氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析醬香型白酒中乙醇的穩(wěn)定碳同位素比值

陳 航，沈保華，張素靜，向 平，卓先義，沈 敏

（司法鑒定科學(xué)研究院，上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海200063）

白酒是世界七大蒸餾酒之一，在國內(nèi)外享有盛譽(yù)[1]。貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)，是醬香型白酒的發(fā)源地和第一酒鎮(zhèn)，也是國酒茅臺(tái)的故鄉(xiāng)[2]，其出產(chǎn)的醬香型白酒富含深厚的文化底蘊(yùn)和極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。伴隨著個(gè)別人群對(duì)不法利益的索求，假酒時(shí)有出現(xiàn)，擾亂社會(huì)經(jīng)濟(jì)秩序，甚至危害人民生命安全，白酒的真?zhèn)魏蛽郊勹b別越來越受到研究人員和監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)的重視。隨著科學(xué)技術(shù)手段的發(fā)展，傅立葉變換紅外光譜[3]、電感耦合等離子體質(zhì)譜[4]、控溫水平衰減全反射-紅外光譜[5]等譜學(xué)技術(shù)在白酒真?zhèn)魏蛽郊勹b別中的研究逐漸深入。本研究團(tuán)隊(duì)曾利用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，建立了部分品類醬香型白酒的指紋圖譜，確證了醬香型白酒中35種特征組分，形成了基于相似度計(jì)算的數(shù)學(xué)鑒別模型[6]。

穩(wěn)定碳同位素比值（Delta C-13 value，δ13C）是一類物質(zhì)本身的天然特征值，其可以反映出物質(zhì)本身的來源等特征，近年來逐漸被各研究領(lǐng)域所重視和挖掘。2002年，我國以δ13C值為基礎(chǔ)，建立了蜂蜜摻假檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18932.1—2002），說明了δ13C值在食品真?zhèn)魏蛽郊勹b別中的獨(dú)特地位。在酒類真?zhèn)魏蛽郊勹b別中，δ13C值的應(yīng)用價(jià)值也正被全球范圍內(nèi)的專家學(xué)者所重視[7-9]，例如意大利、法國和德國聯(lián)合建立了葡萄酒中乙醇δ13C值的數(shù)據(jù)庫[10]。在我國，對(duì)酒中乙醇δ13C值分析和應(yīng)用的重視正與國際保持一致。今年7月《出口葡萄酒中乙醇穩(wěn)定碳同位素比值的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 4675.3—2016）開始實(shí)施正是一個(gè)標(biāo)志。

氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（Gas chromatography-Isotope ratio mass spectrometry，GC-IRMS）在分析低沸點(diǎn)物質(zhì)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。氣相色譜能減少復(fù)雜的樣品處理對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的干擾和影響[11]，還能避免外來雜質(zhì)的引入[12]，保證乙醇分析的高專屬性。在國外針對(duì)葡萄酒原產(chǎn)地溯源、真?zhèn)魏蛽郊勹b別的研究中，也大多采用氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)[13]。

本研究借鑒葡萄酒中乙醇的δ13C值分析方法，對(duì)33瓶產(chǎn)自貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠不同批次的醬香型白酒、13瓶該酒廠生產(chǎn)的其他系列白酒、17種由非茅臺(tái)鎮(zhèn)地區(qū)酒廠生產(chǎn)的白酒、2種工業(yè)酒精進(jìn)行分析，考察酒中乙醇的δ13C值在醬香型白酒真?zhèn)魏蛽郊勹b別中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Trace GC Ultra氣相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；MAT 253穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司，德國），配備GC Isolink接口；HP INNOWAX氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，美國Agilent公司）。

酒中乙醇的穩(wěn)定碳同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為BCR-660（歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，δ13C=-26.72‰，不確定度=0.09‰）；乙醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；去離子水由Milli-Q凈化系統(tǒng)（Millipore公司，美國）制得。

1.2 樣品準(zhǔn)備

樣品：購買自超市和網(wǎng)絡(luò)商店的63瓶白酒（表1），其中產(chǎn)自貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠不同批次的醬香型白酒33瓶（樣品1～33，分為A組），該酒廠生產(chǎn)的其他系列白酒13瓶（樣品34～46，分為B組），非茅臺(tái)鎮(zhèn)地區(qū)酒廠生產(chǎn)的代表性白酒共17種（每種1瓶，樣品47～63，分為C組）；工業(yè)酒精2種（各1瓶，樣品64、65，分為D組）。

分別按BCR-660和白酒標(biāo)注酒精度，以乙腈∶水混合溶液（V∶V=1∶2）稀釋至乙醇質(zhì)量濃度約為4.0 mg/mL，混勻密封，低溫保存待測(cè)。

1.3 儀器條件

進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)樣口溫度200℃，載氣為高純He。程序升溫條件：起始溫度45℃，保留3 min，以1℃/min速率升溫至52℃，以20℃/min的速率升溫至200℃，保留2 min。燃燒管溫度為1020℃，切入質(zhì)譜時(shí)間90 s。CO2參考?xì)庠?0 s，850 s和900 s分別切入20 s。切入反沖氦氣時(shí)間800 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

Isodat 3.0（美國Thermo Fisher公司）軟件用于數(shù)據(jù)獲取和同位素值計(jì)算。SPSS 19.0（美國IBM公司）軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 方法學(xué)考察

對(duì)方法進(jìn)行專屬性、精密度和準(zhǔn)確度考察。分別分析色譜純乙醇、色譜純乙腈和去離子水，觀察乙醇保留時(shí)間范圍內(nèi)是否存在干擾峰，考察方法專屬性。7天內(nèi)重復(fù)分析BCR-660樣品，每天連續(xù)測(cè)定3次，以7天×3次樣品分析值的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）描述方法精密度，以7 d×3次樣品分析值與證書標(biāo)定值的偏倚（Bias）描述方法準(zhǔn)確度。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性和保留時(shí)間

分別分析色譜純乙醇、色譜純乙腈、去離子水，色譜純乙醇在約440 s出現(xiàn)色譜峰，色譜純乙腈在約590 s出現(xiàn)色譜峰，去離子水在方法運(yùn)行時(shí)間內(nèi)不出現(xiàn)色譜峰（圖1）。

圖1 乙醇（A）、乙腈（B）、水（C）的GC-IRMS分析圖譜

GC Isolink接口中的燃燒管會(huì)將所有由氣相色譜通向同位素質(zhì)譜的含碳有機(jī)物轉(zhuǎn)化成為CO2氣體，對(duì)GC-IRMS方法提出了較高的專屬性要求。HP INNOWAX色譜柱以聚乙二醇(PEG)為固定相，使其擁有強(qiáng)極性和較高使用溫度上限的特殊優(yōu)勢(shì)，適宜分析以高極性物質(zhì)為溶劑的低沸點(diǎn)揮發(fā)性物質(zhì)。在本研究中，經(jīng)處理的樣品中，除乙醇外含量最高的含碳的物質(zhì)（乙腈）不對(duì)乙醇分析產(chǎn)生干擾。白酒中其他低沸點(diǎn)的含碳風(fēng)味成分含量與乙醇相比較低[14]，在IRMS中不產(chǎn)生信號(hào)。方法專屬性適合于白酒樣品的分析。

2.2 精密度和準(zhǔn)確度

連續(xù)7 d分析BCR-660（δ13C=-26.72 ‰），測(cè)量值分布在-27.20‰至-26.69‰范圍內(nèi)，測(cè)量值的CV值小于0.76%，與證書標(biāo)定值間的Bias值小于1.80%。本研究所用方法最大程度上簡(jiǎn)化了樣品處理過程，避免了樣品處理帶來的同位素分餾。采用了酒類樣品分析中不影響乙醇分析精度的乙腈作為稀釋劑[15]，將樣品中乙醇的碳濃度降低，使IRMS的電信號(hào)強(qiáng)度控制在3000至10000 mV這一能得到乙醇較真實(shí)的δ13C值的范圍內(nèi)[12]。方法的精密度和準(zhǔn)確度均符合分析要求。

2.3 白酒樣品分析

根據(jù)上述方法，對(duì)本研究中全部65個(gè)樣品進(jìn)行分析（表1）。

本研究測(cè)試的33個(gè)產(chǎn)自貴州省茅臺(tái)鎮(zhèn)某酒廠不同批次的醬香型白酒樣品（即A組樣品）中，乙醇的δ13C值分布在-19.53‰至-19.11‰之間。根據(jù)李鑫等研究者的模擬發(fā)酵研究[16]，該值接近由純高粱發(fā)酵所獲得乙醇的δ13C值（-18.9‰至-16.3‰），與該品類酒所標(biāo)示的主要發(fā)酵原料相符。33個(gè)樣品間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard Deviation，Std Dev）為0.12‰，小于方法精度，說明所分析的33個(gè)A組樣品乙醇來源（即發(fā)酵原料）、乙醇生成過程（即發(fā)酵過程）相同。

該酒廠生產(chǎn)的其他系列白酒（即B組）樣品中乙醇的δ13C值分布在-17.70‰至-14.41‰之間，與A組白酒樣品相比，A組白酒樣品的δ13C值更加貧化（圖2）。非茅臺(tái)鎮(zhèn)地區(qū)酒廠所生產(chǎn)白酒（即C組）樣品中乙醇的δ13C值分布在-30.35‰至-15.22‰之間（圖2）。2個(gè)工業(yè)酒精（即D組）樣品中乙醇的δ13C值分別為-11.60‰和-13.66‰（圖2），與文獻(xiàn)報(bào)道值處于同一水平[16]。

通過依次對(duì)本次分析中B組、C組和D組樣品中乙醇的δ13C值對(duì)A組白酒樣品做單樣本t檢驗(yàn)，均呈顯著性差異（P＜0.01）。其中，D組樣品與其他3組樣品間存在非常明顯的差異。這一數(shù)據(jù)揭示了穩(wěn)定碳同位素分析技術(shù)在鑒別醬香型白酒真假，尤其是辨別工業(yè)酒精勾兌的假白酒中可能具有巨大的應(yīng)用潛力。

分別以不同香型和酒精度對(duì)本研究中63個(gè)白酒樣品進(jìn)行分組（圖3），并依次進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，均無顯著性差異（P＞0.05）。白酒香型主要由其中非乙醇的風(fēng)味物質(zhì)決定[17-18]，不影響白酒中乙醇的δ13C值。不同白酒酒精度差異可能來源于發(fā)酵過程，其與成品白酒中乙醇的δ13C值間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

表1 醬香型白酒樣品及工業(yè)酒精中乙醇的δ13C值

圖2 各組白酒及工業(yè)酒精樣品中乙醇δ13C值的點(diǎn)狀圖

單一生產(chǎn)原料的白酒中乙醇的δ13C值與文獻(xiàn)報(bào)道相符。主要生產(chǎn)原料為大米的白酒種類（53號(hào)樣品（δ13C=-31.35‰）、54號(hào)樣品（δ13C=-29.01 ‰）和56號(hào)樣品（δ13C=-30.08‰）），其δ13C值貧化程度高，與模擬發(fā)酵研究中大米發(fā)酵所得乙醇的δ13C值（-30.3‰至-27.9‰）[16]相近；主要生產(chǎn)原料為高粱的白酒種類（52號(hào)樣品，δ13C=-16.13‰；61號(hào)樣品，δ13C=-17.83‰），δ13C值與模擬發(fā)酵研究中純高粱發(fā)酵所獲得乙醇的δ13C值（-18.9‰至-16.3‰）[16]相近。通過單一生產(chǎn)原料白酒的δ13C值分析，說明乙醇的δ13C值能較為準(zhǔn)確的還原其發(fā)酵原料信息，在單一生產(chǎn)原料白酒的摻假鑒別中具有應(yīng)用潛力。

多生產(chǎn)原料白酒中乙醇δ13C值的特征性仍需更深入的研究。多數(shù)白酒出于口感等多因素的考慮，常使用兩種以上生產(chǎn)原料，如某醬香型白酒使用小麥、大米、玉米、高粱、糯米5種糧食為主要發(fā)酵原料，其中大米、小麥的δ13C值富集，玉米的δ13C值貧化，在不清楚酒廠使用各原料配比的基礎(chǔ)上，難以簡(jiǎn)單的從單次分析得到的δ13C值數(shù)據(jù)中提取出與生產(chǎn)原料間的相關(guān)特征。

圖3 不同香型（A）和不同酒精度（B）白酒樣品中乙醇δ13C值的點(diǎn)狀圖

3 結(jié)論

GC-IRMS分析方法可以獲得白酒中乙醇的δ13C值，方法專屬性強(qiáng)、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足分析需求。同一酒廠出產(chǎn)的同系列不同批次醬香型白酒中乙醇具有相對(duì)穩(wěn)定的δ13C值，且與文獻(xiàn)報(bào)道的由其標(biāo)示發(fā)酵原料所得乙醇的δ13C值相近，符合其工藝特征。同一酒廠出產(chǎn)的同系列不同批次醬香型白酒中乙醇的δ13C值與其他系列白酒樣品、其他酒廠白酒樣品、工業(yè)酒精樣品均存在顯著性差異。單一生產(chǎn)原料的白酒中乙醇的δ13C值還與其發(fā)酵原料具有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。穩(wěn)定碳同位素比值分析技術(shù)在白酒真?zhèn)魏蛽郊勹b別中具有巨大的應(yīng)用潛力。