高效液相色譜法快速檢測(cè)麩曲中乙偶姻

劉學(xué)彬，古明亮，汪 平，周榆林，羅愛民

(1.四川茂華食品有限公司，四川眉山620010；2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院食品工程系，四川成都610000)

乙偶姻又名3-羥基-2-丁酮或甲基乙酰甲醇，化學(xué)式CH3CH(OH)COCH3，乙偶姻長(zhǎng)期以來是一種重要的食用香料，天然存在于奶油、可可、葡萄酒和草莓中[1]，具有明顯的讓人歡愉的奶油香味，廣泛應(yīng)用于食用香精香料中。四甲基吡嗪作為中國(guó)白酒中健康的風(fēng)味成分，其來源得到了極大的關(guān)注[2]，研究顯示其具有抑制血小板集聚、保護(hù)心腦血管、保肝護(hù)肝等臨床藥理作用，賦予了中國(guó)白酒保健功能[3]。研究表明，乙偶姻是傳統(tǒng)發(fā)酵食品重要香氣成分四甲基吡嗪生物合成的前體物質(zhì)，是多種微生物糖代謝的中間產(chǎn)物[4-5]。朱兵峰等[6]以獲得高產(chǎn)四甲基吡嗪菌株為目標(biāo),建立了一種內(nèi)源前體乙偶姻篩選策略,從醬香型高溫大曲中獲得1株高產(chǎn)四甲基吡嗪的枯草芽孢桿菌，豐富了制曲理論，為提高白酒中四甲基吡嗪含量的研究奠定了理論基礎(chǔ)。故研究提升酒曲中乙偶姻含量，對(duì)提升白酒質(zhì)量有著重要意義，這就需要建立一種快速檢測(cè)乙偶姻的方法。

目前關(guān)于檢測(cè)乙偶姻方面的文獻(xiàn)報(bào)道很少，福建農(nóng)林大學(xué)陳繼承等[7]采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了醋中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量,并表明兩者存在的顯著正相關(guān)性。Zeppa等[8]采用高效液相色譜法對(duì)奶酪中的乙偶姻進(jìn)行了檢測(cè)，除此以外對(duì)乙偶姻的檢測(cè)目前報(bào)道大多集中在氣相色譜或者氣質(zhì)聯(lián)用方法[9-12]，大多存在準(zhǔn)確性較差，樣品處理繁瑣復(fù)雜等缺點(diǎn)。本研究首次采用高效液相色譜法檢測(cè)麩曲中乙偶姻，具有樣品前處理簡(jiǎn)單，對(duì)操作人員要求不高，方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、便于推廣等優(yōu)勢(shì)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)不同麩曲樣品進(jìn)行了檢測(cè)。豐富了制曲理論，為篩選高產(chǎn)乙偶姻菌株，檢測(cè)酒曲中乙偶姻含量，進(jìn)而提高白酒中四甲基吡嗪含量，提升酒質(zhì)等多方面奠定了一定檢測(cè)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

麩曲：由實(shí)驗(yàn)室篩選得到的純種細(xì)菌接種制成。

試劑：乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品購自Aladdin試劑公司，甲醇（色譜級(jí)），無水氯化鈣，三氟乙酸，乙醇，無水氯化鈣，本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的生化試劑均為分析純及以上級(jí)別，溶液由蒸餾水配制。

儀器設(shè)備：Agilent 1200高效液相色譜儀，帶自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、色譜工作站，Phenomenex Gemini 5 μ C18110A(250×4.60 mm)色譜柱；JA12分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；YM-1000CT恒溫超聲儀（上海豫明儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理方法

在電子天平上精確稱取25 g麩曲樣品、0.25 g無水氯化鈣于100 mL三角瓶中，加50 mL 57%vol乙醇，置于恒溫超聲儀中超聲提取20 min，4000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜過濾，完成樣品制備供HPLC分析用。

1.2.2 色譜條件

采用Agilent 1200系列高效液相色譜儀，Phenomenex Gemini 5 μ C18110A(250×4.60 mm)色譜柱。色譜條件為：采用C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相比例為甲醇∶水（加0.05%三氟乙酸）=5∶5；檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；柱溫35℃；流速為0.8 mL/min，梯度洗脫；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用電子天平準(zhǔn)確稱取約500 mg乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品，溶于25 mL 57%乙醇中，搖勻，定容至刻度，配制成20 mg/mL的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品溶液。依次移取20 mg/mL的乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液稀釋配制成濃度為0.5 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。乙偶姻系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在選定的色譜條件下測(cè)定，以濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

通過查閱文獻(xiàn)[13-14]和對(duì)乙偶姻進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，綜合考慮目標(biāo)樣品的檢測(cè)靈敏度和響應(yīng)值，最終選取278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。選用甲醇作為流動(dòng)相，為了獲得較好的分離效果，需要對(duì)流動(dòng)相體系進(jìn)行優(yōu)化，反相色譜中通常在流動(dòng)相中添加適量極性調(diào)整劑以達(dá)到減少譜帶拖尾、改善峰形的效果，陳繼承等[7]選擇在流動(dòng)相中加入1%醋酸和0.05%三氟乙酸，有利于酸化后川芎嗪的穩(wěn)定性，達(dá)到改善色譜效果的作用。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本法在流動(dòng)相中加入0.05%三氟乙酸可明顯改善峰形，減少譜帶拖尾，優(yōu)化色譜效果。選用不同濃度甲醇經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，綜合了靈敏度、分離度與保留時(shí)間3項(xiàng)指標(biāo)，確定流動(dòng)相中甲醇的最佳濃度為50%，標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間約為4.1 min，可快速檢測(cè)麩曲中乙偶姻。在此基礎(chǔ)上考察不同柱溫對(duì)色譜效果的影響，確定最佳柱溫為35℃，此條件下峰形最佳，色譜效果較好。綜合以上各種因素，最終確定色譜條件為：采用C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相比例為甲醇∶水（加0.05%的三氟乙酸）=5∶5；檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；柱溫35℃；流速為0.8 mL/min。麩曲樣品經(jīng)乙醇提取，過0.22 μm濾膜直接進(jìn)樣。基于該條件檢測(cè)乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖見圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢出限和定量限

圖1 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖

基于以上確定的色譜條件對(duì)配制好的不同濃度乙偶姻溶液進(jìn)行含量測(cè)定，得到不同濃度乙偶姻的色譜峰圖，以濃度(單位mg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。其線性方程為y=498.89x-70.863，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9997，結(jié)果表明，對(duì)照品在0.5～2 mg/mL范圍內(nèi)線性良好。將對(duì)照品稀釋成不同濃度進(jìn)行色譜分析以確定本方法的檢出限，以3倍信噪比（S/N=3）計(jì)算該方法的檢出限的為6.78 μg/mL。以10倍信噪比為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其定量限的為22.6 μg/mL。

圖2 乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取麩曲樣品，通過上述樣品處理方法處理，分別放置0、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，基于以上色譜條件精確吸取進(jìn)樣，記錄所測(cè)樣品峰面積。數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，麩曲樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4 精密度試驗(yàn)

將同一待測(cè)樣品按上述色譜條件連續(xù)重復(fù)6次進(jìn)樣，記錄乙偶姻峰面積。計(jì)算表明乙偶姻峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.67%，結(jié)果表明（表2），本方法準(zhǔn)確性較好，可用于麩曲中乙偶姻的快速檢測(cè)。

表2 精密度試驗(yàn)

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

取同一樣品，采用樣品加標(biāo)方法測(cè)定計(jì)算回收率，具體結(jié)果見表3。由表3可知，乙偶姻加標(biāo)回收率為96.00%～102.25%之間，平均加標(biāo)回收率為99.25%，RSD為2.07%。表明本方法準(zhǔn)確性較高，適用于麩曲中乙偶姻的快速檢測(cè)。

2.6 不同樣品乙偶姻含量檢測(cè)

將本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的12株產(chǎn)乙偶姻菌株純種接種制成的麩曲樣品，按1.2方法進(jìn)行樣品處理，基于本文建立的高效液相色譜檢測(cè)條件上機(jī)檢測(cè)樣品乙偶姻含量，檢測(cè)結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)

表4 不同樣品乙偶姻含量檢測(cè)

結(jié)果表明，由不同菌株純種接種制成的麩曲均含有乙偶姻，不同樣品乙偶姻濃度存在一定的差異，供試樣品乙偶姻濃度分布范圍為0.67～15.56 mg/mL，其中編號(hào)為12的供試樣品乙偶姻含量較高，為15.56 mg/mL。

3 結(jié)論

基于高效液相色譜技術(shù)，本研究建立了一種快速檢測(cè)麩曲中乙偶姻的方法，本方法采用溶劑體系輔助超聲提取對(duì)麩曲樣品預(yù)處理，操作簡(jiǎn)便。檢測(cè)色譜條件為：采用C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相比例為甲醇∶水（加0.05%的三氟乙酸）=5∶5；檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm；柱溫35℃；流速為0.8 mL/min，保留時(shí)間4 min左右。本方法線性范圍為0.5～2 mg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，加樣回收率試驗(yàn)表明，乙偶姻回收率在96.00%～102.25%之間，平均加標(biāo)回收率為99.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.07%，結(jié)合穩(wěn)定性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果，表明本方法具有較好的精密度和重復(fù)性。與氣相色譜法相比，本方法具有樣品處理簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員要求低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低的優(yōu)勢(shì)，適用于白酒生產(chǎn)。

通過對(duì)不同菌株純種制成的12個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，表明不同菌株之間乙偶姻產(chǎn)量存在很大差異，也表明菌株不同對(duì)乙偶姻產(chǎn)量有很大影響，故本方法也為篩選高產(chǎn)乙偶姻菌株奠定了一定的檢測(cè)方法基礎(chǔ)。