酶解核桃蛋白制備降血壓肽的工藝優(yōu)化

裴璞花，安傳相，劉曉燕，馬立志，*，陳鴻申

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005；3.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550005；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

高血壓是指在靜息狀態(tài)下或未服用降壓藥物，動脈收縮壓或舒張壓升高為特征的“心血管綜合癥”，被世界公認(rèn)為是人類健康“無形殺手”，近些年來，隨著經(jīng)濟(jì)的飛速增長發(fā)病率也在逐年遞增且呈現(xiàn)年輕化[1-2]。高血壓易引起患者中風(fēng)及心腦、腎等器官的損害[3]。因此對高血壓的預(yù)防和治療，是全球人民勢在必行的任務(wù)[4-5]。

降血壓肽又稱血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制肽。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是一種含鋅元素的二肽-羧肽酶，又叫作羧基二肽酶，在調(diào)節(jié)血壓中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。它一般是利用蛋白酶水解而獲得的，對高血壓患者具有獨(dú)特的降壓效果，而對血壓正常的人群無降壓作用，因此不會出現(xiàn)降壓過度的現(xiàn)象，安全性是極高的[7]。

眾所周知，核桃蛋白是一種極為優(yōu)質(zhì)的蛋白。其含有18種氨基酸，并且包括了人體所必需的8種氨基酸，且谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、組氨酸等含量相對較高[8-9]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，人體攝取蛋白質(zhì)經(jīng)消化作用后，是以小分子肽的形式吸收，而不是主要以氨基酸分子形式吸收[10]。另外，有些肽不僅能夠提供人體生長和發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時還兼具降低血壓的作用。但是，目前我國大部分地區(qū)核桃粕被作為飼料和肥料使用，產(chǎn)生極大的浪費(fèi)[11]。本研究是以壓榨去油后的核桃粕為原料，用堿性蛋白酶酶解，采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳酶解條件，得到優(yōu)質(zhì)的核桃降血壓肽。同時也期望為核桃蛋白的深加工以及大規(guī)模生產(chǎn)提供有效的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

核桃蛋白：貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院食品分析與研究實(shí)驗室制備。堿性蛋白酶（20×104U/g）：Ruiaibio公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）：美國Sigma公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Malonyl-histidylleucine，HHL）：美國Sigma公司；四甲基乙二胺（Tetramethylethylenediamine，TEMED）：Ruiaibio公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris aminomethane）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸（Glycine）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecylsulfate）、巰基乙醇、甘油（Glycerol）、溴酚藍(lán)（Bromophenol）、丙烯酰胺（Acrylamide）、過硫酸胺：Ruiaibio公司。

1.1.2 儀器

FA2104萬分之一電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；PHB-4雷磁牌數(shù)字型PH計：上海精科雷磁公司；GL-88B漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗設(shè)備有限公司；DL-5-B飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；FD-1B-50真空冷凍干燥機(jī)：南京杰全微波設(shè)備有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計：日本島津儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 核桃降壓肽的制備

稱取適量的核桃蛋白配制成一定濃度的核桃蛋白溶液，依照酶解條件進(jìn)行試驗。在酶解的過程中連續(xù)滴加0.5mol/L的NaOH溶液，維持pH值穩(wěn)定。酶解2 h后，在 90℃水浴中滅酶 10 min，離心（4 000 r/min）20 min后，將沉淀棄去，保留上清酶解液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，進(jìn)行真空冷凍干燥，即可得到核桃降壓肽。

1.2.2 ACE抑制率體外檢測方法[12]

按表1操作后，經(jīng)漩渦混合器振蕩15 s混勻后進(jìn)行離心（4 000 r/min）20 min后，用移液吸嘴移取1.0 mL乙酸乙酯放置于試管中，在120℃的恒溫干燥箱中烘干，再將3 mL的去離子水中添加至烘干的試管中，使其充分溶解后在波長228 nm處測定其吸光度，計算公式為：

式中：A樣品為反應(yīng)中酶解液和ACE同時存在的吸光度；A對照為反應(yīng)中未加樣品液的吸光度，即對照；A空白為ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。

1.2.3 單因素試驗

選擇不同酶解溫度、pH值、加酶量及底物濃度進(jìn)行單因素試驗，探究各因素對核桃降壓肽ACE抑制率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法分析

運(yùn)用Design-Expert8.0軟件程序中的 Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選取酶解溫度、pH值、加酶量、底物濃度進(jìn)行四因素三水平試驗，對核桃降壓肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗的結(jié)果上，自變量的試驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼（見表2），共設(shè)計29個試驗點(diǎn)，以ACE抑制率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗。

表1 ACE抑制率體外檢測方法Table1 Composition ofreaction system for determining ACE inhibition ratio

表2 因素水平編碼表Table2 Factors and levels

表3 凝膠配制表Table3 Gel preparation table mL

1.2.5 驗證性試驗

在響應(yīng)面優(yōu)化的試驗條件下，進(jìn)行3次平行的驗證性試驗，與理論預(yù)測值相比較，以驗證優(yōu)化結(jié)果。

1.2.6 分子量的測定

采用十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfonate polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[13]。

1）電極緩沖液：稱取3 g三羥甲基氨基甲烷（Tris aminomethane），14.4 g 甘氨酸，1 g 十二烷基磺酸鈉（sodium dodecylsulfonate，SDS）依次溶于重蒸水中，定容至100 mL，使用時再稀釋10倍。

2）樣品緩沖液：量取1 mol/L Tris aminomethane（pH 6.8）2.5 mL，巰基乙醇 1.0 mL，10%SDS 2 mL，甘油2 mL，0.1%溴酚藍(lán)1.0 mL，重蒸水3.5 mL，混勻。

3）脫色液：甲醇，冰醋酸，重蒸水按 3 ∶1 ∶6（體積比）配制。

4）分離膠、濃縮膠按表3配制。

1.2.7 超濾分離

采用超濾分離設(shè)備對酶解液進(jìn)行超濾分離，使用分子量分別為10 kDa和3 kDa的濾膜。在室溫操作條件下，得到分子量大于 10 kDa，10 kDa～3 kDa，小于 3 kDa的酶解液組分，并測定ACE的抑制率和IC50值。

1.2.8 各組分IC50值的測定

稱取一定質(zhì)量的各組分樣品分別配成不同質(zhì)量濃度的溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，ACE抑制活性為縱坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線回歸方程計算出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對ACE抑制率的影響

在酶解pH 9.0、加酶量6 000 U/g，底物濃度2%的酶條件下，根據(jù)堿性蛋白酶的最適溫度50℃～60℃之間。酶解溫度選擇40℃～65℃，探究在這個溫度段下，核桃酶解液ACE抑制率的變化。結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，在一定溫度范圍內(nèi)，ACE抑制率隨著酶解溫度的升高而增高，當(dāng)溫度為50℃時，ACE抑制率達(dá)到54.12%。酶解溫度繼續(xù)升高，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而酶失活使酶活力降低，ACE抑制率也隨之降低。

2.1.2 酶解pH值對ACE抑制率的影響

在酶解溫度50℃，加酶量6 000 U/g，底物濃度2%的酶解條件下，酶解pH選擇8～10，探究在這個pH值段下，核桃酶解液ACE抑制率的變化。結(jié)果如圖2所示。

圖1 酶解溫度對ACE抑制率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibition

圖2 酶解pH值對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibition

從圖2可知，在一定的pH值范圍內(nèi)，核桃蛋白酶解液的ACE抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)pH值為9.0時ACE抑制率最高，達(dá)到55.31%，隨著pH值繼續(xù)升高，ACE抑制率下降。是因為pH值過高使得酶失活進(jìn)而影響酶的作用效果。

2.1.3 加酶量對ACE抑制率的影響

在酶解pH 9.0、溫度50℃、底物濃度2%，分別研究了加酶量5 000 U/g～10 000 U/g的酶解效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加酶量對ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis addition on ACE inhibition

從圖3可知，隨著酶量的增加，ACE抑制率也在增加，當(dāng)加酶量為7 000 U/g時，ACE的抑制率為57.23%。當(dāng)加酶量高于7 000 U/g時，ACE抑制率趨于平緩?？赡苡捎诿笣舛容^低時，酶分子所能結(jié)合的底物少，而酶量增加后，酶分子所能結(jié)合的底物增加，ACE抑制率增大；而過量的蛋白酶沒有底物相結(jié)合，使ACE抑制率變化不大，最有可能是多余的蛋白酶，把部分具有ACE抑制活性的小肽被降解為活性更小的肽或者氨基酸，從而降低對ACE抑制性[14]。

2.1.4 底物濃度對ACE抑制率的影響

在酶解pH 9.0、溫度50℃、加酶量6 000 U/g，分別考察了底物濃度為1%～6%的酶解效果，結(jié)果如圖4所示。

圖4 底物濃度對ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of substrate concentrations on ACE inhibition

由圖4可以看出，隨著底物濃度的增加，酶解液ACE抑制率先呈現(xiàn)上升的趨勢而后又下降。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時，抑制率可達(dá)到55.98%。在一定濃度范圍內(nèi)，底物與蛋白酶能夠充分的結(jié)合，使ACE抑制率升高，但是底物濃度過高時，造成水解液黏度變大，阻礙了酶的擴(kuò)散，對反應(yīng)有抑制作用，但是過低的底物濃度，使酶解液體積增大，后續(xù)工作量也會加大[15]。

2.2 響應(yīng)面模型的建立

Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Table4 The results of Box-Behnken response surface design

續(xù)表4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果Continue table 4 The results of Box-Behnken response surface design

采用響應(yīng)曲面統(tǒng)計方法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，建立ACE抑制率與酶解pH、酶解溫度、加酶量和底物濃度的四因子的數(shù)學(xué)二次多項回歸方程：

響應(yīng)曲面數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗方差分析Table5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

續(xù)表5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗方差分析Continue table 5 Analysis of variance of Box-Behnken response surface design

表5分析結(jié)果顯示，方程模型的P＜0.000 1，表明該方程模型極顯著。模型失擬項P=0.064＞0.05，差異不顯著，表明響應(yīng)面試驗結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好。因此，可以使用該數(shù)學(xué)模型對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。一次項中D影響極顯著（P＜0.000 1）、交互項中AB影響顯著（P=0.039 9＜0.05），二次項中 A2、B2、C2、D2均極顯著（P＜0.000 1）。各因素對核桃酶解液ACE抑制率的影響由大到小依次為 D＞C＞A＞B。

響應(yīng)面分析圖見圖5～圖10。

圖5 Y=（fA，B）的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of Y=f（A，B）

圖6 Y=f（A，C）的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of Y=f（A，C）

圖7 Y=f（A，D）的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of Y=f（A，D）

圖8 Y=（fB，C）的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of Y=f（B，C）

圖9 Y=f（B，D）的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of Y=f（B，D）

圖10 Y=f（D，C）的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of Y=f（D，C）

由圖5～圖10的響應(yīng)面分析，除了AB交互項水解度的影響顯著，其余交互項對酶解液ACE抑制率的影響都不顯著。由方程分析預(yù)測得到最佳條件組合為：溫度 55℃、pH 9.03、加酶量 7 299.03 U/g底物、底物濃度2.71%。此時，模型預(yù)測的核桃蛋白酶解液ACE的抑制率為59.71%。

2.3 驗證試驗

為驗證響應(yīng)面優(yōu)化法所得的結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述條件進(jìn)行核桃降血壓肽的制備，但考慮到實(shí)際操作的簡便性，將參數(shù)修正為溫度55℃、pH 9.0、加酶量7 300 U/g底物、底物濃度2.7%。進(jìn)行3組平行試驗，此時核桃蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率的平均值為60.23%，與模型預(yù)測值的相接近。說明該模型能夠較好地預(yù)測實(shí)際核桃蛋白酶解液ACE抑制率情況。

2.4 酶解液分子量分布的測定結(jié)果

核桃蛋白酶解物的凝膠電泳圖見圖11。

圖11 核桃蛋白酶解物的SDS-PAGEFig.11 SDS-PAGE of the hydrolysate of walnut protease

參照標(biāo)準(zhǔn)Marker蛋白，核桃蛋白的分子量主要在60 kDa以內(nèi)，核桃蛋白酶解物分子量主要分布在35 kDa以下。

2.5 超濾分離組分抑制率的IC50值比較

表6為超濾分離試驗不同組分的ACE抑制活性和IC50測定結(jié)果。

表6 超濾分離組分抑制率的IC50值比較Table6 Comparison of the IC50value of the inhibitory rate of ultrafiltration separation components

由表6可以看出，經(jīng)過超濾分離，分子量越小的組分IC50值越低，其ACE抑制活性越高。小于3 kDa超濾液的IC50值比 3 kDa～10 KDa超濾液降低了0.6046mg/mL，比原酶解液IC50值降低了2.1885mg/mL。這也初步說明具有ACE抑制活性的核桃蛋白肽分子量在3 kDa以下。

3 結(jié)論

基于單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法對核桃蛋白酶解進(jìn)行優(yōu)化。將優(yōu)化所得最佳酶解條件調(diào)整為：溫度55℃、pH 9.0、加酶量7 300 U/g底物、底物濃度2.7%，在此工藝條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗證性試驗，實(shí)際測得核桃蛋白酶解產(chǎn)物的ACE抑制率的平均值為60.23%。經(jīng)超濾分離得到小于3 kDa核桃降血壓肽的的IC50值最低為0.389 3 mg/mL，其ACE抑制活性最高。本研究為酶法制備降血壓肽提供理論依據(jù)，并為核桃蛋白進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)踐基礎(chǔ)。