產(chǎn)香枯草芽孢桿菌在醬香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

王 西，沈 毅，張亞東，王冬梅

(四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺646500)

醬香型白酒是中國(guó)白酒的重要香型，采用“四高兩長(zhǎng)”“二九八七”的獨(dú)特釀造技術(shù)，所釀造的白酒具有“醬香突出，幽雅細(xì)膩，酒體醇厚，回味悠長(zhǎng)，空杯留香持久”的風(fēng)格特點(diǎn)。隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，對(duì)于白酒釀造技術(shù)以及白酒風(fēng)味需求也越來越高，而白酒功能微生物的研究對(duì)提高白酒品質(zhì)具有重要價(jià)值。芽孢桿菌，包括嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌以及地衣芽孢桿菌等都有較強(qiáng)的水解淀粉和蛋白質(zhì)的能力，是醬香型白酒的風(fēng)味物生成和風(fēng)格形成的重要菌類[1]。由于芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶與淀粉酶，其水解原料形成豐富的前體環(huán)境，有利于風(fēng)味物質(zhì)的生成[2]。枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科細(xì)菌，為革蘭氏陽性嗜熱桿菌，已經(jīng)證實(shí)這類嗜熱芽孢微生物能產(chǎn)乙偶姻[3-4]、四甲基吡嗪[5]和呋喃扭爾。醬香型白酒生產(chǎn)本質(zhì)上是釀酒微生物代謝及所產(chǎn)酶催化各種酶促反應(yīng)的過程，而“高溫堆積”則為醬酒生產(chǎn)提供了各種復(fù)雜的微生物和酶，富集的主要是酵母，同時(shí)細(xì)菌、霉菌也明顯增多[6]。醬香型三次酒產(chǎn)酒量一般能達(dá)到10%左右，屬于“大回酒”高產(chǎn)酒時(shí)段，對(duì)整批酒質(zhì)有著極其重要的作用。本研究利用從高溫大曲中分離得到的枯草芽孢桿菌，制成菌粉分別添加至醬香型二次酒高溫堆積前和入池發(fā)酵前的糟醅中，模擬醬香型白酒生產(chǎn)，入池發(fā)酵40 d，以提高三次酒的品質(zhì)，同時(shí)考察不同添加方式、添加量對(duì)糟醅和酒質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：從LJ高溫大曲中篩選的枯草芽孢桿菌G2017-12。

試劑及耗材：所用糟醅、高溫大曲、稻殼均來源于四川省古藺郎酒廠有限公司。豆粕粉（粉碎過60目篩）、玉米黃粉、K2HPO4等均為食品級(jí)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器設(shè)備：StableFlex纖維頭（50/30 μmDVB/Carboxen/PDMS）、57550-U手動(dòng)萃取手柄，美國(guó)Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；1.5 t地上衡，蘇州太恒稱重設(shè)備有限公司；高精度電子分析天平，上海精科儀器有限公司；SCQ-2201系列超聲波清洗機(jī)，上海聲彥超聲波儀器有限公司；TDL-50臺(tái)式低速離心機(jī)，常州梅香儀器有限公司；FJG微生物培養(yǎng)罐（150 L），溫江工大輕工機(jī)械有限公司；小型噴霧干燥機(jī)GG-6000Y，上海桂戈實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 功能微生物種子培養(yǎng)

將搖瓶培養(yǎng)過的枯草芽孢桿菌移至微生物培養(yǎng)罐擴(kuò)大培養(yǎng)。準(zhǔn)確稱量豆粕粉10 kg、玉米黃粉2 kg、K2HPO41 kg、功能菌種2.5 kg和適量蒸餾水添加到滅菌后的培養(yǎng)罐（滅菌操作：通熱蒸汽對(duì)罐體升溫，當(dāng)溫度達(dá)120℃、壓強(qiáng)0.11 MPa時(shí)保持溫度和壓力20 min），制成100 L的培養(yǎng)液[7-9]。

發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度（35±1）℃，通氣量25～40m3/h，攪拌速度150～160 r/min，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵過程的溶氧在20%以上，罐壓0.02～0.04 MPa，發(fā)酵過程中pH值保持在6.5～7.5。培養(yǎng)時(shí)間約24 h，最適放罐時(shí)間為26～28 h[10-11]。制成的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液經(jīng)噴霧干燥[12-14]成粉末備用。

1.2.2 醬香型二次酒高溫堆積與入池發(fā)酵

醬香型二次酒開窖、取酒、攤晾、撒曲后，模擬醬香型白酒工藝進(jìn)行高溫堆積和入池發(fā)酵。將備好的枯草芽孢桿菌菌粉在高溫堆積前分別按0.5‰、1‰、4‰、7‰、10‰的接種比例添加至700 kg（1甑）糟醅中（此為高溫堆積前添加組，簡(jiǎn)稱“堆積組”），以不接入功能菌粉的糟醅為空白對(duì)照（簡(jiǎn)稱“空白組”），同時(shí)另取5個(gè)堆在堆積后、入池發(fā)酵前添加0.5‰、1‰、4‰、7‰、10‰的接種比例至700 kg糟醅作比較（此為入池發(fā)酵前添加組，簡(jiǎn)稱“入池組”），其中菌粉采用適量36℃溫水活化30 min后使用。操作同時(shí)進(jìn)行，各組糟醅做標(biāo)記，操作具體要求如下。

堆積前，將初始糟醅攪拌均勻，再分成若干小堆，每堆準(zhǔn)確稱量700 kg，單獨(dú)起堆，根據(jù)要求分成“堆積組”“入池組”“空白組”，同時(shí)操作，糖化時(shí)間控制為5 d，并以單獨(dú)一口窖池發(fā)酵，全過程模擬醬香型白酒生產(chǎn)；然后入池時(shí)將各組的每堆（700 kg）糟醅分別入池發(fā)酵，采用編織布隔離區(qū)分，并做好標(biāo)記，用窖泥封窖，發(fā)酵時(shí)間為40 d。高溫堆積前、入池時(shí)、發(fā)酵40 d后立即測(cè)定各組糟醅的水分、酸度、蛋白質(zhì)和四甲基吡嗪含量。當(dāng)發(fā)酵期滿，開窖取醅，將“堆積組”“空白組”“入池組”分別上甑蒸餾，對(duì)蒸餾得到的酒樣進(jìn)行頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction）結(jié)合GC-MS分析，同時(shí)對(duì)各組酒樣進(jìn)行感官鑒定。

1.2.3 糟醅及酒樣中香味物質(zhì)測(cè)定[15-17]

本研究香味物質(zhì)以特征香味物質(zhì)四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethyrazine,TTMP）為參考目標(biāo)，采用頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合GC-MS分析糟醅和酒樣中揮發(fā)性成分及吡嗪類物質(zhì)的含量。

樣品處理：取糟醅20 g，研磨充分后加入40 mL蒸餾水浸泡12 min，然后攪拌加超聲波處理40 min，離心取上清液6 mL于15 mL萃取瓶中，加入2 g NaCl(酒樣稀釋10倍，則直接取6 mL于15 mL萃取瓶中，不加NaCl)。插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60℃左右頂空萃取45 min取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250℃)中，熱解吸4 min進(jìn)樣。采用全掃描模式對(duì)醬香型三次酒酒樣和糟醅中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)。

氣相色譜條件：色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)，彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫35℃(保持5 min)，以4℃/min升溫至135℃，再以8℃/min升溫至180℃保持5 min，運(yùn)行時(shí)間43 min；汽化室溫度250℃；載氣為高純氦(He)(99.999%)；柱前壓7.62 psi，載氣流速0.8 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為20∶1；溶劑延遲時(shí)間2 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源(electron ionization，EI)，離子源溫度230℃，接口溫度250℃。

定性定量方法：采用選擇離子掃描模式對(duì)四甲基吡嗪的4個(gè)特征離子進(jìn)行掃描。根據(jù)峰面積與含量成正比的關(guān)系，用GC-MS聯(lián)用儀計(jì)算其峰面積對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值，根據(jù)已建立的四甲基吡嗪響應(yīng)值-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到糟醅中四甲基吡嗪含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)、水分、酸度含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的方法測(cè)定[18]；水分測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》中的方法測(cè)定[19]；酸度測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB 5009.239—2016《食品酸度的測(cè)定》中方法測(cè)定[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量與接種方式對(duì)糟醅理化指標(biāo)的影響

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)“堆積組”“入池組”“空白組”高溫堆積前、入池與出池時(shí)糟醅的理化指標(biāo)（蛋白質(zhì)含量、水分、酸度、四甲基吡嗪）進(jìn)行了測(cè)定，詳細(xì)結(jié)果見表1、圖1、圖2。

由表1可知，接種量對(duì)發(fā)酵后糟醅的水分、酸度影響不明顯，“堆積組”糟醅出池后最高水分42.57%，而最低水分為42.23%，最高酸度0.93H+mmol/10 g，最低酸度 0.84H+mmol/10 g。同等添加量條件下，“堆積組”發(fā)酵后糟醅的蛋白質(zhì)消耗量、四甲基吡嗪生成量比“入池組”多?！岸逊e組”糟醅中最高四甲基吡嗪含量為6.98 μg/g，而“入池組”只有6.02 μg/g。添加功能性微生物枯草芽孢桿菌在白酒糟醅中，其特征香味物質(zhì)的提升強(qiáng)度跟其添加的方法有著密不可分的聯(lián)系，添加菌粉在糟醅堆積前會(huì)使堆積過程中功能性微生物大量繁殖和代謝，生成香味物質(zhì)和香味前體物質(zhì)。

由圖1可知，“堆積組”發(fā)酵后糟醅中殘留蛋白質(zhì)含量隨接種菌粉的數(shù)量增加而總體呈下降趨勢(shì)，從表1可知，在同樣的菌粉添加量時(shí)，殘留蛋白含量基本上低于“空白組”和“入池組”。蛋白質(zhì)減少可能與加入的枯草芽孢桿菌自身生長(zhǎng)消耗及代謝利用部分蛋白質(zhì)將其轉(zhuǎn)化成四甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶與其他微生物產(chǎn)生的蛋白酶協(xié)同作用，能降解復(fù)雜蛋白質(zhì)，對(duì)提高出酒率及酒的品質(zhì)有積極作用。

堆積前的糟醅中四甲基吡嗪含量較低，為0.02 μg/g。從圖2可看出，“堆積組”出池后，最低的四甲基吡嗪含量為2.34 μg/g，當(dāng)接種量達(dá)到4‰時(shí)，其四甲基吡嗪含量達(dá)到最高，為6.98 μg/g，是空白組1.53 μg/g的4.56倍。其次為7‰接種量的“堆積組”，含量為6.62 μg/g。因此選擇接種量為4‰進(jìn)行后續(xù)分析。

表1 不同接種量與接入方式的糟醅理化指標(biāo)

圖1 接種量對(duì)“堆積組”糟醅中蛋白質(zhì)含量的影響

圖2 接種量對(duì)“堆積組”糟醅中四甲基吡嗪含量的影響

2.2 酒樣中香味成分的分析

將“空白組”（接種量為0）、“堆積組”（4‰）、“入池組”（4‰）的酒樣進(jìn)行GC-MS成分分析，具體參數(shù)見表2。

由表2可見，“空白組”酒樣中共檢到42種物質(zhì)，醇類物質(zhì)9種，酯類物質(zhì)15種，醛類物質(zhì)2種，酮類物質(zhì)3種，酸類物質(zhì)6種，酚類化合物2種，芳香族及雜環(huán)類化合物5種。其中乳酸乙酯、乙酸乙酯相對(duì)含量較高，吡嗪類及前體物質(zhì)含量較低。

“堆積組”酒樣中共檢測(cè)出50種物質(zhì)，醇類物質(zhì)9種，酯類物質(zhì)18種，醛類物質(zhì)3種，酮類物質(zhì)3種，酸類物質(zhì)6種，酚類化合物3種，芳香族及雜環(huán)類化合物8種。含量最多的是乳酸乙酯，相對(duì)百分含量為1.635%，檢測(cè)到醬香風(fēng)味代表物質(zhì)有糠醛、吡嗪和糠醇等，其中2，3，5，6-四甲基吡嗪相對(duì)百分含量為0.037%，是“空白組”的3.08倍，三甲基吡嗪為0.008%，而“空白組”未檢測(cè)出。

“入池組”酒樣中共檢測(cè)出48種，醇類物質(zhì)9種，酯類物質(zhì)17種，醛類物質(zhì)3種，酮類物質(zhì)3種，酸類物質(zhì)6種，酚類化合物3種，芳香族及雜環(huán)類化合物7種。其中2，3，5，6-四甲基吡嗪相對(duì)百分含量為0.024%，是“空白組”的2倍。

“堆積組”的酒樣中檢測(cè)出物質(zhì)種類多于“入池組”“空白組”；“堆積組”中的四甲基吡嗪及前體物質(zhì)3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）相對(duì)含量分別為0.037%、0.105%，比“空白組”“入池組”高；“堆積組”中正丙醇、正丁醇、異戊醇、正己醇等高級(jí)醇相對(duì)含量較“空白組”低。

2.3 接入功能菌后酒樣感官分析

各組酒樣分別送于專業(yè)的品酒師進(jìn)行暗評(píng)，評(píng)價(jià)方法參照《郎酒醬香原酒質(zhì)量驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)》，各組酒品評(píng)結(jié)果詳見表3。

表2 各組酒樣揮發(fā)性成分GC-MS分析結(jié)果

由表3可以看出，“堆積組”的酒樣香味、口感均優(yōu)于“入池組”“空白組”的酒樣。

表3 各組的酒樣感官品評(píng)表

3 結(jié)論

從高溫大曲中分離得到的枯草芽孢桿菌，通過小型培養(yǎng)罐擴(kuò)大培養(yǎng)后，干燥成菌粉，模擬醬香白酒生產(chǎn)工藝進(jìn)行應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，不同接種量對(duì)糟醅存在影響，發(fā)現(xiàn)“堆積組”接種量為4‰時(shí)效果最佳，所得糟醅中四甲基吡嗪含量較高；接種方式上，堆積糖化前添加所產(chǎn)酒的香味物質(zhì)種類、特征香味含量、酒體感官質(zhì)量均優(yōu)于入窖前添加。