人工培育蟬花孢梗束分級(jí)多糖的抗氧化活性及對(duì)果蠅壽命的影響

邵穎，陳安徽，趙節(jié)昌，陳尚龍，巫永華，任格，孫穎

（1.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院，江蘇徐州221111；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111）

蟬花是蟲草屬半知菌類或有絲分裂孢子真菌，是具有保健功能的大型藥食兩用真菌，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蟬花中富含多糖、核苷、蟲草酸、麥角甾醇、多球殼菌素等活性成分[3-7]，具有增強(qiáng)免疫、抗癌、抗疲勞、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、改善腎臟功能、抗衰老等多種藥理功能[8-13]。何曉波等[14]發(fā)現(xiàn)金蟬花總多糖能顯著刺激Con A和LPS誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞增殖，并促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞IgG抗體的生成；陳柏坤等[15]利用體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了蟬花孢梗束多糖具有抑制白血病細(xì)胞株U937、K562增殖的效果；另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)蟬花孢梗束多糖對(duì)大鼠細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用[16-18]。于士軍等[19]還發(fā)現(xiàn)蟬花孢梗束粗多糖具有特定的抗氧化及延緩果蠅衰老的功效。蟬花多糖作為蟬花的主要活性成分，且因其在抗癌防衰、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等方面的作用已成為醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域研究和關(guān)注的焦點(diǎn)。

雖然廣大學(xué)者在關(guān)于蟬花孢梗束粗多糖的生物活性研究中作了廣泛的工作，但是有關(guān)蟬花孢梗束分級(jí)多糖抗氧化及延壽抗衰活性的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道。本研究利用水提醇沉法對(duì)蟬花孢梗束進(jìn)行分級(jí)醇沉，并對(duì)分級(jí)醇沉多糖進(jìn)行系統(tǒng)的體外抗氧化活性檢；以黑腹果蠅為受試對(duì)象研究了蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命及體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的影響，以期為蟬花在保健食品、保健品、藥品等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供試驗(yàn)證據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

蟬花孢梗束：徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室自行栽培。

1.1.2 儀器設(shè)備和試劑

TUMEN TL-15高速離心機(jī)：吉林圖們離心機(jī)廠；梅特勒AE200型電子天平：上海分析儀器廠；SENCO R-502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申勝生物技術(shù)公司；HH-4數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器有限公司；MDF594超低溫冰箱：日本SANYO電子有限公司；101-1ES電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國 sigma公司；95%乙醇、無水乙醇：徐州師范大學(xué)科技開發(fā)總公司化工廠；菲啰嗪（Ferrozine）：上海市源葉生物科技有限公司；乙二胺四乙酸鈉：天津市鼎盛鑫化工有限公司；鐵氰化鉀：上海生工生物試劑有限公司；苯酚、濃硫酸、三氯甲烷：無錫市亞盛化工有限公司；考馬斯亮藍(lán)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；SOD試劑盒、MDA試劑盒：南京建成生物工程公司。

1.2 研究方法

1.2.1 蟬花孢梗束分級(jí)多糖的提取

蟬花孢梗束粉碎過40目篩，以料液比1∶20（g/mL）的比例加入蒸餾水于90℃恒溫水浴鍋內(nèi)水浴浸提2 h，4 000 r/min離心10 min收集上清液，殘?jiān)侔凑丈鲜龇椒ń?次，收集兩次浸提的上清液并減壓濃縮至原浸提液總體積的1/5左右備用。

向上述濃縮后的浸提液中加入95%的乙醇，并調(diào)整溶液中乙醇終濃度至20%，溶液置于4℃冰箱靜置24小時(shí)后于4 000 r/min離心10 min，收集上清液和沉淀。沉淀使用乙醚和丙酮洗滌3次后冷凍干燥得到20%分級(jí)多糖樣品，樣品標(biāo)記為P20并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。上清液中繼續(xù)加入95%乙醇，調(diào)整上清液中乙醇終濃度逐漸分別達(dá)到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，并于4℃冰箱靜置24小時(shí)后于4 000 r/min離心10 min，沉淀使用乙醚和丙酮洗滌3次后冷凍干燥分別得到30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%分級(jí)多糖樣品，分別標(biāo)記為P30、P40、P50、P60、P70、P80、P90，各分級(jí)多糖于 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蟬花孢梗束分級(jí)多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.2.1 還原力的測(cè)定

將分級(jí)多糖樣品配制成1.5 g/L的多糖溶液并按梯度稀釋至不同的質(zhì)量濃度（0.02 g/L～1.5 g/L）。量取不同質(zhì)量濃度的樣液2 mL，分別加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸緩沖液2 mL，再加入1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，振蕩搖勻，然后于50℃水浴20 min后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后以3 000 r/min離心10 min。離心后吸取2 mL上清液，再加2 mL去離子水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液，振蕩搖勻后再于50℃條件水浴保溫10 min，當(dāng)體系溶液的顏色由黃色變成藍(lán)色時(shí)，于700 nm測(cè)定其吸光值A(chǔ)700，還原能力則隨樣品吸光度的增大而增強(qiáng)?？瞻讓?duì)照使用蒸餾水代替樣品，稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.02 g/L～0.1 g/L）的VC作為陽性對(duì)照。

1.2.2.2 DPPH自由基清除活性測(cè)定

將分級(jí)多糖樣品配制成1 g/L的多糖溶液并按梯度稀釋至不同的質(zhì)量濃度（0.01 g/L～1 g/L）。分別量取各樣品溶液1.5 mL，加入0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液1.5 mL，充分混勻，在室溫下避光靜置30 min，并測(cè)定517 nm處的吸光值。以稀釋成不同質(zhì)量濃度（0.01 g/L～0.5 g/L）的 VC作陽性對(duì)照。

DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ac為對(duì)照組吸光度，1.5 mL蒸餾水加1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液；Ai為樣品組吸光度，1.5 mL樣品液加1.5 mL 0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液；Aj為空白組吸光度，1.5 mL樣品液加1.5 mL 95%乙醇。

1.2.2.3 鐵離子螯合能力測(cè)定

各分級(jí)多糖配制成8 g/L的多糖溶液并按梯度稀釋至不同的質(zhì)量濃度（0.5 g/L～8 g/L）。量取不同質(zhì)量濃度（0.5 g/L～8 g/L）的樣品溶液 2 mL，加入 2 mmol/L 的氯化亞鐵溶液0.1 mL，然后再加入2 mmol/L菲咯嗪（Ferrozine）0.2 mL，混勻后在室溫下靜置10 min，最后加入等體積的去離子水并于562 nm測(cè)定吸光度。以去離子水作空白調(diào)零。吸光度越低則表明鐵離子鰲合能力越強(qiáng)。以去離子水代替樣品作為空白對(duì)照，以稀釋至不同質(zhì)量濃度（0.1 g/L～3 g/L）的EDTA作為陽性對(duì)照。

按照下列公式計(jì)算各分級(jí)多糖的鐵離子鰲合能力：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度；A1為加有樣品或者陽性對(duì)照后的吸光度。

1.2.3 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命的測(cè)定

以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按照1%的比例添加不同分級(jí)多糖樣品飼喂的果蠅為實(shí)驗(yàn)組，以不添加多糖僅以基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼喂的果蠅為對(duì)照組（CK）。選取8 h內(nèi)孵化的果蠅，乙醚麻醉并鑒定性別后選取大小均一的個(gè)體于斜面試管中進(jìn)行飼喂，每只試管放10只果蠅，每個(gè)樣品雌雄果蠅各設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將各組果蠅置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察并記錄果蠅的存活情況，統(tǒng)計(jì)果蠅半數(shù)死亡時(shí)間、最高壽命和平均壽命。

1.2.4 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅體內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響

1.2.4.1 果蠅組織勻漿的制備

參照張明等[20]的方法進(jìn)行。

1.2.4.2 果蠅組織中可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取1%果蠅組織勻漿液經(jīng)適當(dāng)稀釋后于595 nm測(cè)定吸光值，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.000 5x+0.025 2，R2=0.990 7。

1.2.4.3 果蠅體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活力的測(cè)定

按照試劑盒使用說明操作。取50 μL果蠅組織勻漿測(cè)定SOD活力，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按照下列公式計(jì)算SOD活力。

1.2.4.4 果蠅體內(nèi)丙二醛（MDA）含量的測(cè)定

按照試劑盒使用說明操作。取100 μL果蠅組織勻漿測(cè)定MDA含量，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按照下列公式計(jì)算MDA含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用DPS7.05處理軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花孢梗束分級(jí)多糖的體外抗氧化活性

2.1.1 蟬花孢梗束分級(jí)多糖的還原力

還原力是檢測(cè)蟬花孢梗束分級(jí)多糖抗氧化能力的重要指標(biāo)，可以根據(jù)吸光度的變化直觀地反映抗氧化能力的大小。根據(jù)1.2.2.1的方法測(cè)定了各分級(jí)多糖樣品的還原能力，具體結(jié)果如圖1所示。

圖1 蟬花孢梗束分級(jí)多糖樣品的還原力Fig.1 Reducing power of rating polysaccharides from fruiting body of Cordyceps cicade

由圖1可知，除P50外，蟬花孢梗束其他分級(jí)多糖的還原能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增加。P50樣品在0.1 mg/mL～0.5 mg/mL濃度范圍時(shí)吸光度增長明顯，但是隨著多糖樣品濃度的增長其吸光度卻顯著降低。在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，P60、P30和P70均表現(xiàn)出了較好的還原能力，在質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時(shí)，P60樣品的吸光值達(dá)到了1.053 3。蟬花孢梗束分級(jí)多糖樣品的還原能力雖不及陽性對(duì)照VC，但都顯示了還原能力。

2.1.2 蟬花孢梗束分級(jí)多糖的DPPH自由基清除能力

根據(jù)1.2.2.2的方法測(cè)定了蟬花孢梗束各分級(jí)多糖的DPPH自由基清除活性，具體的結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，蟬花孢梗束各分級(jí)多糖樣品均具有DPPH自由基清除活性，但效果沒有陽性對(duì)照VC明顯。隨著分級(jí)多糖樣品質(zhì)量濃度的增加，除P30樣品外其他樣品的自由基清除活性均呈增強(qiáng)趨勢(shì)，呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。P30樣品在質(zhì)量濃度低于0.6 mg/mL時(shí)自由基清除率隨樣品濃度的增加而升高，但超過該濃度DPPH自由基清除活性反而明顯降低了。從圖中可看出，P60、P40和P70多糖樣品的自由基清除活性較好，其EC50值分別為0.326、0.278、0.385 mg/mL。

2.1.3 蟬花孢梗束分級(jí)多糖的鐵離子螯合能力

鐵離子是人體內(nèi)必需的微量元素，但也會(huì)引起脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生相應(yīng)的自由基，所以鐵離子螯合率被看作是一種重要的抗氧化指標(biāo)。根據(jù)1.2.2.3的方法對(duì)蟬花孢梗束分級(jí)多糖樣品的鐵離子螯合能力進(jìn)行了測(cè)定，具體結(jié)果由圖3所示。

圖2 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of rating polysaccharides from fruiting body of Cordyceps cicade on DPPH radicals

圖3 蟬花孢梗束分級(jí)多糖的鐵離子螯合能力Fig.3 Chelating ability of rating polysaccharides from fruiting body of Cordyceps cicade on ferrous ions

由圖3可知，蟬花孢梗束分級(jí)多糖樣品的鐵離子螯合率均隨樣品濃度的增加而增加。所有樣品中P60的鐵離子螯合能力最為突出，在其濃度為2 mg/mL時(shí)鐵離子螯合率已達(dá)到（59.8±3.12）%，而且隨著樣品濃度的增加其螯合率仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其次，P70和P80多糖樣品的鐵離子螯合能力也較好，在濃度為6 mg/mL時(shí)，兩樣品的鐵離子螯合率分別為（60.12±4.36）%和（58.77±1.32）%。雖然各多糖樣品均顯示了鐵離子的螯合能力，但是螯合能力沒有陽性對(duì)照EDTA強(qiáng)。

2.2 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命的影響

將蟬花孢梗束分級(jí)多糖按照1%的比例添加到果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基，僅以基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼喂的果蠅為對(duì)照考察了蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命的影響。具體結(jié)果如表1所示。

由表1可知，各試驗(yàn)組果蠅平均壽命雖然在數(shù)值上高于對(duì)照組但未達(dá)到顯著水平。與對(duì)照組相比，P60和P70多糖樣品顯著提高了雄性果蠅的半數(shù)死亡時(shí)間和最高壽命（p<0.05），半數(shù)死亡時(shí)間分別比對(duì)照組提高了15.19%和7.60%；最高壽命分別比對(duì)照組提高了20.32%和18.71%。對(duì)于雌果蠅來說，分級(jí)多糖P50、P60試驗(yàn)組的半數(shù)死亡時(shí)間顯著高于對(duì)照組（p<0.05），比對(duì)照組分別提高了7.02%和9.00%；P50、P60和P80則顯著提高了雌果蠅的最高壽命，分別比對(duì)照組提高了16.68%、25%和16.68%。說明蟬花孢梗束的部分分級(jí)多糖具有延長果蠅壽命的作用，綜合比較各分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命的影響發(fā)現(xiàn)分級(jí)多糖P60的延壽效果最為顯著。

表1 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命的影響Table1 The effect of rating polysaccharides of fruiting body of Cordyceps Cicade on lifespan of Drosophila Melanogaster

2.3 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅SOD活性及MDA含量的影響

將蟬花孢梗束分級(jí)多糖按照1%的比例添加到果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基飼喂果蠅20 d，以僅飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基的果蠅為對(duì)照，考察了蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅SOD活性及MDA含量的影響。具體結(jié)果如表2所示。

表2 蟬花孢梗束分級(jí)多糖對(duì)果蠅SOD活性及MDA含量的影響Table2 The effect of rating polysaccharides of fruiting body of Cordyceps Cicadae on activity of SOD and content of MDA in Drosophila Melanogaster

由表2可知，分級(jí)多糖P60、P70顯著提高了雄性果蠅體內(nèi)的SOD活力（p<0.05），比對(duì)照組分別提高了23.58%和18.90%，P60多糖組雌性果蠅體內(nèi)的SOD活力與對(duì)照組相比提高了28.21%且與其他組間的差異達(dá)到了顯著水平（p<0.05）。在降低果蠅體內(nèi)MDA含量方面，P70和P90分級(jí)多糖對(duì)雄性果蠅的效果最好，其次是P60和P30；雌性果蠅各組間體內(nèi)MDA含量均無顯著性差異，但P60組果蠅體內(nèi)的MDA含量最低。說明蟬花孢梗束分級(jí)多糖能夠提高果蠅體內(nèi)SOD活力和降低MDA含量，其中P60分級(jí)多糖的綜合效果最好。

3 結(jié)論

中醫(yī)認(rèn)為蟬花是一種功效與冬蟲夏草近似的珍貴中藥材，文獻(xiàn)記載蟬花味甘、性寒、具疏散風(fēng)熱、定驚解痙之功效[21]。蟬花孢梗束即蟬花子實(shí)體，蟬花多糖作為蟬花的一種主要活性成分已成為諸多研究者的研究熱點(diǎn)。

本研究采用DPPH自由基清除活性、還原力和鐵離子螯合能力分析了蟬花孢梗束分級(jí)多糖的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)各分級(jí)多糖均具有體外抗氧化活性，自由基清除能力分別為P40＞P60＞P70，分級(jí)多糖P60、P70、P30 的還原能力較其他多糖強(qiáng)，P60、P70、P80 鐵離子的螯合能力較強(qiáng)；至于分級(jí)多糖對(duì)果蠅壽命和體內(nèi)SOD活力、MDA含量的影響，P60分級(jí)多糖可顯著提高雌雄果蠅的平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間、最高壽命（p＜0.05）及果蠅體內(nèi) SOD 酶的活力（p＜0.05），P70、P90分級(jí)多糖顯著降低了雄果蠅體內(nèi)MDA的含量（p＜0.05），除P70和P90外P60多糖的效果也較好，各分級(jí)多糖對(duì)雌果蠅體內(nèi)MDA含量的影響差異雖不顯著但均低于空白對(duì)照組。綜合評(píng)價(jià)各分級(jí)多糖的功效，P60分級(jí)多糖的體外抗氧化活性及對(duì)果蠅壽命及抗衰的效果最為突出。各分級(jí)多糖在體外抗氧化活性及延壽抗衰功效方面的表現(xiàn)為蟬花孢梗束多糖在抗衰、延壽類功能食品、保健品甚至化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了試驗(yàn)證據(jù)，至于蟬花孢梗束延壽抗衰功效多糖的進(jìn)一步分離純化及機(jī)理研究值得做深入探討。