丹七軟膠囊脂溶性成分的GC—MS指紋圖譜研究

龐穎 劉漢偉 高峰 楊健

中圖分類號(hào) R283.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）06-0766-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.11

摘 要 目的：建立丹七軟膠囊脂溶性成分的氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）指紋圖譜。方法：采用GC-MS 法。色譜柱為DB-5 ms毛細(xì)管色譜柱，載氣為高純度氦（99.999%），程序升溫，流速為1.0 mL/min， 進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為1 ∶ 40，分流進(jìn)樣；電離方式為電子轟擊離子源，離子源溫度為280 ℃， 接口溫度為300 ℃，電子能量為 70 eV，溶劑延遲時(shí)間為3 min，質(zhì)荷比（m/z）為50～550。以棕櫚酸乙酯為參照，測(cè)定11批樣品的GC-MS圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰，并采用LC Solution 2工作站標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)（NIST05.LIB和NIST05s.LIB）確定共有峰成分。結(jié)果：11批樣品相似度均大于0.90；經(jīng)驗(yàn)證，11批樣品的GC-MS圖譜均與對(duì)照?qǐng)D譜具有較好的一致性。11批樣品的GC-MS圖譜有49個(gè)共有峰，鑒定出38個(gè)化學(xué)成分（占總峰面積的94.94%）。結(jié)論：所建指紋圖譜可為丹七軟膠囊質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞 丹七軟膠囊；脂溶性成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；指紋圖譜

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish GC-MS fingerprints of liposoluble constituents from Danqi soft capsule. METHODS： GC-MS method was adopted. GC chromatogram column was DB-5 ms capillary column with high purity helium （99.999%） as carrier gas at the flow rate of 1.0 mL/min， with temperature programming. The injector temperature was 250 ℃.The sample size was 1 μL. The shunt ratio was 1∶40， with distributary injection. Ionization mode was as follows as electron bombardment ion source， ion source temperature of 280 ℃， injector temperature of 300 ℃， electronic energy of 70 eV， solvent delay time of 3 min， mass charge ratio （m/z） of 50-550. Using ethyl palmitate as reference， MS spectrums of 11 batches of samples were determined. Similarity evaluation was conducted by using TCM Fingerprint Chromatogram Similarity Evaluation System （2004 A edition） to determine common peak. The common peaks were determined by LC Solution 2 workstation standard mass spectrometry Library （NIST05.LIB or NIST05s.LIB）. RESULTS： The similarity of 11 batches of samples was higher than 0.90. After validation， GC-MS chromatograms of 11 batches of samples were in good agreement with control fingerprint. There were 49 common peaks in GC-MS chromatogram， and 38 chemical constituents were identified， accounting for 94.94% of total peak areas. CONCLUSIONS： Established fingerprint can provide evidence for quality evaluation of Danqi soft capsule.

KEYWORDS Danqi soft capsule； Liposoluble constituents； GC-MS； Fingerprint

丹參、三七（合稱“丹七”）是臨床常用中成藥的重要組成部分。丹七軟膠囊，系在普通丹七片的基礎(chǔ)上對(duì)其制備方法進(jìn)行科學(xué)改良而成，并獲得了國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局頒發(fā)的丹七軟膠囊制備方法發(fā)明專利證書（證書公開號(hào)：CN17624A）。其具有活血化瘀、通脈止痛之功效，多用于瘀血閉阻所致的胸痹，癥見胸部刺痛、痛處固定、眩暈頭痛、經(jīng)期腹痛等，廣泛應(yīng)用于心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、骨傷科、婦科、眼科等屬“血瘀證”范疇疾病的治療[1-4]。目前，對(duì)丹七類藥物的研究主要集中于其極性部位，尚未見對(duì)該類藥物脂溶性成分的圖譜研究。有研究報(bào)道，三七藥材中脂溶性成分對(duì)大腦和延髓具有一定的抑制作用，可鎮(zhèn)靜、安神[5-6]，其中α-松油醇還具有抑菌作用[7-8]；丹參藥材中脂溶性成分β-石竹烯、β-欖香烯、δ-欖香烯和α-蛇麻烯等對(duì)腫瘤有抑制作用，是具有化療潛力的活性成分[9-10]。為準(zhǔn)確反映丹七軟膠囊的內(nèi)在品質(zhì)，本研究首次對(duì)其中的脂溶性成分進(jìn)行了探討，建立了氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）指紋圖譜，以期為該類藥物的質(zhì)量控制及其有效成分的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TRACE 1310/TSQ 8000型GC-MS儀（美國(guó)Thermo公司）；BS210S型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 藥品與試劑

丹七軟膠囊[北京長(zhǎng)城制藥廠，批號(hào)：13110105、13110215、14080101、14080102、14090101、14090102、14100101、14100102、14110101、14110102、14110113（編號(hào)為S1～S11），規(guī)格： 0.6 g/粒]；棕櫚酸乙酯對(duì)照品（批號(hào)：B21707-20160325，純度：≥98%）、硅藻土（批號(hào)S30557-201603）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

丹參、三七藥材均購(gòu)自河北安國(guó)藥市，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所唐仕歡副研究員鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 GC條件 色譜柱：DB-5 ms毛細(xì)管色譜柱（30 mm × 0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純度氦（純度：≥99.999%）；流速：1.0 mL/min；程序升溫：起始溫度 40 ℃，保持 1 min，以 4 ℃/min的速度升至 220 ℃，以 50 ℃/min的速度升至 280 ℃，保持 5 min；進(jìn)樣口溫度： 250 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：1 ∶ 40，分流進(jìn)樣[11-12]。

2.1.2 MS條件 電離方式：電子轟擊離子源；離子源溫度：280 ℃； 接口溫度：300 ℃；電子能量：70 eV；溶劑延遲時(shí)間：3 min；荷質(zhì)比（m/z）：50～550。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取棕櫚酸乙酯對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品內(nèi)容物 2.0 g，精密稱定，加入約0.5 g硅藻土，研勻，置于100 mL圓底燒瓶中，加乙酸乙酯 25 mL，回流提取 1 h，放至室溫，濾過，取濾液加乙酸乙酯定容至 25 mL，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：14110113）適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以棕櫚酸乙酯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD為0.13%～1.95%（n=6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：14110113）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、16 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以棕櫚酸乙酯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD為 0.46% ～ 2.62%（n=6），表明供試品溶液室溫放置16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：14110113）內(nèi)容物適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以棕櫚酸乙酯峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD為0.26%～2.02%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 GC-MS指紋圖譜的生成、相似度及共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 GC-MS指紋圖譜的生成 取11批樣品內(nèi)容物各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)11批樣品的GC-MS圖譜進(jìn)行分析，得GC-MS指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版），以樣品共有模式為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，11批樣品相似度均大于0.90，表明各樣品間差異較小、質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見表1。

2.5 GC-MS指紋圖譜中共有峰的歸屬和指認(rèn)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A 版）對(duì)11批樣品的GC-MS圖譜進(jìn)行比較分析。11批樣品有49個(gè)共有峰，確定25號(hào)峰為棕櫚酸乙酯，其峰面積較大，為所有藥材樣品共有，因此以25號(hào)峰為參照峰，根據(jù)共有峰的保留時(shí)間和通過檢索LC Solution 2工作站標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖庫(kù)（NIST05.LIB和NIST05s.LIB）對(duì)比相關(guān)質(zhì)譜圖，鑒定出 38 個(gè)化合物（占總峰面積的94.94%）并指認(rèn)其歸屬，詳見表2。

3 討論

本試驗(yàn)采用GC-MS法對(duì)丹七軟膠囊脂溶性成分進(jìn)行指紋圖譜研究，為了更好地反映其脂溶性成分，筆者對(duì)提取條件和分析條件（色譜條件和質(zhì)譜條件）進(jìn)行了多次優(yōu)化。同時(shí)，考察了正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙醚和乙酸乙酯在樣品超聲和回流提取后的提取效率，結(jié)果表明乙酸乙酯提取最為完全、出峰數(shù)最多，故選擇其作為提取溶劑。本試驗(yàn)采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）生成了丹七軟膠囊脂溶性成分指紋圖譜的共有模式，計(jì)算了11批樣品的GC-MS指紋圖譜的相似度，結(jié)果均大于0.90，表明與對(duì)照?qǐng)D譜具有較好的一致性；且各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，說明本方法所建立的指紋圖譜具有較好的穩(wěn)定性和可控性。

本研究同時(shí)對(duì)丹七軟膠囊脂溶性成分指紋圖譜進(jìn)行了指認(rèn)，得到49個(gè)共有峰，其中13個(gè)峰占總峰面積的71.71%（以13個(gè)峰進(jìn)行方法學(xué)考察），38個(gè)峰占總峰面積的94.94%（鑒定38個(gè)峰化合物成分）。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為丹七軟膠囊的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

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（收稿日期：2017-05-09 修回日期：2017-07-07）

（編輯：張 靜）