脾多肽對(duì)非霍奇金淋巴瘤患者漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞功能及成熟的影響

凡治國,李志平,崔東海,任　超

(安陽市腫瘤醫(yī)院普內(nèi)科，河南 安陽 455000)

非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma, NHL)是一種發(fā)生于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，B細(xì)胞來源者占85%以上，在惡性淋巴瘤中NHL所占的比例遠(yuǎn)高于霍奇金病[1]。青壯年人群是NHL的高發(fā)人群，近年來的流行病學(xué)資料顯示其發(fā)病率和病死率逐年上升[2]。雖然放、化療技術(shù)取得很大的發(fā)展，但由于NHL臨床特征變化多樣，病理類型又非常繁雜，故臨床治療仍存在很多難題[3-4]。免疫功能缺陷是NHL發(fā)病的高危因素之一，免疫調(diào)節(jié)異?？赡茉贜HL的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是體內(nèi)專職性抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)，不僅激活初始型T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而且能啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，受細(xì)菌、病毒的刺激時(shí)產(chǎn)生一定數(shù)量的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)，并逐漸向樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)分化，在機(jī)體免疫中起重要作用[5-6]。以DC為基礎(chǔ)的主動(dòng)免疫治療在腫瘤治療中受到人們重視，也成了目前研究的熱點(diǎn)。脾多肽是由多肽、游離氨基酸、核酸和總糖組成的一種激活及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物，對(duì)機(jī)體免疫有雙向調(diào)節(jié)作用，具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗腫瘤及提高骨髓造血功能等作用。目前尚沒有關(guān)于脾多肽對(duì)NHL患者pDC功能及成熟的影響的報(bào)道，本研究采用流式細(xì)胞儀分選pDC，用不同濃度的脾多肽刺激pDC，觀察脾多肽對(duì)外周血來源的pDC功能及成熟的影響，以期為NHL免疫治療提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2015年6月至2016年10月我院收治的35例NHL患者作為研究對(duì)象，所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NHL，并處于緩解期。其中男19例，女16例；年齡15～59(30.45±12.57)歲；Ann Arbor分期：Ⅰa期8例，Ⅱa期12例，Ⅱb期7例，Ⅲa期4例，Ⅲb期2例，Ⅳa期2例。對(duì)照組為同期體檢健康志愿者，男20例，女15例；年齡18～60(35.5±11.5)歲。

1.2儀器與試劑FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；JSM6510掃描電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)；JXP15型光學(xué)顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠)；Bio-Rad Model 680酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。脾多肽注射液(吉林豐生制藥有限公司，商品名：澳蓮，批號(hào)：15021021)；干擾素-α(interferon-α，IFN-α)、TNF-α、IL-6的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒均購自上海滬鼎生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、PBS購自上海哈靈生物科技有限公司；熒光標(biāo)志的單克隆抗體CD4-FITC、CD123-FE、CD11c- FITC、CD86-APC、BDCA-2-APC、CD80-PeCy5及同型對(duì)照IgG1FITC/IgG1-PC5購自美國BD公司。

1.3方法收集NHL患者和對(duì)照組患者外周血各2 mL, 放入EDTA-K2抗凝管中，離心(2 000 r·min-1，20 min)，收集單個(gè)核細(xì)胞，保存在-196 ℃液氮中待測。

1.3.1pDC分選和脾多肽刺激將冷凍的單個(gè)核細(xì)胞解凍，依次加入適量的CD4-FITC、BDCA-2-APC、CD123-FE單抗，混合均勻后，應(yīng)用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀分選，分選后的pDC存活率為96.5%，純度為96.1%。使用PBS調(diào)整分選后pDC密度至1×104·mL-1，然后接種在潔凈的24孔平底培養(yǎng)板上，將配制好濃度為0、50、100、200 mg·L-1的脾多肽注射液分別加入到每組中，應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱37 ℃條件下孵育24 h，將每孔中的上清液收集起來，-20 ℃保存，待測。

1.3.2pDC形態(tài)觀察應(yīng)用不同濃度脾多肽注射液刺激5 d后，將收集的上清液每個(gè)濃度組各取少部分染色，光鏡下觀察形態(tài)，然后在掃描電鏡下觀察。

1.3.3外周血pDC檢測取一支分選出的pDC，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至1×106·L-1，接種在48孔培養(yǎng)板(500 μL/孔)中，每孔中加入6 μmol·L-1的PBS，體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度孵箱中37 ℃條件下孵育24 h，收集上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定各組IFN-α、TNF-α、IL-6水平。

1.3.4pDC的表型檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測pDC的表型，操作如下：1)不同濃度脾多肽注射液刺激5 d后的pDC，每種濃度各1管；2)用PBS沖洗2遍；3)在4 ℃條件下用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清封閉細(xì)胞表面抗體15 min；4)加PBS調(diào)密度至1×103·mL-1；5)取細(xì)胞懸液100 μL，加入CD11c-FITC、CD86-APC、BDCA-2-APC、CD80-PeCy5單抗各20 μL；6)4 ℃培育30 min；7)上機(jī)檢測。

2　結(jié)果

2.1不同濃度脾多肽處理后pDC形態(tài)變化分析不同濃度的脾多肽處理5 d后，光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)pDC的表面突起逐漸明顯，隨著脾多肽濃度的增加，突起明顯變長呈成熟特征，表明脾多肽可以促進(jìn)pDC的成熟并向DC分化。見圖1、2。

圖1　不同濃度脾多肽處理5 d后pDC形態(tài)變化(HE，×1 000)

圖2　不同濃度脾多肽處理5 d后pDC形態(tài)的電鏡圖片

2.2不同濃度脾多肽處理后pDC上清液IFN-α、TNF-α、IL-6表達(dá)各濃度脾多肽組pDC上清液中IFN-α、TNF-α、IL-6水平均較脾多肽0 mg·L-1組有明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著脾多肽濃度的增加而上升明顯，各濃度脾多肽組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　不同濃度脾多肽處理后pDC上清液IFN-α、TNF-α、IL-6表達(dá)　ng·L-1

注：各組兩兩比較，P<0.05

2.3不同濃度脾多肽處理后pDC的表型各濃度脾多肽組pDC細(xì)胞的CD11c、CD80、CD86表達(dá)陽性率均較脾多肽0 mg·L-1組有明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著脾多肽濃度的增加而上升明顯，各濃度脾多肽組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　不同濃度脾多肽處理后pDC的表型變化

注：各組兩兩比較，P<0.05

3　討論

NHL是常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年增高趨勢[2,7]。該病臨床特征變化多樣，病因、病理和治療都存在較大差異，迄今臨床治愈率仍非常低，一直是位于我國腫瘤發(fā)病率和致死率排行榜前10位的疾病，已成為醫(yī)學(xué)上一大難題[8]。既往的研究[9-10]發(fā)現(xiàn)NHL的發(fā)病與病毒感染、化學(xué)物質(zhì)及放射性物質(zhì)等密切相關(guān)。最近的研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，免疫功能缺陷是NHL發(fā)病的高危因素之一，免疫調(diào)節(jié)異?？赡茉贜HL疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。DC是目前已知最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，在免疫應(yīng)答、調(diào)控上起核心作用，隨著對(duì)DC研究的不斷深入，一些pDC體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖嗬^建立，以DC為基礎(chǔ)的主動(dòng)免疫治療在腫瘤治療中受到人們重視，也成了目前研究的熱點(diǎn)。

有報(bào)道稱DC腫瘤疫苗已開始進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)，并且取得了可喜的效果[13]。Blank等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在IFN-α、IFN-β、TNF-α等刺激下，DC會(huì)上調(diào)PD-L1的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。DC主要有2個(gè)亞型，mDC和pDC，其中pDC是啟動(dòng)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，pDC不僅激活初始型T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而且能啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，在機(jī)體免疫中起重要作用。pDC在細(xì)菌、病毒的刺激下產(chǎn)生一定數(shù)量的TNF-α、IL-6,然后在IL-3刺激下逐漸成熟，向DC分化。IFN-α可以分泌抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子，增加巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的生存和NK細(xì)胞活性[7,9,15]。而TNF-α不僅可以促進(jìn)DC的成熟，同時(shí)還可誘導(dǎo)pDC向成熟的DC分化。IL-6聯(lián)合IFN-α可以促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，這種漿細(xì)胞可以分泌抗體從而增加免疫球蛋白的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力[1,16]。本研究結(jié)果顯示，各濃度脾多肽組pDC上清液中IFN-α、TNF-α、IL-6水平均較脾多肽0 mg·L-1組有明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著脾多肽濃度的增加而上升明顯，各濃度脾多肽組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明脾多肽可以促進(jìn)pDC向DC分化，提高其分泌IFN-α，TNF-α、IL-6的量。光鏡和電鏡下觀察，經(jīng)不同濃度的脾多肽處理后，pDC的表面突起逐漸明顯，隨著脾多肽濃度的增加，突起明顯變長呈成熟特征。pDC的表型檢測結(jié)果顯示，脾多肽能顯著提高pDC細(xì)胞CD11c、CD80、CD86表達(dá)的陽性率，進(jìn)一步說明脾多肽可促進(jìn)pDC成熟、分化，同時(shí)可以看出，pDC具有提高同種異基因型淋巴細(xì)胞增殖的能力，由于pDC不具有TLR4受體，所以同數(shù)量下對(duì)同種異基因型淋巴細(xì)胞增殖的能力低于mDC。提示脾多肽可以促進(jìn)pDC成熟及向DC分化，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫，提高抵抗力的目的。

脾多肽是由多肽、游離氨基酸、核酸和總糖組成的一種激活及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的藥物，具有調(diào)節(jié)免疫、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗腫瘤及提高骨髓造血功能等作用。可用于化療引起的白血病、淋巴瘤、白細(xì)胞減少及再生障礙性貧血的輔助治療。脾多肽對(duì)機(jī)體免疫的雙向調(diào)節(jié)作用，可能就是應(yīng)為其可以促進(jìn)pDC成熟及向DC分化，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫，提高抵抗力的目的。

綜上所述，脾多肽可能通過促進(jìn)pDC成熟、分化，上調(diào)PD-L1的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，從而發(fā)揮治療作用。