiàn)持續(xù)性抗菌;(2)將抗菌劑分子與基材通過化學(xué)鍵等方式結(jié)合,固定在基材表面,使其不溶出,通過材料與食品的緊密接觸來實現(xiàn)抗菌活性,并阻止環(huán)境中微生物對食品的侵蝕,能夠長期保持抗菌活性[2]。

    抗菌包裝體系主要包括包裝基材、抗菌劑和食品三個部分。食品的貨架期除受自身因素影響外,還取決于包裝材料的特性。但現(xiàn)在常用的塑料包裝不易降解,容易造成白色污染,所以對可降解包裝材料的研究,一直是包裝領(lǐng)域的研究熱點。聚乳酸(Polylactic Acid,PLA)是一種原材料來源廣泛,廢棄后不會造成污染,且很有發(fā)展前途的高分子材料[3],非常適合做食品活性包裝基材。但 PLA 也存在一些缺點,如無抗菌性等。這些缺點限制了其在活性抗菌食品包裝領(lǐng)域的進一步應(yīng)用。

    乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種天然多肽抗菌素類物質(zhì),在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛[4,5]。Nisin 作為一種安全高效新型天然防腐劑,在國內(nèi)外均得到認(rèn)可,并且已經(jīng)應(yīng)用到食品行業(yè)的各個領(lǐng)域。將Nisin、殼聚糖和茶多酪復(fù)合配比對新鮮冷卻羊肉進行冷卻保鮮證明,Nisin 具有很好的抑菌效果,并發(fā)現(xiàn)殼聚糖和 Nisin 之間具有很好的交互反應(yīng)[6]。采用不同濃度的葡聚糖和海藻糖對 Nisin進行熱處理后穩(wěn)定性的影響研究。實驗結(jié)果表明,添加葡聚糖和海藻糖均能提高 Nisin 熱處理后的效價[7]。用葡萄提取物、Nisin 和乙二胺四乙酸與大豆分離蛋白復(fù)合的可食性薄膜不僅具有較好的物理性質(zhì),而且還有較高的抗菌活性[8]。

    等離子體改性技術(shù)能快速、高效地引發(fā)常規(guī)反應(yīng)中不能或很難實現(xiàn)的物理或化學(xué)變化,賦予膜材料表面各種優(yōu)異性能,而不改變基體材料本身的性質(zhì),是拓展高分子膜材料應(yīng)用范圍的一種重要方法[9]。將高分子材料進行表面改性,達(dá)到高性能或高功能,是經(jīng)濟有序地開發(fā)新材料的重要功能。近年來,利用低溫等離子體技術(shù)對高分子材料表面改性的研究十分活躍,其改性優(yōu)點具體體現(xiàn)在[10]:(1)賦予改性表面各種優(yōu)異的性能;(2)表面改性層,厚度極薄(從幾納米到幾百納米),整體性質(zhì)基本不變;(3)可以賦予一些材料本身不具有的性能,如抗菌特性等。

    本文將利用低溫等離子體技術(shù),在低真空的條件下對 PLA 膜進行表面改性,并對其表面性能進行表征。通過用 Nisin 溶液浸泡,從而使Nisin 接枝在改性的 PLA 薄膜表面,賦予 PLA 薄膜抗菌活性,促進其在食品包裝領(lǐng)域的應(yīng)用。

    2 材料與方法

    2.1 材料

    PLA 薄膜(4032D,厚度:40 μm)購自深圳光華偉業(yè)有限公司;Nisin(900 UI/mg)購自上海源葉生物科技有限公司;L.monocytogenes菌株(ATCC19115)購自廣東微生物菌種保藏中心。

    2.2 低溫等離子體處理

    低溫等離子體處理(Cold Plasma Treatment,CPT)采用自制的等離子體設(shè)備(400 kHz,200~500 W)。其中,等離子體設(shè)備的反應(yīng)室直徑為 100 nm,兩個電極板之間的距離為 25 mm。在(20±5)℃ 的環(huán)境下,PLA 薄膜樣品尺寸為50 mm×50 mm。實驗中,首先將反應(yīng)室抽真空至 100 Pa(無氣體通入),樣品在功率為 300 W 的條件下分別處理 0、15 s、30 s、45 s 和 60 s,并依次命名為 PLA0、PLA15、PLA30、PLA45 和PLA60;然后,將處理后的樣品放置于溫度為(20±5)℃、相對濕度為 50% 的條件下保存待用。

    2.3 Nisin 涂膜處理

    首先,將 Nisin 溶于蒸餾水,在室溫下以100 rpm 的速率攪拌 1 h 后,獲得 10 mg/mL 的Nisin 溶液。然后,Nisin 溶液經(jīng)過 5 300 rpm 冷凍離心 20 min,取上清液置于-20℃ 冷藏待用。最后,在(20±5)℃ 環(huán)境下,將 PLA0、PLA15、PLA30、PLA45 和 PLA60 分別置于解凍后的 Nisin 溶液中 2 min,再置于 40℃ 條件下烘干 6 h。將獲得的薄膜分別命名為 PN0、PN15、PN30、PN45 和 PN60,以上 5 組樣品合稱為PLA Nisin 薄膜,即 PN 薄膜。

    2.4 薄膜的性能表征

    2.4.1 原子力顯微鏡

    將膜樣品取一小片后,置于原子力顯微鏡(Bruker MultiMode 8,Bruker,德國)中,采用非接觸方式工作,諧振頻率約為 267 kHz,操作在手套箱(氧氣含量<0.1 ppm,水蒸氣含量<0.1 ppm)中完成。利用該手段,主要對 PLA 薄膜的粗糙度進行表征。

    2.4.2 水接觸角

    選用固體石蠟和玻璃作為基板材料。實驗前,對固體基板表面進行拋光和清洗處理。人工拋光后,首先分別用清潔劑、自來水、蒸餾水超聲清洗 15 min;然后,將基板取出在無水酒精中清洗 10 min,室溫下置于濾紙上吹干;最后,用微量注射器垂直緩慢地將 5 μL 膜液滴到水平放置的固體基板上,使用接觸角測定儀(OCA20,Dataphysics Co. Ltd.,德國)測定膜液接觸角。相同試驗重復(fù) 3 次,結(jié)果取平均值。

    2.4.3 抗菌性能測試

    將L.monocytogenes菌株(ATCC19115)接種于腦心津液瓊脂培養(yǎng)基表面,在 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng) 24 h,然后在胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)中進行兩次傳代培養(yǎng)恢復(fù)菌株活性。用生理鹽水進行梯度稀釋,得到 105CFU/mL的L.monocytogenes菌液待用。其中,CFU 為菌落形成單位(Colony-Forming Units)。

    取 2.5 mL 105CFU/mL 的L.monocytogenes菌液接種于 22.5 mL TSB-YE 中。將 PLA、PN0、PN15、PN30、PN45 和 PN60 分別加入上述溶液中作為 6 個實驗組,領(lǐng)取一組不加任何薄膜作為空白對照。每組均做 3 個平行,置于搖床中以 250 rpm 的速率震蕩培養(yǎng) 1 h。經(jīng)過梯度稀釋后,進行平板計數(shù)。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 粗糙度

    圖1 低溫等離子體處理對 PLA 薄膜表面性能的影響Fig. 1 The effect of cold plasma treatment on the properties of PLA film surface

    由圖1可知,隨著處理時間的延長,薄膜表面平均粗糙度(Ra)先增大后減小。這是由于低溫等離子體放電過程中產(chǎn)生的高能活性粒子、離子、自由基等,在處理中不斷轟擊 PLA 膜表面,碰撞傳導(dǎo)的能量遠(yuǎn)超過材料表面原子的結(jié)合能,引發(fā)化學(xué)鍵斷裂,產(chǎn)生表面刻蝕現(xiàn)象。但是,我們也可以看到,當(dāng)處理時間超過 30 s 后,PLA 薄膜的粗糙度呈下降趨勢,這與常規(guī)看起來并不相符。

    研究顯示,等離子體能量的增加導(dǎo)致分子單體斷裂成更多片段,因此薄膜的粗糙度隨著等離子體射頻的增加而減小[11]。另有研究表明,經(jīng)過氦氣和氬氣等離子體處理后,薄膜表面的凸起被刻蝕,薄膜粗糙度更加均勻,更加平滑[12]。而大氣等離子體處理的薄膜,由于空氣中氧氣的刻蝕作用更強,導(dǎo)致薄膜表面粗糙度增大。處理方式是影響薄膜表面粗糙度的一個因素,另一個因素則是薄膜的內(nèi)在結(jié)構(gòu)[13]。PLA 在擠出成型過程中,由于退火溫度的不同,導(dǎo)致薄膜表層和內(nèi)部的結(jié)晶度、均勻性不同。薄膜表面的分子結(jié)構(gòu)大多都是無定型態(tài),結(jié)構(gòu)更加松散,相對于內(nèi)層更容易被刻蝕。在 100 Pa、無處理氣體的條件下,高能量的離子和 PLA 易刻蝕的表層導(dǎo)致處理時間超過 30 s 后薄膜逐漸變得光滑。

    3.2 接觸角

    接觸角測量是一種快速、簡單的研究材料表面性能變化的方法。圖1 為水滴在膜表面 3 s 內(nèi)接觸角的變化趨勢。未經(jīng)等離子體處理改性的PLA 膜的接觸角為 82.5°,屬于疏水性膜。隨著等離子體處理時間的增加,PLA 薄膜的接觸角先下降后上升,在 15 s 降至最低 51.06°(P<0.05);在 45 s 和 60 s 時分別上升至 77.8°、75°,與未處理薄膜間無顯著差異(P>0.05)??梢?,薄膜的接觸角變化與粗糙度變化呈負(fù)相關(guān)。有研究表明,粗糙度和化學(xué)性質(zhì)的變化使材料表面的接觸角與楊氏方程產(chǎn)生差異[14,15]。根據(jù)經(jīng)典的潤濕理論[16],薄膜表面粗糙度的增加可以提高其在大氣中的親水性。上述兩種理論證實,等離子體處理對 PLA 薄膜表面粗糙度的影響導(dǎo)致了其接觸角的變化。

    3.3 菌落總數(shù)分析

    抗菌材料的抗菌活性取決于兩個方面:一是抗菌劑自身的抗菌活性及經(jīng)過擠出加工后的抗菌活性,這是材料具有抗菌活性的前提;二是抗菌劑從基材中的遷移溶出速率,這是材料具有抗菌活性的關(guān)鍵。對抗菌材料的制備和研究需要從這兩個方面入手。Nisin 是由 34 個氨基酸組成的短肽,氨基酸殘基賦予其親水性和親脂性。由于 Nisin 使L.monocytogenes菌體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶出,破壞菌體細(xì)胞膜的完整性進而導(dǎo)致菌體裂解死亡[17,18]。因此,Nisin 對L.monocytogenes具有良好的抗菌效果。Shiroodi等[19]通過共混包埋的方式制備出含 Nisin 的大豆分離蛋白(PPI)、乳清分離蛋白(WPI)和 PLA薄膜,將上述薄膜置于L.monocytogenes菌液中經(jīng)過 48 h 培養(yǎng)后,結(jié)果顯示含有 Nisin 的PPI、WPI 和 PLA 薄膜中菌液的濃度分別上升至 6.0 log10(CFU/mL)、8.47 log10(CFU/mL)和9.0 log10(CFU/mL)。這表明包埋后的 Nisin 不能充分與菌接觸,進而發(fā)揮其抑菌作用。本文選用L.monocytogenes作為抗菌對象,將 Nisin 接枝在PLA 薄膜表面,考察 PN 膜的抗菌活性。

    等離子體處理對 PLA 表面 Nisin 接枝效果的影響如圖2所示。經(jīng)過 1 h 震蕩培養(yǎng)后,空白對照組和 PLA 組的L.monocytogenes的菌落總數(shù)由初始的 4.0 log10(CFU/mL)分別增加至 5.61 log10(CFU/mL)、5.48 log10(CFU/mL),但兩者間無顯著差異(P>0.05)。而 PN0、PN15、PN30、PN45 和 PN60組的L.monocytogenes的菌落總數(shù)分別下降至3.01 log10(CFU/mL)、3.50 log10(CFU/mL)、3.47 log10(CFU/mL)、3.01 log10(CFU/mL)和2.25 log10(CFU/mL),顯示 Nisin 接枝后的 PN 薄膜具備不同的抑菌效果,且均好于 PLA 薄膜。抗菌效果不同表明接枝在薄膜表面的 Nisin 含量不同。經(jīng)過等離子體處理的 PLA 膜表面粗糙度的變化導(dǎo)致接觸面積增加,刻蝕作用導(dǎo)致表面自由基增多,可有效與 Nisin 進行接枝反應(yīng),從而具備一定的抗菌性能。在 Nisin 溶液浸泡后,等離子體處理前 45 s 和未經(jīng)等離子體處理的 PLA 薄膜間的抗菌效果差異不顯著(P>0.05),說明 Nisin 的接枝量差異不明顯。隨著低溫等離子體處理時間延長至 60 s,PN60 的抑菌效果達(dá)到最佳。

    圖2 低溫等離子體處理對 PN 薄膜抗菌性能的影響Fig. 2 The effect of cold plasma treatment on the antimicrobial properties of PN film surface

    4 與國內(nèi)外相似研究的對比分析

    Xu 等[20]通過化學(xué)偶聯(lián)的方法將 Nisin 接枝固定在聚醚酰亞胺薄膜表面,將其置于 10 mL 105CFU/mLS.aureus溶液中,經(jīng)過 24 h 培養(yǎng)后,95.2% 的S.aureus被殺死。Aveyard 等[21]通過化學(xué)偶聯(lián)的方法將 Nisin 接枝固定在經(jīng)過氦氣等離子體處理后的聚苯乙烯薄膜表面,以薄膜對L.monocytogenes和S.aureus的抑菌效果證明,不同條件下 Nisin 的接枝效果不同。因此,本文主要是通過 PN 膜的抑菌性能強弱來判斷經(jīng)等離子體處理的 PLA 薄膜與 Nisin 接枝的程度。其中,PN60 組的菌落總數(shù)最低(P<0.05),證明其具有最優(yōu)的抑菌效果。

    5 結(jié) 論

    低溫等離子體處理可明顯改善 PLA 薄膜表面的物理性質(zhì)。表征結(jié)果表明,平均粗糙度隨著處理時間的增加先增大后減小,表面親水性與粗糙度呈正相關(guān)。通過對抑菌性能的表征發(fā)現(xiàn),PN60具有最好的抑菌效果,這說明低溫等離子體處理60 s 后的 PLA 薄膜與 Nisin 的接枝效果最好。

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