中藥材有效部位總黃酮含量測定方法研究概述

包強　劉麗梅　王延玲　畢映燕

摘要：黃酮類化合物為多種中藥材有效成分，具有廣泛的生物活性和臨床應(yīng)用范圍，其種類繁多、成分復(fù)雜，僅對某種或若干有效/指標(biāo)性成分進行定量分析未必能反映其總黃酮量，存在一定局限性。而測定有效部位總黃酮含量是中藥材及中藥制劑質(zhì)量控制的重要內(nèi)容。目前，總黃酮含量測定方法主要有紫外-可見分光光度法、熒光分光光度法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、薄層色譜法及近紅外光譜法等。本文對中藥材總黃酮含量測定方法及特點進行綜述，為中藥材質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：總黃酮；中藥材；含量測定；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.031

中圖分類號：R284 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）04-0136-05

Abstract： The flavonoids are the active ingredients of many Chinese materia medica， with widespread biological activities and a wide range of clinical application. There are many types of flavonoids， and its chemical structure is complex. Quantitative analysis of only one or several valid / indexed components may not necessarily reflect the amount of total flavonoids， with some limitations. The content determination of total flavonoids in effective parts of Chinese materia medica is an important aspect of quality control. The main methods for determining total flavonoid content are as follows： UV-visible spectropho-tometry， fluorescence spectrophotometry， high performance liquid chromatography， capillary electrophoresis， thin layer chromatography， as well as near-infrared spectroscopy and so on. In this article， the methods and characteristics in the determination of total flavonoids in Chinese materia medica were reviewed， so as to provide references for the quality control of Chinese materia medica.

Keywords： total flavonoids； Chinese materia medica； content determination； review

黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物，系指有2個酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過中央三碳原子相互連接，一般具有C6-C3-C6骨架結(jié)構(gòu)[1]。黃酮類化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎抗過敏、預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)免疫功能、止血止痛、抗菌抑菌等作用，是一類生理活性強、藥理作用廣泛的化合物[2]。

由于中藥材所含的有效成分數(shù)量繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且部分含量較低，分離條件較難摸索，僅對某種或若干有效/指標(biāo)性成分進行定量分析未必能反映其總黃酮量，存在一定局限性。中藥為具有涌現(xiàn)性特征的復(fù)雜系統(tǒng)[3]，測定有效部位的含量作為中藥材質(zhì)量控制中定量的一種手段，符合中藥材質(zhì)量控制的自身特點，具有較好的合理性和可靠性。目前，黃酮類有效部位含量測定的方法主要有紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、熒光分光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法，以及近年興起的近紅外光譜法等，茲就各方法在總黃酮含量測定方面的應(yīng)用特點進行綜述，為以黃酮類化合物為主要成分的中藥材的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 紫外-可見分光光度法

黃酮類化合物的甲醇溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生2個主要特征吸收帶，即240～280 nm（帶Ⅱ）和300～400 nm（帶Ⅰ），由于分子結(jié)構(gòu)的差異，不同類型黃酮化合物的帶Ⅰ和帶Ⅱ峰形和吸收強度各異[4]。各種類型的黃酮分子結(jié)構(gòu)上多有酚羥基取代，在堿性條件下，2個吸收峰帶可發(fā)生紅移[5]，利用這一光譜性質(zhì)，可在其紫外波譜最大吸收波長處測定總黃酮的含量。

1.1 比色法

比色法是最經(jīng)典的測定中藥材/中藥制劑中總黃酮含量的測定方法，也是歷版《中華人民共和國藥典》測定總黃酮廣泛采用的方法。該法是在堿性環(huán)境中，黃酮類化合物與金屬鹽類反應(yīng)形成有色螯合物，生成的螯合物在紫外-可見光光譜上能產(chǎn)生明顯的波譜變化，使吸收峰紅移，可用來測定總黃酮的含量。常用的金屬鹽試劑離子有Al3+、Mg2+、Zr2+、Sr2+等。

1.1.1 Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法

該法為歷版《中華人民共和國藥典》測定中藥材/中藥制劑總黃酮應(yīng)用頻率最高的方法，系用還原劑NaNO2還原黃酮化合物，再用絡(luò)合劑Al3+進行絡(luò)合，最后在NaOH堿性條件下黃酮類化合物開環(huán)，生成查爾酮結(jié)構(gòu)絡(luò)合物而顯色，可在500～510 nm處進行測定。常飛等[6]以蘆丁為對照品，采用Al（NO3）3-NaNO2- NaOH比色法，在505 nm處對貴州產(chǎn)白補藥中總黃酮含量進行測定，考察顯色劑的用量及顯色時間對試驗結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)顯色劑Al（NO3）3、NaNO2、NaOH的用量對吸光度存在一定影響。劉東彥等[7]采用該法在510 nm處對雪松松針中總黃酮進行大孔樹脂純化，并測定其含量，顯色條件為5%NaNO2 0.3 mL（靜置6 min），10%Al（NO3）3 0.3 mL（靜置6 min），4%NaOH 4 mL（靜置15 min）。

1.1.2 AlCl3比色法

Al3+與黃酮母核上的3-羥基、4-羥基和B環(huán)鄰二酚羥基作用時發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，使峰帶Ⅱ紅移至420 nm左右，可在此最大吸收波長處進行測定。徐靈源等[8]以蘆丁為對照品，采用AlCl3-HAc-NaAc顯示體系，對青天葵中總黃酮進行測定，檢測波長為405 nm?？疾炝孙@色體系不同的pH條件，確定了偏酸性的緩沖體系HAc-NaAc（pH 5.5）。在該條件下，青天葵中黃酮的5-羥基、4-羰基極易與Al3+絡(luò)合，在405 nm處呈現(xiàn)吸收。

Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法中，只有黃酮類化合物中有鄰二酚羥基，且鄰二酚羥基的鄰位沒有被取代，才會在510 nm左右呈現(xiàn)吸收，值得注意的是，一些具備3，4-鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的酚酸、木質(zhì)素類化合物也可發(fā)生顯色反應(yīng)[9]。此外，該顯色試劑可能與被測物中某些成分發(fā)生沉淀反應(yīng)，影響測定的準(zhǔn)確度。只存在5-羥基、4-羰基的黃酮類物質(zhì)與AlCl3不發(fā)生反應(yīng)，含有鄰二酚羥基的一些化合物，如酚酸、原花色素類在最大吸收波長420 nm左右不產(chǎn)生吸收，故對黃酮類物質(zhì)測定沒有干擾，專屬性較強[10]。

1.1.3 HCl-Mg粉比色法

黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇等在HCl-Mg粉的作用下，被新生態(tài)的氫還原，在有3-羥基或5-羥基的情況下，與Mg2+發(fā)生絡(luò)合生成橙色到暗紅色物質(zhì)，在可見區(qū)產(chǎn)生吸收[10]。黨曉芳等[11]對鬼箭羽總黃酮含量測定，篩選Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法、AlCl3比色法與HCl-Mg粉比色法，結(jié)果表明采用Al3+離子顯色劑，對照品和供試品在400～700 nm均無相應(yīng)吸收峰，而采用HCl-Mg粉比色法在524 nm處有較好的吸收，試驗考察了Mg粉用量、加熱時間等顯色條件。該法具有精密度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢。王建壯等[12]用HCl-Mg粉比色法測定龍血竭中總黃酮含量，比較Al3+金屬鹽類顯色體系與龍血竭的作用，結(jié)果也顯示HCl-Mg粉比色法專屬性高，適用于龍血竭總黃酮的含量測定。

HCl-Mg粉化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生大量的熱量和氣體，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，有利于提高實驗的重復(fù)性。HCl-Mg粉反應(yīng)易在15 ℃左右水浴中進行，加入鹽酸溶液時逐滴加入，且需不時振搖試管，減緩鹽酸與Mg粉反應(yīng)的劇烈程度，使產(chǎn)生的新生態(tài)氫與黃酮類化合物充分反應(yīng)，且滴加鹽酸的時間不宜超過15 min[13]。

1.1.4 KOH比色法

該法是在堿性環(huán)境中，黃酮類化合物峰帶Ⅱ發(fā)生紅移，出現(xiàn)較強的吸收峰。劉效栓等[14]采用KOH比色法，在336 nm處，以甘草苷為對照測定甘草渣中總黃酮的含量。試驗確定的顯示條件為：10%KOH溶液為顯色劑，用量為0.5 mL，顯色時間為5 min。值得注意的是，羥基蒽醌類化合物也可與堿性溶液發(fā)生顏色改變，因此需要加以區(qū)別。

1.1.5 三乙胺比色法

袁旭江等[15]為建立毛雞骨草中總黃酮含量測定的專屬方法，篩選總黃酮含量測定常用的對照品蘆丁，及芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷為對照，考察三乙胺顯色法的適用性。顯色條件為：選擇芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷為對照，50%三乙胺乙醇溶液為顯色劑，用量為5 mL，檢測波長為400 nm。此法適用于芹菜素黃酮類成分的含量測定，且顯色體系中乙醇和水的體積分數(shù)對顯色具有明顯的影響，在具體的試驗中應(yīng)進行考察。

1.1.6 二氯氧化鋯比色法

鋯鹽也是一種測定黃酮含量時使用的一種絡(luò)合劑，可與其形成絡(luò)合物，在一定波長下顯色，可用以對總黃酮進行含量測定。仇豪文等[16]采用Al（NO3）3- NaNO2-NaOH比色法測定杜仲葉中總黃酮時，由于綠原酸的存在，測定結(jié)果偏高或不真實。因此采用2%ZrOCl2甲醇溶液為顯色劑，添加HAc-NaAc緩沖液，以蘆丁為對照，放置時間為70 min，在440 nm處測定。試驗應(yīng)考察醋酸鹽緩沖液的加入體積、放置時間等影響顯色的因素。

1.1.7 鉬酸鈉比色法

鉬酸鈉在堿性條件下，與黃酮類化合物形成穩(wěn)定的配合物，在特定吸收波長處吸光度值發(fā)生明顯變化，可測定黃酮類化合物的含量。張亞超等[17]測定槐葉中總黃酮含量，以蘆丁為對照，采用鉬酸鈉為顯色劑，加入4%NaOH溶液，放置時間為15 min，在322 nm進行測定，同時對顯色劑的用量和穩(wěn)定性進行考察。結(jié)果表明，采用該法可較好的解決背景吸收的問題。

1.2 差示分光度法

差示分光光度法系用稍高于或稍低于供試品的標(biāo)準(zhǔn)作參比，測量被測樣品和參比之間的相對吸光度，該相對吸光度與黃酮類成分在一定濃度范圍內(nèi)存在線性關(guān)系，可用來計算總黃酮含量[18]。歐陽坤等[19]測定毛冬青總黃酮含量，以蘆丁為對照，平行制備了2份對照溶液，其中1份以2% ZrOCl2乙醇溶液做顯色劑進行顯色反應(yīng)，另一份用乙醇稀釋作為參比液，在510 nm波長處，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出供試品溶液濃度。方法學(xué)表明該法可有效消除毛冬青中其他背景雜質(zhì)的干擾，操作簡便，準(zhǔn)確度較高。

1.3 雙波長分光光度法/三波長分光光度法

當(dāng)黃酮類化合物提取液中存在較高含量的葉綠素、原花色素時，常用的比色法測定準(zhǔn)確度較低。雙波長分光光度法采用2個不同的波長同時測定相同樣品，最大程度克服樣品本身雜質(zhì)產(chǎn)生的干擾。以蘆丁為對照品，選取510 nm為蒲公英總黃酮的測定波長，590 nm為參比波長，在上述2種波長處采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法測定吸光度，以吸光度差值ΔA與濃度進行線性回歸，折算供試品濃度。結(jié)果表明，該方法的測定值低于單波長510 nm處測定值，靈敏度高，專屬性較強[20]。應(yīng)用雙波長分光光度法，需正確地選擇檢測波長和參比波長，常用的方法是系數(shù)倍率法。

三波長分光光度法可有效消除光譜吸收峰不對稱給定量分析造成的干擾，校正基于干擾組分的吸收光譜具有線性吸收產(chǎn)生的基線傾斜[21]。藥用百合總黃酮[22]的含量測定中，以蘆丁為對照品，采用AlCl3顯色，在200～600 nm波長范圍內(nèi)紫外掃描繪制吸收曲線，作圖法確定3個波長為245、323、420 nm，分別測定其吸光度，計算ΔA，以空白試劑參比，依標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮的含量。該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于藥用百合中總黃酮的含量測定。三波長分光光度法在排除被測物的干擾、提高測定的準(zhǔn)確度和靈敏度方面具有優(yōu)勢。

1.4 直接測定法

黃酮類化合物結(jié)構(gòu)各異，某些黃酮應(yīng)用常規(guī)的顯色劑在特定的波長下并未出現(xiàn)相應(yīng)的吸收，或與對照品吸收曲線峰形和最大吸收波長差異較大。近年來，許多研究者采用紫外-可見分光光度法直接測定某些藥材中總黃酮的含量。筆者在黃芪和紅芪總黃酮的測定中以藥材中所含的毛蕊異黃酮葡萄糖苷為對照，在260 nm波長處直接測定總黃酮的含量，方法學(xué)驗證符合含量測定的要求[23]。川麥冬總黃酮[24]、陳皮總黃酮[25]等含量測定均采用直接測定法。

紫外-可見分光光度法雖然專屬性不強，未必能客觀反映藥材中總黃酮的真實含量，但在現(xiàn)階段技術(shù)水平下，對于成分繁雜的中藥材和中藥制劑，在未能建立專屬可靠的分析方法時，紫外-可見分光光度法仍然不失為是一種簡便、適用性強的測定方法。

2 熒光分光光度法

熒光分光光度法具有高靈敏度和選擇性，檢測限低的優(yōu)勢。中藥材中某些黃酮類化合物可與Al3+、Mg2+、Zr2+等金屬離子類試劑產(chǎn)生熒光絡(luò)合物，吸收特定波長的紫外光后可發(fā)射一定波長的熒光，且熒光強度與被測物的濃度存在線性關(guān)系，可用來測定總黃酮的含量。馬登磊等[26]測定元寶楓葉總黃酮含量，以蘆丁為對照品，HAc-NaAc緩沖液（pH5）條件下，5%Al（NO3）3為顯色劑，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為470 nm和547 nm。試驗考察了乙醇的體積分數(shù)、顯色劑的加入量、pH值、放置時間及綠原酸對熒光強度的干擾等因素。表明該法可通過改變激發(fā)光的波長，減少綠原酸的干擾，提高測定的專屬性和準(zhǔn)確性。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法多用于單體成分或若干指標(biāo)性成分的含量測定，具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于中藥材或制劑的含量測定。任冰如等[27]采用反相高效液相色譜法測定紅鳳菜中總黃酮的含量。將藥材所得的甲醇提取物進行酸解成苷，以槲皮素、山柰酚為對照品，測定出二者的含量，再利用前期研究確定的紅鳳菜黃酮苷的種類及其分子量確定的系數(shù)轉(zhuǎn)換法換算成總黃酮的含量。試驗結(jié)果表明，此法專屬性強，數(shù)據(jù)更為可靠。對淫羊藿總黃酮的含量測定中，陳肖家等[28]比較了紫外分光光度法和高效液相色譜法，并進行了方法學(xué)驗證，結(jié)果顯示2種測定方法差異明顯，紫外分光光度法測量值遠高于高效液相色譜法，提示前者的準(zhǔn)確性有待于進一步考證。高效液相色譜法測定有效部位的含量，需要利用轉(zhuǎn)換系數(shù)或校正因子對測定的數(shù)據(jù)進行處理計算，再換算成被測物中總黃酮的含量。

4 近紅外光譜法

近紅外光譜分析技術(shù)具有快速、高效、無損、原位與環(huán)保等特點，為中藥質(zhì)量的快速分析提供了一種新的簡便預(yù)測方法，目前已逐漸應(yīng)用于中藥材及中藥制劑的定性、定量分析及在線監(jiān)測[29]等。胡小莉等[30]以蘆丁為對照，采用改良的NaNO2-AlCl3-NaOH比色法對6個不同產(chǎn)地野菊花中總黃酮進行含量測定作為參考值，近紅外漫反射光譜法采集樣品野菊花的紅外圖譜。采用偏最小二乘法建立總黃酮含量的定量預(yù)測模型，并對該模型進行了驗證。經(jīng)過驗證，分析模型相關(guān)系數(shù)、校正均方差、預(yù)測均方差及交叉預(yù)測均方差均符合方法學(xué)要求，驗證集中總黃酮含量近紅外預(yù)測值平均相對偏差為2.08%，表明近紅外光譜法預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確度高，適用性強。

近紅外光譜分析方法由近紅外光譜儀、化學(xué)計量學(xué)方法測定結(jié)果的軟件技術(shù)及針對分析樣品建立的校正模型3個部分組成[31]。多元線性回歸、主成分回歸和偏最小二乘法是中藥含量測定分析中常用的建立校正數(shù)學(xué)模型的方法[32]。

5 其他方法

高效毛細管電泳法具有電泳和色譜的雙重技術(shù)優(yōu)勢，在同時測定若干種黃酮類化合物的含量中也有一定的應(yīng)用[33]，與高效液相色譜法比較，毛細管電泳法樣品前處理過程簡單，分析速度快，但是準(zhǔn)確度和靈敏度稍低，在總黃酮含量測定方面鮮有報道。此外，單掃示波極譜法、共振散射光譜分析法、薄層掃描法等方法在測定總黃酮方面也有相關(guān)報道[34-36]，但是這幾種測定方法目前應(yīng)用較少。

6 小結(jié)

近年來，分析測試?yán)碚撆c技術(shù)有了長足發(fā)展，可供選擇的中藥材對照品種類日益增多，中藥總黃酮定量測定方法發(fā)展較為迅速。紫外分光光度法操作簡便，比色試劑較多，適用范圍較廣，為歷版《中華人民共和國藥典》應(yīng)用最為普遍的測定中藥材或中藥制劑總黃酮含量的方法。需要注意的是，應(yīng)用比色法時，顯色系統(tǒng)溶劑的類型和體系的pH值對吸收帶的位置具有較大的影響，應(yīng)注意考察。高效液相色譜法應(yīng)用范圍逐漸擴大，已用于銀杏葉總黃酮醇苷、淫羊藿總黃酮定量測定[37]。近紅外光譜法近年來發(fā)展最為迅速，為中藥材及中藥制劑的含量測定及生產(chǎn)過程中的在線監(jiān)測提供了有效手段，滿足了中藥大批量快速檢測的要求。

每種中藥材總黃酮含量測定方法均具有一定的適用范圍和局限性，在實際研究中，應(yīng)盡可能全面查閱相關(guān)文獻資料，盡量明確待測物所含黃酮成分的類型和比例，提高含量測定方法的專屬性。對照品應(yīng)盡量選被測物自身所含的黃酮類化合物，首選已明確的藥材中的活性成分，以確保對藥材含量測定的可控性。對于藥材成分尚不明確或?qū)φ掌凡灰椎玫降模蛇x擇蘆丁或槲皮素。應(yīng)用比色法測定時，應(yīng)保證測試樣品干擾的最大程度排除和吸光度測定值相對穩(wěn)定，注意樣品制備過程中顯色參數(shù)的優(yōu)選。應(yīng)根據(jù)不同測定方法的特點和適用范圍綜合比較，篩選專屬性強和準(zhǔn)確度較優(yōu)的測定方法，為含黃酮類化合物中藥的質(zhì)量控制提供有力的方法支撐。

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（收稿日期：2017-05-23）

（修回日期：2017-06-09；編輯：向宇雁）