多指標(biāo)評(píng)分法優(yōu)選野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化有效部位的乙醇提取工藝

李卿 賀宗毅 杜洪飛 周興 梁旭明

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）06-0753-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.06.08

摘 要 目的：優(yōu)化野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化有效部位的乙醇提取工藝。方法：以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素含量為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)野馬追藥材乙醇提取工藝的影響；采用多指標(biāo)評(píng)分法，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：優(yōu)化的提取工藝為采用70%乙醇為提取溶劑，按料液比12 ∶ 1加入，回流提取3次，每次2 h；3批次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，所得4種指標(biāo)成分的含量均較高，平均值分別為5.305 3、1.560 1、1.986 5、6.703 6 mg/g（RSD<1.1%，n=3），結(jié)果穩(wěn)定可靠，且與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論：優(yōu)化的野馬追乙醇回流提取工藝穩(wěn)定可靠，可操作性好，能源消耗與成本更適合工業(yè)化生產(chǎn)，為下一步純化、富集野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化有效成分提供了工藝基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 野馬追；抗動(dòng)脈粥樣硬化；提取工藝；正交試驗(yàn)；多指標(biāo)評(píng)分法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the ethanol extraction process of anti-atherosclerosis effective fraction of Lindley eupatorium. METHODS： Using the contents of hyperin， quercetin， kaempferol and jaceosidin as indexes， the effects of ethanol volume fraction， liquid-solid ratio， extraction time and extraction times on ethanol extraction technology were investigated. By multiple index scoring method， orthogonal test was designed to optimize extraction technology， and validation test was conducted. RESULTS： The optimal extraction technology was 70% ethanol as extraction solvent with solid-liquid ratio of 12 ∶ 1， reflux extracting for 3 times， 2 h each time. Results of 3 batches of validation tests showed that the contents of 4 marker components were in high level， being 5.305 3， 1.560 1， 1.986 5， 6.703 6 mg/g in average （RSD<1.1%，n=3）. Results of validation tests were stable and reliable， and were in good agreement with the results of orthogonal tests. CONCLUSIONS： The optimized ethanol reflux extraction technology of L. eupatorium is stable and reliable， and performs well. Energy consumption and cost are suitable for industrial production. The results provide technology basis for further purification and enrichment of anti-atherosclerosis effective components of L. eupatorium.

KEYWORDS Lindley eupatorium； Anti-atherosclerosis； Extraction technology； Orthogonal test； Multiple index scoring method

野馬追為菊科澤蘭屬植物輪葉澤蘭（Eupatorium lindleyanum DC.）的干燥地上部分，味苦，性平，有化痰止咳平喘的功能，常用于治療痰多咳嗽氣喘[1]。野馬追藥材含有多種生物活性成分，包括黃酮、生物堿、揮發(fā)油和香豆素等[2]。作為江蘇省特產(chǎn)中藥材，野馬追曾被收入1977年版《中國藥典》（一部）、江蘇省地方藥材標(biāo)準(zhǔn) （1988年版），現(xiàn)收載于2015年版《中國藥典》（一部）。隨著對(duì)野馬追藥材的不斷深入研究，相關(guān)報(bào)道指出其還具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化的功能[3-5]。本課題組前期對(duì)野馬追藥材不同溶劑提取物的研究發(fā)現(xiàn)，野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化的有效部位為乙醇回流提取、大孔樹脂富集純化的乙醇洗脫部分，該組分抗動(dòng)脈粥樣硬化效果與辛伐他汀相當(dāng)，某些效果指標(biāo)甚至優(yōu)于辛伐他汀，試驗(yàn)結(jié)果將另文發(fā)表。有研究以棕矢車菊素、槲皮素、山柰素為測定指標(biāo)，對(duì)野馬追的乙醇提取法進(jìn)行工藝優(yōu)化[6]。本試驗(yàn)在前期工作中，發(fā)現(xiàn)野馬追藥材中含有金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素，其中金絲桃苷相對(duì)含量較高，且具有抗炎、止咳、降壓、降低膽固醇、保護(hù)腦血管等多種生理活性，是一種重要的天然活性成分[7]?；诖耍狙芯恳越鸾z桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素等黃酮類成分為檢測指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)野馬追乙醇回流提取工藝進(jìn)行考察，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，為進(jìn)一步純化、富集野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化有效成分，進(jìn)而為提高后續(xù)開發(fā)的相關(guān)制劑產(chǎn)品質(zhì)量及臨床效果提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu-2010A高效液相色譜儀，包括四元梯度泵、可變波長紫外檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器（日本島津公司）；KQ-700DB型數(shù)控超聲清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）；AE240電子分析天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司]。

1.2 試劑

金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)：1521-200303，供含量測定用）、槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-200406，供含量測定用）、山柰素對(duì)照品（批號(hào)：0861-200304，供含量測定用）、棕矢車菊素對(duì)照品（批號(hào)：110817-200305，供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

1.3 藥材

野馬追藥材（批號(hào)：140601）購自重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員鑒定為菊科澤蘭屬植物輪葉澤蘭（Eupatorium lindleyanum DC.）的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，20%A→25%A；25～35 min，25%A→32%A；35～50 min，32%A→40%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：370 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)以槲皮素峰計(jì)應(yīng)不低于3 000。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取金絲桃苷對(duì)照品10.58 mg、槲皮素對(duì)照品9.42 mg、山柰素對(duì)照品9.37 mg、棕矢車菊素對(duì)照品10.25 mg，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液各5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取野馬追藥材粗粉（批號(hào)：140601，以下同），按“2.5”項(xiàng)下正交試驗(yàn)中的條件進(jìn)行提取，濾過，合并濾液，濃縮至適量，用95%乙醇定容至100 mL，搖勻；精密量取5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲（功率：200 W，頻率：50 kHz）處理15 min，放冷，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素對(duì)照品溶液2、4、8、16、20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以各對(duì)照品進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸分析，得金絲桃苷回歸方程為y=11 076.7x-593.52（r=0.999 9）；槲皮素回歸方程為y=10 068.5x-458.36（r=0.999 9）；山柰素回歸方程為y=9 928.31x-476.06（r=0.999 9）；棕矢車菊素回歸方程為y=11 243.8x-417.22（r=0.999 9）。結(jié)果表明，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素進(jìn)樣量分別在0.042 32～0.423 2 μg、0.037 68～0.376 8 μg、0.037 48～0.374 8 μg、0.041 00～0.410 0 μg范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素峰面積的RSD分別為0.72%、0.78%、0.80%、0.73%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、4、8、16、20 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素峰面積的RSD分別為0.68%、0.75%、0.88%、0.79%（n=6），表明供試品溶液室溫放置20 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批野馬追藥材粗粉適量，共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素含量的RSD分別為0.83%、0.68%、0.85%、0.87%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同批野馬追藥材粗粉適量，共9份，精密稱定，分別精密加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的金絲桃苷（0.012 8、0.016 0、0.019 2 mg/mL）、槲皮素（0.005 6、0.007 0、0.008 4 mg/mL）、山柰素（0.006 4、0.008 0、0.009 6 mg/mL）、棕矢車菊素（0.014 4、0.018 0、0.021 6 mg/mL）對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素平均加樣回收率分別為98.59%、99.16%、98.38%、98.85%，RSD分別為1.20%、1.06%、1.27%、1.19%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 前期單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，影響金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素提取效果較顯著的因素為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，故本試驗(yàn)選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，采用正交試驗(yàn)法對(duì)野馬追提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）表安排試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

2.5.2 試驗(yàn)方案與結(jié)果 采用4種指標(biāo)成分為考察指標(biāo)，運(yùn)用綜合加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合加權(quán)評(píng)分計(jì)算：設(shè)定滿分為 100分，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素含量的權(quán)重系數(shù)均為25，以各個(gè)指標(biāo)成分含量的最大值為參照，計(jì)算綜合評(píng)分（綜合評(píng)分=25X金絲桃苷/X金絲桃苷max+25X槲皮素/X槲皮素max+25X山柰素/X山柰素max+25X棕矢車菊素/X棕矢車菊素max）。正交試驗(yàn)各指標(biāo)成分含量測定結(jié)果見表2（表中max為最大值）；正交試驗(yàn)安排與綜合評(píng)分結(jié)果見表3；綜合評(píng)分方差分析結(jié)果見表4。

由表3、表4中的極差值直觀分析和方差分析可得：野馬追提取工藝的各因素影響大小依次為 D （提取次數(shù)）>A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）>C（提取時(shí)間）>B（液料比），各因素皆為提取過程中的極顯著性影響因素（P<0.01）；最優(yōu)提取工藝為D3A3C3B3，即按料液比15 ∶ 1加入80%乙醇回流提取3次，每次2 h。由于采用70%乙醇與80%乙醇、液料比12 ∶ 1與15 ∶ 1提取效果差異極?。ㄒ蛩谹、B的水平Ⅱ、Ⅲ對(duì)應(yīng)的KⅡ/3、KⅢ/3分別為87.50、88.11和84.69、85.23，差值僅為0.61、0.54），考慮到工業(yè)化生產(chǎn)過程中的能源消耗和生產(chǎn)成本，擬確定野馬追的提取工藝為：按料液比12 ∶ 1加入70%乙醇，回流提取3次，每次2 h。

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取野馬追藥材粗粉250 g，共3份，按料液比加入70%乙醇，回流提取3次，每次2 h，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定各指標(biāo)成分含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，按上述優(yōu)化工藝提取后，野馬追各指標(biāo)成分的含量均較高；正交試驗(yàn)優(yōu)化所得工藝符合生產(chǎn)實(shí)際、結(jié)果穩(wěn)定可靠（RSD<1.1%）。

3 討論

野馬追的提取工藝已有文獻(xiàn)報(bào)道采用水煎煮法和乙醇提取法[8-11]。本課題組在前期篩選試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，水煎煮提取液中金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素的含量遠(yuǎn)低于乙醇回流提取液中相關(guān)指標(biāo)成分含量。亦有文獻(xiàn)報(bào)道采用乙醇回流提取法，按料液比12 ∶ 1加入90%乙醇進(jìn)行回流提取[6]，但在工業(yè)化大生產(chǎn)過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)作為生產(chǎn)成本是受到嚴(yán)格管控的，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，既不利于安全生產(chǎn)，且揮發(fā)損失大、回收消耗大，也不利于再次利用。因此，筆者進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化提取工藝，提取野馬追藥材后測定4種指標(biāo)成分的含量結(jié)果顯示，上述指標(biāo)的轉(zhuǎn)移率[轉(zhuǎn)移率（%）=提取后指標(biāo)成分含量/藥材中指標(biāo)成分含量×100%]均達(dá)到85%以上。由此表明，本研究既充分考慮工業(yè)化生產(chǎn)過程中的實(shí)際問題，又使得野馬追中的有效指標(biāo)成分能被充分提取。

正交試驗(yàn)結(jié)果顯示，金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素這4個(gè)指標(biāo)成分在提取溶劑乙醇不同體積分?jǐn)?shù)條件下，表現(xiàn)出不同的提取效果：4個(gè)指標(biāo)成分并不是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化呈現(xiàn)同時(shí)增加或降低的趨勢，這可能與4個(gè)指標(biāo)成分在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中的溶解性差異有關(guān)。

綜上所述，本試驗(yàn)以金絲桃苷、槲皮素、山柰素、棕矢車菊素4種成分為考察指標(biāo)，優(yōu)選野馬追藥材的乙醇提取工藝，評(píng)價(jià)方法更合理，所優(yōu)選的提取工藝可操作性更好，為下一步純化、富集野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化有效成分提供了工藝基礎(chǔ)。本研究不足之處在于僅以4種黃酮類成分作為野馬追抗動(dòng)脈粥樣硬化有效部位提取工藝的檢測指標(biāo)，可能未全面反映野馬追有效部位的物質(zhì)作用基礎(chǔ)。故筆者下一步擬對(duì)野馬追藥材中含量也較高的生物堿、萜內(nèi)酯類等成分開展分離純化等工作，并進(jìn)行相關(guān)的藥效學(xué)、毒理學(xué)比較研究，以期為野馬追藥材的全面利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：313.

[ 2 ] 于紹帥，陳明蒼，李志雄.中藥野馬追的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（3）：19-20.

[ 3 ] 王柯靜，秦劍，陳萬一，等.野馬追改善高脂血癥大鼠血液流變性及抗氧化作用研究[J].中藥藥理與臨床，2009，25（2）：80-82.

[ 4 ] 王柯靜，程渝，周遠(yuǎn)大.野馬追提取液對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化家兔炎癥反應(yīng)的防治作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（18）：1853-1856.

[ 5 ] 陳萬一，秦劍，何海霞，等.野馬追總黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠脂代謝的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（16）：1589-1591.

[ 6 ] 張威峰，楊念云.正交試驗(yàn)法優(yōu)選野馬追提取工藝研究[J].安徽醫(yī)藥，2005，9（5）：333-334.

[ 7 ] 李敏芳，李慧，王學(xué)美. 金絲桃苷藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2008，15（4）：102-104.

[ 8 ] 王衛(wèi)東，王乃馨，李姣姣，等.野馬追類黃酮的超聲提取及其抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2010，31（18）：50-54.

[ 9 ] 劉全德，李超.纖維素酶輔助提取野馬追總黃酮的工藝研究[J].中國食品添加劑，2011（5）：78-81.

[10] 李音，呂秀陽.野馬追總生物堿提取工藝研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（B8）：130-133.

[11] 仲歡歡，方詩琦，陳亞軍，等.野馬追化學(xué)成分及其抗炎活性[J].中成藥，2017，39（2）：329-333.

（收稿日期：2017-10-14 修回日期：2018-01-26）

（編輯：段思怡）