低溫等離子體對(duì) MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的化療增敏作用

易志健 江 敏 崔浩東 王 菲 周文華 黃逸凡 喻學(xué)鋒

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 生物醫(yī)藥與技術(shù)研究所 深圳 518055)

1 引 言

低溫等離子體(Cold Atmospheric Plasma，CAP)，作為一種由電子和離子群組成的近電中性電離氣體，因其溫度接近室溫，且在大氣壓下即可產(chǎn)生，也被稱作大氣壓低溫等離子體，其組分主要包括活性粒子、紫外輻射、帶電粒子及瞬時(shí)電場(chǎng)。其中，活性粒子主要有活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)和活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)兩大類?；钚匝踔饕?O2－、H2O2、·OH、1O2等；活性氮主要包括·NO、·NO2、NO3－、ONOO－等[1,2]。研究表明，等離子體技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出其特有的價(jià)值，廣泛應(yīng)用于血液凝固、傷口愈合、消毒滅菌、牙齒美白及腫瘤治療等方面[3,4]。其中在腫瘤治療方面的應(yīng)用引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[5]?；熥鳛楫?dāng)前治療腫瘤的主要方式，在多次給藥后，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物表現(xiàn)出明顯的耐藥性，極大地影響了治療效果。為此，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，尋找新型癌癥治療手段具有重大意義[6,7]。研究顯示，在低溫等離子體與細(xì)胞作用過(guò)程中，培養(yǎng)基內(nèi)的 ROS 等物質(zhì)濃度顯著增加，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[8,9]，而且產(chǎn)生的 ROS可以影響細(xì)胞膜通透性，有利于細(xì)胞內(nèi)吞的發(fā)生[10]。此外，低溫等離子體可以選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞影響較小[11]。

阿霉素(Doxorubicin，DOX)作為一種廣譜的化療藥物，但其本身對(duì)細(xì)胞沒(méi)有選擇性，容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而影響藥效發(fā)揮[12]。而金納米棒(Gold Nanorods，Au NRs)被細(xì)胞攝取以后，對(duì)溶酶體膜產(chǎn)生作用，致使溶酶體破裂，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞壞死和凋亡[13]。相對(duì)于DOX，Au NRs 通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被內(nèi)含體包裹后進(jìn)入細(xì)胞，逃避 P-糖蛋白識(shí)別，可對(duì)耐藥細(xì)胞產(chǎn)生殺傷[14]，但也受到藥物濃度和作用時(shí)間的限制。

本文提出一種雙介質(zhì)阻擋放電低溫等離子體射流裝置(以下統(tǒng)稱“CAP”)來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，針對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì) DOX 及 Au NRs 的耐藥性，對(duì) MCF-7 乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行化療增敏，并探討了化療增敏的作用機(jī)理。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置的搭建

圖1 低溫等離子體聯(lián)合化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞示意圖Fig. 1 Scheme of cold atmospheric plasma combined chemotherapeutic drugs for cancer cell killing

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示，低溫等離子體負(fù)載采用雙介質(zhì)阻擋放電裝置。其中，高壓電極為直徑2 mm 的銅棒，內(nèi)介質(zhì)為內(nèi)徑 2 mm、外徑 4 mm的 U 型石英管，外介質(zhì)為 5 mL 的石英針筒。接地電極采用細(xì)銅絲，纏繞在針筒的噴嘴處，與高壓電極之間距離為 10 mm。整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置作用氣體選用高純氬氣，電源采用蘇曼 CTP-2000K 的高壓交流電源。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，利用高壓探頭 Tektronix P6015A、電流探頭 Pearson 6585 和示波器Tektronix TBS1102 測(cè)得放電電壓峰值為 18 kV，電流峰值為 128.8 mA。利用 Fluke TiS75 紅外熱像儀，測(cè)得低溫等離子體射流溫度為 26.7℃。

2.2 低溫等離子體作用后培養(yǎng)基內(nèi)活性氧水平檢測(cè)

(1)ROS 探針配制：獲得 2', 7'-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFDA)，溶于二甲基亞砜(DMSO)中，得到 10 mmol/L 的儲(chǔ)備液，于－20℃ 避光保存。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：MCF-7 乳腺癌細(xì)胞于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為包含 10% 牛血清白蛋白(FBS)的改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)。

(3)MCF-7 細(xì)胞以每孔 5×104個(gè)的密度種植于 24 孔板內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)以后，換為 500 μL 新鮮DMEM 培養(yǎng)基。其中，在空白 24 孔板中加入等量 DMEM 培養(yǎng)基，作培養(yǎng)基組。

(4)搭建低溫等離子體設(shè)備，調(diào)節(jié)參數(shù)，調(diào)整等離子體與培養(yǎng)基液面的距離，進(jìn)行等離子體處理。

(5)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間，取 100 μL 培養(yǎng)基，加入 10 μmol/L DCFDA 熒光探針，于 37℃孵育 30 min，然后通過(guò)熒光光譜儀(HITACHI F-4600)檢測(cè)熒光變化，激發(fā)波長(zhǎng)為 485 nm。

2.3 低溫等離子體作用后細(xì)胞內(nèi)活性氧及鈣離子水平檢測(cè)

(1)ROS 探針配制：獲得 2', 7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)，溶于 DMSO 中，得到10 mmol/L 的儲(chǔ)備液，于－20℃ 避光保存。

(2)Ca2＋檢測(cè)探針配制：獲得 Fluo 3-AM，溶于 DMSO 中，得到 2 mmol/L 的儲(chǔ)備液，于－20℃ 避光保存。

(3)MCF-7 以每孔 5×104個(gè)的細(xì)胞密度種植于 24 孔板內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)以后，換為 500 μL 新鮮DMEM 培養(yǎng)基。

(4)調(diào)節(jié)等離子體參數(shù)，調(diào)整同培養(yǎng)基液面間的高度，進(jìn)行等離子體處理。

單獨(dú)紫外(UV)處理：在等離子體和孔板間加裝接地鐵絲網(wǎng)，用石英片蓋住孔板，再進(jìn)行處理。

單獨(dú)電場(chǎng)處理：用防紫外玻璃片蓋住孔板，再用等離子體處理。

(5)細(xì)胞于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后通過(guò)熒光倒置顯微鏡(Olympus IX71)進(jìn)行 ROS 及 Ca2＋檢測(cè)。

(6)細(xì)胞內(nèi) ROS 檢測(cè)：采用磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)(5)中細(xì)胞進(jìn)行清洗后，加入分散于 PBS的 10 μmol/L DCFH-DA 熒光探針。繼續(xù)孵育 30 min后，進(jìn)行 PBS 清洗，于 490 nm 藍(lán)光激發(fā)下進(jìn)行熒光成像檢測(cè)。

(7)細(xì)胞內(nèi) Ca2＋檢測(cè)：采用 PBS 對(duì)(5)中細(xì)胞進(jìn)行清洗后，加入分散于杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)的 2 μmol/L Fluo 3-AM 熒光探針。繼續(xù)孵育 20 min 后，加入含有 1% FBS 的 DPBS 繼續(xù)孵育 40 min。DPBS 清洗后，于 490 nm 藍(lán)光激發(fā)下進(jìn)行熒光成像檢測(cè)。

2.4 金納米棒的制備

金納米棒(Au NRs)采用種子生長(zhǎng)法進(jìn)行制備[15]，合成路徑如下。

(1)制備種子液：將 5 mL 5 mmol/L 氯金酸(HAuCl4)溶液和 5 mL 0.2 mol/L 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液互溶后，加入 4.5 mL 的超純水，混勻。再加入用冰水現(xiàn)配的 600 μL 10 mmol/L硼氫化鈉(NaBH4)溶液，充分?jǐn)嚢?2 min，獲得種子液，于室溫下備用。

(2)制備生長(zhǎng)液：先后加入 0.2 mol/L CTAB溶液 6 mL、5 mmol/L HAuCl4溶液 1.2 mL、0.1 mol/L 硝酸銀(AgNO3)溶液 15 μL 和 1.2 mol/L鹽酸(HCl)溶液 12 μL，再加入 10 mmol/L 抗壞血酸溶液 700 μL，輕旋使溶液由暗紅色變?yōu)闊o(wú)色。

(3)在生長(zhǎng)液中迅速注入 12 μL 種子液，37℃過(guò)夜反應(yīng)，然后使用 12 000 rpm 離心 10 min，得到的沉淀用等體積的超純水再分散，獲得 Au NRs。經(jīng)過(guò)透射電鏡(JEM-3200FS)觀察，Au NRs 長(zhǎng)軸50～60 nm，短軸 10～20 nm。

2.5 低溫等離子體聯(lián)合化療藥物協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞

(1)MCF-7 以每孔 5×104個(gè)的細(xì)胞密度種植于 24 孔板內(nèi)，過(guò)夜培養(yǎng)以后，換為 500 μL 新鮮DMEM 培養(yǎng)基。DOX 及 Au NRs 按照不同濃度分散于培養(yǎng)基內(nèi)。

(2)調(diào)節(jié)等離子體參數(shù)，穩(wěn)定氣流，調(diào)整升降臺(tái)，使等離子體至培養(yǎng)基液面距離為 25 mm，進(jìn)行等離子體處理。

(3)處理完成后，關(guān)閉等離子體設(shè)備，細(xì)胞于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至 24 h。

(4)CCK-8 細(xì)胞存活率檢測(cè)：移除培養(yǎng)基，加入 300 μL 的 CCK-8 工作液。繼續(xù)孵育 1 h后，吸取 150 μL 培養(yǎng)液至 96 孔板，用酶標(biāo)儀測(cè)試 450 nm 處吸收值。其中，對(duì)照組為同樣濃度未進(jìn)行等離子體處理的化療藥物組。

(5)鈣黃綠素-AM/碘化丙啶(Calcein-AM/PI)染色實(shí)驗(yàn)：移除培養(yǎng)基，加入 300 μL 分散于 PBS的 Calcein-AM/PI 工作液(2 μg/mL Calcein-AM，3 μg/mL PI)，繼續(xù)孵育 10 min，PBS 清洗后進(jìn)行熒光成像。其中，Calcein-AM 使活細(xì)胞在藍(lán)光(490 nm)激發(fā)下呈綠色熒光(515 nm)，PI 使死細(xì)胞在綠光(535 nm)激發(fā)下呈紅色熒光(617 nm)。

3 結(jié)果與討論

3.1 低溫等離子體處理后培養(yǎng)基內(nèi)活性氧檢測(cè)

低溫等離子體作用細(xì)胞培養(yǎng)基，可以增加培養(yǎng)基內(nèi)活性粒子的含量，主要是 ROS 的濃度有所增加。為此，通過(guò)調(diào)節(jié)等離子體參數(shù)，設(shè)定一定的電壓，處理種植于 24 孔板的 MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng)基，等離子體距離液面間距設(shè)定為 25 mm。處理完成后，取 100 μL 培養(yǎng)基用于 ROS 檢測(cè)。ROS 可以將非熒光的 DCFDA 探針氧化為具有熒光信號(hào)的氧化型二氯熒光素(DCF)，進(jìn)而可通過(guò)熒光增加的幅度來(lái)評(píng)估培養(yǎng)基內(nèi) ROS的水平。等離子體處理 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，不同處理時(shí)間的結(jié)果如圖2(a)所示。由圖2(a)可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)等離子體處理后，培養(yǎng)基內(nèi)的 ROS 濃度增加。同時(shí)，處理 10～80 s 后發(fā)現(xiàn)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ROS 濃度明顯增加。此外，細(xì)胞存在的情況下，相同處理時(shí)間，培養(yǎng)基內(nèi) ROS 濃度有一定的降幅，認(rèn)為細(xì)胞消耗了一定量的 ROS 用于磷脂和膜蛋白的氧化。同時(shí)用等離子體處理磷酸鹽緩沖液(PBS)發(fā)現(xiàn)，熒光信號(hào)很弱，且沒(méi)有隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。推測(cè)等離子體作用培養(yǎng)基后產(chǎn)生的ROS，多數(shù)來(lái)自于等離子體與培養(yǎng)基內(nèi)組分的相互作用。因而針對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)不同的組分，檢測(cè)等離子體作用前后 ROS 的變化。

首先，檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi) FBS 對(duì) ROS 的影響，結(jié)果如圖2(b)所示。由圖2(b)可以看到，F(xiàn)BS濃度在 0～10% 時(shí)，ROS 的水平隨著 FBS 濃度的增加而增強(qiáng)。但當(dāng) FBS 濃度增加至 15% 時(shí)，ROS 水平含量有所下降，且無(wú)論細(xì)胞存在與否，結(jié)果均顯示出一定的降幅，表明 ROS 水平受到培養(yǎng)基內(nèi) FBS 的直接影響，該結(jié)論與不同 FBS濃度下 U87 細(xì)胞存活率一致[16]。其次，檢測(cè)了培養(yǎng)基內(nèi)葡萄糖濃度對(duì)等離子體處理后 ROS 的影響，結(jié)果如圖2(c)所示。當(dāng)無(wú) FBS 存在時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，ROS 水平?jīng)]有顯著變化；而培養(yǎng)基內(nèi)存在 10% FBS 時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，ROS 水平顯著升高，進(jìn)一步揭示了 FBS 對(duì)等離子體處理后培養(yǎng)基內(nèi) ROS 的影響。最后，檢測(cè)了培養(yǎng)基內(nèi)其他組分對(duì) ROS 的影響，結(jié)果如圖2(d)所示。在培養(yǎng)基內(nèi)加入谷胱甘肽、丙酮酸鈉及L-半胱氨酸后，培養(yǎng)基內(nèi) ROS 的濃度明顯降低，且 FBS 存在與否沒(méi)有直接影響，表明這些物質(zhì)起到了抑制 ROS 的作用。綜上所述，F(xiàn)BS 和葡萄糖對(duì)等離子體處理后培養(yǎng)基內(nèi) ROS 的水平存在顯著的影響。因此，在進(jìn)行等離子體殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，培養(yǎng)基選擇包含 10% FBS 的高糖 DMEM。

圖2 低溫等離子體作用后培養(yǎng)基內(nèi)活性氧水平檢測(cè)Fig. 2 Detection of reactive oxygen species levels in medium after cold atmospheric plasma treatment

3.2 細(xì)胞內(nèi)活性氧及鈣離子水平檢測(cè)

由于培養(yǎng)基內(nèi) ROS 水平的變化會(huì)進(jìn)一步影響細(xì)胞的存活狀態(tài)，因此探究了殺傷細(xì)胞的機(jī)制。將 MCF-7 細(xì)胞種植于 24 孔板，過(guò)夜培養(yǎng)后，更換為 500 μL 新鮮 10% DMEM 培養(yǎng)基，等離子體處理時(shí)間設(shè)定為 40 s。處理完成后，細(xì)胞于 37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 2 h，然后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS 及 Ca2＋水平檢測(cè)。其中，細(xì)胞內(nèi) ROS 檢測(cè)選擇 DCFH-DA 探針，該探針本身沒(méi)有熒光，被細(xì)胞攝取后，細(xì)胞內(nèi)的酯酶將其水解為不能透過(guò)細(xì)胞膜的還原型二氯熒光素(DCFH)，接著細(xì)胞內(nèi)的 ROS 將其氧化為具有綠色熒光信號(hào)的DCF，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱從而評(píng)估細(xì)胞內(nèi) ROS 水平。細(xì)胞內(nèi) Ca2＋水平通過(guò)熒光探針Fluo 3-AM 進(jìn)行檢測(cè)：細(xì)胞攝取 Fluo 3-AM 后，酯酶將其水解為 Fluo 3 而滯留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo 3與細(xì)胞內(nèi) Ca2＋結(jié)合后，表現(xiàn)出顯著的綠色熒光。細(xì)胞內(nèi) ROS 及 Ca2＋水平檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，等離子體處理細(xì)胞后，細(xì)胞質(zhì)顯示出綠色熒光信號(hào)，表明細(xì)胞內(nèi)存在 ROS 和 Ca2＋。而處理前加入 ROS 抑制劑 N-乙酰半胱氨酸(NAC)后，熒光信號(hào)顯著降低減弱，表明細(xì)胞內(nèi)的 ROS、Ca2＋主要來(lái)自于培養(yǎng)基。此外，單獨(dú)電場(chǎng)及 UV作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的熒光信號(hào)并沒(méi)有增加，表明培養(yǎng)基內(nèi)的 ROS 可能來(lái)自于等離子體產(chǎn)生的活性粒子與培養(yǎng)基內(nèi)組分的相互作用。培養(yǎng)基內(nèi)的 ROS 作用于細(xì)胞膜，改變了細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而將細(xì)胞外的 ROS、Ca2＋及其他物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，而細(xì)胞內(nèi) ROS、Ca2＋水平的增加進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

3.3 低溫等離子體聯(lián)合化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞

圖3 低溫等離子體作用后細(xì)胞內(nèi)活性氧及 Ca2＋ 水平檢測(cè)(比例尺均為 50 μm)Fig. 3 Detection of intracellular reactive oxygen species and Ca2+ levels after cold atmospheric plasma treatment

低溫等離子體作用培養(yǎng)基產(chǎn)生大量的 ROS，使得細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，將外源 ROS 和Ca2＋轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)，細(xì)胞膜通透性的改變，一定程度上增加了細(xì)胞對(duì)外源物質(zhì)的攝取，因而可以將一些化療藥物或具有化療效果的納米材料更多地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，從而顯示出增敏耐藥性細(xì)胞化療的效果。本文選擇 DOX 和 Au NRs 聯(lián)合等離子體來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。首先，將化療藥物按照不同濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，等離子體處理 40 s后，MCF-7 細(xì)胞繼續(xù)孵育至 24 h；然后，通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率，同時(shí)通過(guò) Calcein-AM/PI 進(jìn)行細(xì)胞活死染色。等離子體聯(lián)合 DOX殺傷細(xì)胞的 CCK-8 結(jié)果如圖4(a)所示。由圖4(a)可以看到，等離子體單獨(dú)作用細(xì)胞，顯示出 20% 的細(xì)胞殺傷效率。MCF-7 細(xì)胞對(duì) DOX表現(xiàn)出濃度依賴的細(xì)胞毒性：當(dāng) DOX 濃度為4 μg/mL 時(shí)，顯示出 46% 的細(xì)胞殺傷效率；而聯(lián)合等離子體治療后，細(xì)胞殺傷效率增加至 88%。表明除了等離子體帶來(lái)的細(xì)胞毒性外，通過(guò)改善細(xì)胞膜通透性，增加細(xì)胞對(duì) DOX 的攝取，進(jìn)而增敏了 DOX 的化療效果。等離子體聯(lián)合 Au NRs 殺傷腫瘤的 CCK-8 結(jié)果如圖4(b)所示。聯(lián)合治療的細(xì)胞殺傷率為 90%，而 16 μg/mL Au NRs 帶來(lái)的細(xì)胞殺傷效率僅為 64%，也顯示出等離子體增敏化療的效果。相對(duì)于等離子體聯(lián)合 Au NRs 的治療效果，聯(lián)合 DOX 表現(xiàn)出更好的增敏效果。表明細(xì)胞膜通透性的增加對(duì)于小分子藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)好于稍大尺寸的 Au NRs(長(zhǎng)軸：(55.8±3.54)nm；短軸：(12.4±1.43)nm)。接下來(lái)，分別選擇2 μg/mL DOX、16 μg/mL Au NRs 聯(lián)合等離子體治療癌細(xì)胞。在相應(yīng)濃度下，2 種藥物單獨(dú)殺傷效率都在 50% 以上。分別取藥物單獨(dú)處理或藥物聯(lián)合等離子體處理后 24 h 的細(xì)胞進(jìn)行 Calcein-AM/PI 活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)，其中綠色熒光信號(hào)表示活細(xì)胞，而紅色熒光表示死細(xì)胞，染色結(jié)果如圖4(c)所示。相對(duì)于單獨(dú)藥物組，等離子體聯(lián)合治療后，紅色熒光信號(hào)顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了等離子體對(duì) MCF-7 乳腺癌細(xì)胞顯示出化療增敏的效應(yīng)。

圖4 低溫等離子體聯(lián)合化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞Fig. 4 Cold atmospheric plasma combined chemotherapeutic drugs for cancer cell killing

4 與國(guó)內(nèi)外相似研究對(duì)比分析

Graves 與 Bauer[17]認(rèn)為低溫等離子體產(chǎn)生的活性氧/氮物質(zhì)引發(fā)了凋亡介導(dǎo)的信號(hào)通路。Yan等[16]使用低溫等離子體裝置處理含不同 FBS 濃度(0、10%、20%、30%)的培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基中 FBS 濃度的增加，U87 細(xì)胞存活率增加。本文中 15% FBS 的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)等離子體處理后，培養(yǎng)基內(nèi) ROS 水平有所降低，細(xì)胞存活率上升，與 Yan 等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但是 0～10% FBS 的培養(yǎng)基經(jīng)處理后，ROS 水平上升，對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率降低，填補(bǔ)了 FBS 濃度小于 10% 時(shí)等離子處理對(duì)細(xì)胞影響的空白。

Torii 等[18]發(fā)現(xiàn)低溫等離子體能有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常成纖維細(xì)胞(WI-38)沒(méi)有顯著的凋亡發(fā)生。Mirpour 等[19]發(fā)現(xiàn)等離子體能顯著降低乳腺癌細(xì)胞活力，對(duì)正常細(xì)胞影響不大。Jalili 等[20]使用低溫等離子體聯(lián)合鐵納米顆粒降低MCF-7 細(xì)胞存活率。Cheng 等[21]使用等離子體處理 U87 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，細(xì)胞攝取金納米顆粒的效率顯著增加，而正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞(E6/E7)對(duì)金納米顆粒的攝取速率沒(méi)有顯著增加，其表現(xiàn)出的細(xì)胞選擇性，使低溫等離子體可以聯(lián)合金納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。Zhu 等[22]認(rèn)為等離子體聯(lián)合載藥核殼納米顆粒殺傷腫瘤，主要通過(guò)下調(diào)癌細(xì)胞增值和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，以及增加細(xì)胞對(duì)載藥核殼納米顆粒的攝取，來(lái)有效改善化療中細(xì)胞的耐藥性。本文通過(guò)等離子體聯(lián)合 DOX及 Au NRs 殺傷腫瘤細(xì)胞，通過(guò)改善細(xì)胞膜通透性，增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的攝取速率，進(jìn)一步增敏了 DOX 和 Au NRs 的化療效果。

5 結(jié)論與展望

低溫等離子體作用細(xì)胞以后，培養(yǎng)基內(nèi) ROS水平隨著處理時(shí)間的增加而顯著上升，且細(xì)胞的存在一定程度上消耗了培養(yǎng)基內(nèi)的 ROS。在 0～10% FBS 范圍內(nèi)，培養(yǎng)基內(nèi) ROS 水平隨著 FBS 濃度的增加而升高；而 FBS 濃度增加至15% 時(shí)，ROS 水平開(kāi)始下降，且細(xì)胞存活率同F(xiàn)BS 濃度呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)葡萄糖濃度的改變也對(duì)培養(yǎng)基內(nèi) ROS 的增加有所貢獻(xiàn)。培養(yǎng)基內(nèi)存在谷胱甘肽、丙酮酸鈉和L-半胱氨酸時(shí)，ROS 會(huì)顯著降低，揭示其起到抑制 ROS 的作用。培養(yǎng)基內(nèi) ROS 的增加進(jìn)一步改善了細(xì)胞膜通透性，使得外源 ROS 和 Ca2＋水平顯著增加，而單獨(dú)電場(chǎng)及 UV 作用并沒(méi)有增加細(xì)胞內(nèi)的 ROS 和 Ca2＋。與此同時(shí)，處理前添加 ROS 抑制劑 NAC 后，細(xì)胞內(nèi) ROS、Ca2＋濃度也顯著降低。表明等離子體作用培養(yǎng)基產(chǎn)生的 ROS，通過(guò)影響細(xì)胞膜通透性來(lái)提高細(xì)胞內(nèi) ROS 和 Ca2＋水平，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。等離子體單獨(dú)作用細(xì)胞，可以殺傷 20%的 MCF-7 乳腺癌細(xì)胞。分別聯(lián)合 DOX、Au NRs治療后，細(xì)胞殺傷效率增加為 88% 和 90%，而單獨(dú)藥物治療的殺傷效率只有 46% 和 64%，揭示了等離子體對(duì) MCF-7 乳腺癌細(xì)胞的化療增敏效果。

低溫等離子體作用細(xì)胞產(chǎn)生 ROS 的機(jī)理還不夠明確，細(xì)胞膜通透性改變的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。但等離子體能選擇性致死腫瘤細(xì)胞、改善細(xì)胞膜通透性及增敏化療效果，可為抗腫瘤提供一種新的思路。等離子體技術(shù)與抗癌藥物或納米材料有機(jī)結(jié)合，能夠極大地提高癌細(xì)胞的滅活效果，在癌癥治療領(lǐng)域尤其是皮下治療具有廣闊的應(yīng)用前景。