低溫等離子體制備天然功能性多糖

韋宗偉 王潔卿 戶帥鋒 高 明 王懷雨 王 喆

1(深圳市中科摩方科技有限公司 深圳 518114)2(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 生物醫(yī)用材料與界面研究中心 深圳 518055)

1 引 言

羧甲基纖維素鈉(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC)是一種由纖維素經(jīng)醚化后得到水溶性陰離子的直鏈高分子。由于其具有水溶性佳、易生物降解和生物相容性好等優(yōu)點，被廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。CMC 可作為功能表面材料，與甲殼素、聚丙烯腈等物質(zhì)復(fù)合制成可凈化水質(zhì)的薄膜，在解決工業(yè)污水排放、凈化家庭飲用水等方面具有較大的應(yīng)用前景[1]。在醫(yī)用材料上，經(jīng)過處理的 CMC 不僅可作為穩(wěn)定的乳化劑應(yīng)用在針劑上，CMC 還可以作為在片劑上的成膜劑和粘結(jié)劑，具有減輕患者手術(shù)后的疼痛，防止患者皮膚黏膜相互粘連等作用[2,3]。海藻酸鈉(Sodium Alginate，SA)是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸按(1→4)鍵連接而成的一種天然多糖。SA 含有游離的羧基，這使其性質(zhì)活潑，具有很高的離子交換功能。SA 在速釋藥物中可以作為藥物的崩解劑，加速藥物的釋放，提高藥物的藥效。SA 由于其低毒性、可降解和良好的生物相容性，在食品、化妝品等醫(yī)用材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，而對其進行改性使其具有生物功能性，也具有較大的應(yīng)用前景[4,5]。

等離子體改性技術(shù)能快速、高效地引發(fā)常規(guī)反應(yīng)中不能或很難實現(xiàn)的物理或化學(xué)變化，賦予膜材料表面各種優(yōu)異性能，而不改變基體材料本身的性質(zhì)，是拓展高分子膜材料應(yīng)用范圍的一種重要方法。利用低溫等離子體技術(shù)對高分子材料表面進行改性研究，其改性優(yōu)點具體體現(xiàn)在：(1)賦予改性的表面各種優(yōu)異的性能；(2)表面改性層，厚度極薄(從幾納米到幾百納米)，整體性質(zhì)基本不變；(3)可以賦予一些材料本身不具有的性能，如抗菌特性[6,7]。

傳統(tǒng)的多糖降解方法主要是化學(xué)法、氧化法、酶解法和物理降解法。其中，化學(xué)法降解工藝條件較難掌握，生產(chǎn)成本高，污染嚴重，且降解產(chǎn)物復(fù)雜，所以現(xiàn)有研究較少。董詩竹[8]利用過氧化氫(H2O2)制備低分子量鹽藻聚糖硫酸酯，結(jié)果表明 H2O2濃度越高，降解后的產(chǎn)物分子量和硫酸根含量越低，而硫酸根與褐藻糖膠的生物活性密切相關(guān)，所以采用氧化法降解多糖需要控制好參數(shù)，以減少對多糖活性的影響。李汶潓等[9]利用殼聚糖酶降解殼聚糖，得到抗氧化的降解產(chǎn)物試劑 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力達 92.60%。酶解法雖然工藝溫和，但成本高昂?；诘入x子體改性多糖的研究，方法簡單、綠色環(huán)保無污染，且大都集中在殼聚糖的改性研究。Chokradjaroen 等[10]利用氧化劑(如過氧化氫、過硫酸鉀、亞硝酸鈉等)與等離子體技術(shù)結(jié)合處理殼聚糖，改變其分子鏈結(jié)構(gòu)。這種方法中，化學(xué)試劑用量少且能實現(xiàn)殼聚糖快速地降解，制備的低分子殼聚糖和殼寡糖收率高。Ekezie 等[11]采用液相等離子體技術(shù)處理β-殼聚糖溶液后對其性能進行測試發(fā)現(xiàn)，處理后的β-殼聚糖溶液黏度下降，結(jié)晶度被破壞。馬鳳鳴[12]通過脈沖等離子體對殼聚糖進行降解，同時賦予殼聚糖新的功能性。翟佳慧等[13]對殼聚糖與甲基聚乙二醇單醚進行官能團偶聯(lián)，制備出具有水溶性且有抑菌作用的殼聚糖。由等離子體處理技術(shù)可知，等離子體攜帶的高能粒子進入空氣，使得空氣中的氧氣、氮氣分子等離子化，這些離子化的分子進入水中可以形成氨基、羥基等活性自由基，自由基的強氧化特性及高能粒子的沖擊使多糖分子鍵斷裂，產(chǎn)生自由基，從而改變多糖結(jié)構(gòu)的同時也使多糖產(chǎn)生新的生物活性，如抗氧化、抗菌等特性[14]。對于等離子體技術(shù)處理多糖的研究，大多數(shù)是在改性殼聚糖上，如降低殼聚糖的分子量，使其更容易水解。國內(nèi)對其他多糖的研究則較少，且處理的多糖均未表現(xiàn)出明顯的抗菌和抗氧化特性。本文采用低溫等離子體技術(shù)對羧甲基纖維素鈉(CMC)和海藻酸鈉(SA)進行處理，制備出具有生物功能的羧甲基纖維素鈉和海藻酸鈉，旨在引進一種新的制備具有生物功能多糖的手段。

2 材料與方法

2.1 材料

本文中所涉及的試驗儀器及材料如表1和2所示。

2.2 試驗方法

2.2.1 多糖溶液的制備

取 0.5 g 多糖(如 CMC 和 SA)置于 250 mL燒杯中，準確加入 99.5 mL 蒸餾水，磁力攪拌2 h，靜置消泡，制得 0.5 % 多糖溶液，備用。

2.2.2 低溫等離體子體處理多糖溶液

采用低溫等離子體射頻放電的方式對多糖溶液進行處理。其中，處理裝置主要由一個噴嘴的金屬管與等離子體電源的正電極連接，距離噴嘴下端 2～3 mm 處放置一個玻璃器皿。實驗首先取20 mL 多糖溶液(CMC 和 SA 等)加入到玻璃凹槽中，然后放置于低溫等離子體噴頭下端，多糖溶液液面與噴頭距離約為 2～3 mm，放電電壓為 2 kV，處理 30 min。

表1 主要實驗儀器名稱及廠家Table 1 The main experimental equipment name and manufacturer

表2 試劑名稱及廠家Table 2 Reagent name and manufacturer

2.2.3 改性多糖性能的測試

(1)多糖溶液處理前、后的 pH 值測試

分別取經(jīng)過低溫等離子體處理的多糖溶液(CMC、SA)和未經(jīng)處理的多糖溶液(作為空白對照) 10 mL 置于 50 mL 的離心管中，將已校正好的 pH 計電極插入溶液中，連續(xù)攪拌直到 pH計的數(shù)值穩(wěn)定后，記錄下處理后在 0 h 時的 pH值，每個樣品重復(fù)測 3 次，取平均值。最后，依次在 24、48、72 和 96 h 測試多糖溶液 pH 值的變化情況。

(2)多糖溶液處理前、后的黏度測試

首先，分別在經(jīng)過低溫等離子體處理的多糖溶液(CMC、SA)和未經(jīng)處理的多糖溶液(作為空白對照)中，取 7 mL 溶液于旋轉(zhuǎn)流變儀的裝料槽中。然后，調(diào)整電腦參數(shù)，測試多糖溶液的黏度。最后，通過 Original 8.0 軟件畫出多糖溶液處理前、后的黏度變化。

2.2.4 改性多糖功能的測試

(1)多糖溶液處理前、后抗菌性的測試

首先，將濃度為 107CFU/mL 的金黃色葡萄球菌液，通過梯度稀釋至菌液濃度為 102CFU/mL。其中，CFU 為菌落形成單位(Colony-Forming Units)。其次，取 0.5 mL 濃度為 0.5% 的改性多糖溶液(未改性的多糖溶液作為空白對照)并加入 4.5 mL 102CFU/mL 的金黃色葡萄球菌液，渦旋振蕩后置于 37℃ 恒溫搖床培養(yǎng) 30 min 后，取 1 mL 混合液加入到平板上，倒入平板計數(shù)瓊脂、搖勻、凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。最后，通過自動菌落計數(shù)儀對菌落數(shù)進行測定，并使用 IBM SPSS Statistics 軟件對比多糖溶液處理前、后抗菌能力的差異。

(2)多糖溶液處理前、后抗氧化性的測試

首先，精確稱取 3.5 mg DPPH 試劑，加入無水乙醇溶解并用無水乙醇定容到 10 mL 容量瓶，搖勻。其次，吸取 1 mL 于 10 mL 容量瓶中，加入無水乙醇定容，得到濃度為 0.035 mg/mL 的DPPH 液，放于冰箱備用。最后，將 4 mL 0.5%多糖溶液與 4 mL DPPH 溶液混合、黑暗保存30 min 后測得吸光度值A(chǔ)1；4 mL 濃度為 0.5%多糖溶液與 4 mL 無水乙醇的混合液置于黑暗保存 30 min 后測定吸光度A2；4 mL 無水乙醇與4 mL DPPH 溶液的混合液置于黑暗保存 30 min后測定吸光度A3。最終通過公式(1)計算 DPPH的自由基清除率K。

3 結(jié)果與討論

3.1 低溫等離子體處理對多糖溶液 pH 值的影響

由圖1可知，經(jīng)過低溫等離子體處理的水、羧甲基纖維素鈉(CMC)和海藻酸鈉(SA)的溶液pH 值均呈下降趨勢。其中，經(jīng)過低溫等離子體處理的水溶液 pH 值下降最明顯，大致在 3 左右。這可能是因為，等離體子體在空氣中活化的氮氣分子，進入水溶液產(chǎn)生氨基自由基，隨后被羥基自由基氧化，產(chǎn)生游離的硝酸根離子，導(dǎo)致 pH 降低。而 CMC 和 SA 對應(yīng)的 pH 值為5.5～5.7。相比于水溶液，經(jīng)過處理的 CMC 和SA 溶液并未呈現(xiàn)明顯的 pH 值下降現(xiàn)象，這主要是游離的硝酸根離子與 CMC 和 SA 降解后產(chǎn)生的自由基結(jié)合。另外，隨著時間的變化，各組溶液對應(yīng)的 pH 值均無明顯變化。因此，該結(jié)果表明，低溫等離子體處理后的多糖溶液體系穩(wěn)定。

圖1 多糖溶液處理前、后 pH 值的變化Fig. 1 Changes in pH before and after Polysaccharide solution treatment

3.2 低溫等離子體處理對多糖溶液黏度的影響

由圖2(a)可知，與空白組的羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉相比，處理組溶液黏度均出現(xiàn)下降。這主要是因為：在等離子體處理過程中，產(chǎn)生的高能粒子及氧化物將多糖分子鏈打斷或氧化斷裂，從而使多糖降解，分子量下降，對應(yīng)的溶液黏度也會下降。因此，該結(jié)果表明，低溫等離子體處理可有效降解多糖。

3.3 低溫等離子體處理對多糖溶液抗菌性能的影響

由圖2(b)可知，CMC、SA 和水溶液的抗菌性均具有顯著性差別(P＜0.001)，即經(jīng)過處理的多糖溶液抗菌性，明顯強于水溶液的。后者具備抗菌性主要是溶液中游離的高反應(yīng)活性基團。由pH 與黏度的結(jié)果可知，經(jīng)處理后的 CMC 和 SA溶液中游離的高反應(yīng)活性基團明顯少于水溶液，說明起抗菌作用的更多是由于降解之后多糖產(chǎn)生的活性官能團。因此，可以推斷：低溫等離子體可賦予多糖一定的抗菌性能。

3.4 低溫等離子體處理對多糖溶液抗氧化性能的影響

DPPH 的自由基清除率K越高，表明被測試物質(zhì)的抗氧化活性越強。由圖3 可知，羧甲基纖維素鈉在波長為 517 nm 時，空白組的吸光度A1＝0.403，A2＝0.009，A3＝0.341，K＝－15.54%；實驗組的吸光度A1＝0.169，A2＝0.003，A3＝0.341，K＝51.32%，表明空白組的羧甲基纖維素鈉不具備抗氧化性，而經(jīng)過低溫等離子體處理的羧甲基纖維素鈉具有抗氧化性。海藻酸鈉在波長為 517 nm 時，空白組的吸光度A1＝0.400，A2＝0.049，A3＝0.301，K＝－16.61%；實驗組的吸光度A1＝0.107，A2＝0.081，A3＝0.301，K＝91.36%，表明空白組的海藻酸鈉不具備抗氧化性，而經(jīng)過低溫等離子體處理的海藻酸鈉具有抗氧化性。因此，可以推斷：低溫等離子體處理可賦予多糖一定的抗氧化性。DPPH 自由基的清除能力與提供氫或電子的數(shù)量直接相關(guān)。當?shù)蜏氐入x子體降解多糖后，多糖分子鏈變短，羥基活性增強，提供氫或電子的數(shù)量增加，與 DPPH自由基反應(yīng)而形成穩(wěn)定的分子，從而達到清除的目的[12]。

圖2 多糖溶液的黏度變化及抗菌效果的顯著性分析Fig. 2 Analysis of viscosity changes and antibacterial effects of polysaccharide solution

圖3 羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉溶液處理前、后的吸光度Fig. 3 Absorbance before and after treatment of sodium carboxymethyl cellulose and sodium alginate solutions

4 與國內(nèi)外相似研究的對比分析

雖然已有較多低溫等離子體對多糖降解的研究，但均側(cè)重于對降解效率的研究，而對降解產(chǎn)物的功能性研究仍較少。馬鳳鳴等[14]運用脈沖等離子體技術(shù)提取黑木耳多糖發(fā)現(xiàn)，脈沖等離子體技術(shù)對細胞破壁效果優(yōu)于超聲波法，且對熱敏活性成分的降解更為有效。Cheng 等[15]利用等離子體技術(shù)降解水中的酚類化合物發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間延長至 60 min，其降解率可達 100%。馬鳳鳴[12]通過等離子體對殼聚糖進行降解，產(chǎn)生具有抗氧化活性的降解產(chǎn)物并且其抗菌性能也得到增強。本文通過對降解產(chǎn)物的抗菌效果及抗氧化特性進行研究，初步證明運用等離子體技術(shù)對CMC 和 SA 的降解，可使降解產(chǎn)物具備一定的抗菌和抗氧化活性。這可為今后研究等離子體技術(shù)改性多糖提供新的探索。

5 結(jié) 論

采用低溫等離子體射頻放電的方式分別對羧甲基纖維素鈉(CMC)和海藻酸鈉(SA)溶液進行等離子體處理。通過利用等離子體的高能和高活性對多糖進行降解，獲得的多糖溶液的性質(zhì)發(fā)生變化：

(1)經(jīng)過低溫等離子體處理的多糖溶液，pH值都會有一定程度的下降，且都呈弱酸性；

(2)經(jīng)過低溫等離子體處理的多糖溶液，由于多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子量減少，溶液黏度均明顯下降，流動性增加；

(3)經(jīng)過低溫等離子體處理的多糖溶液，在分子鏈被打斷的同時有一些活性基團接枝在分子結(jié)構(gòu)上，使得溶液具有抗菌和抗氧化等生物活性功能。