基于面包酵母中海藻糖提取工藝優(yōu)化及菌株篩選的高密度培養(yǎng)工藝

洪厚勝，竇冰然，郭會(huì)明

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇 南京 211816）

海藻糖亦可稱作漏蘆糖。其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無(wú)毒性，是一種安全、可靠的天然糖類。海藻糖具有3 種異構(gòu)體，包括α,α-海藻糖、β,β-海藻糖和α,β-海藻糖，但在自然界生物體內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)有α,α-海藻糖[1-3]。海藻可在高溫、高壓、干燥等環(huán)境下在細(xì)胞膜外產(chǎn)生保護(hù)膜，因而細(xì)胞中所含有海藻糖的含量越多，可有效提高細(xì)胞耐受性。面包酵母主要為活性干酵母的制備提供生產(chǎn)菌種，活性干酵母下游生產(chǎn)工藝中包括干燥脫水環(huán)節(jié)，對(duì)酵母細(xì)胞的活性會(huì)造成一定損失，高細(xì)胞耐受性可提高干燥脫水后活性干酵母的活菌率及發(fā)酵力[4-6]。相對(duì)于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法及蒽酮比色法，酶-3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定酵母胞內(nèi)海藻糖不受實(shí)驗(yàn)設(shè)備的限制，測(cè)定結(jié)果不易產(chǎn)生波動(dòng)，結(jié)果較為精確[7-11]。以微波-浸提法利用微波破碎酵母細(xì)胞膜再通過(guò)三氯乙酸浸提細(xì)胞中的海藻糖，可有效保證酵母中的海藻糖被充分提取出來(lái)，進(jìn)而將該工藝用于篩選高產(chǎn)海藻糖酵母，能夠進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性[12-14]。

酵母的高密度培養(yǎng)特指酵母發(fā)酵液中菌體質(zhì)量濃度在100 g/L之上的一種發(fā)酵方法[15-16]，高密度培養(yǎng)的核心是在于選擇合適的流加策略消除Crabtree效應(yīng)。林俊涵[17]通過(guò)控制培養(yǎng)基中的底物濃度與成分組成，并在發(fā)酵過(guò)程成適時(shí)調(diào)節(jié)pH值，采用變溫發(fā)酵方法，有效提高發(fā)酵液里的溶氧量，間歇地利用指數(shù)流加法流加培養(yǎng)基，將畢赤酵母產(chǎn)外源蛋白的產(chǎn)量提高了10%。鄭苗等[18]調(diào)節(jié)了東方伊薩酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基成分比例，并對(duì)搖床培養(yǎng)條件參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)間歇發(fā)酵的方法實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可提高菌體數(shù)到1.71×109CFU/mL。面包酵母高密度培養(yǎng)的要求是在整個(gè)發(fā)酵周期盡可能多地得到酵母菌體，并且保證面包酵母的發(fā)酵力和活性，不能只追求高產(chǎn)量而忽視酵母本身的質(zhì)量，如果面包酵母因高密度培養(yǎng)后發(fā)生老化現(xiàn)象或者活菌數(shù)過(guò)低，同樣無(wú)法達(dá)到面包酵母的質(zhì)量要求。能夠影響面包酵母高密度培養(yǎng)的因素非常多，除去酵母細(xì)胞本身的菌體質(zhì)量和活性，即接種進(jìn)發(fā)酵罐中的面包酵母種子液的質(zhì)量之外，外流加發(fā)酵過(guò)程中，各個(gè)培養(yǎng)階段的碳源、氮源和磷源的流加量、發(fā)酵罐中發(fā)酵液的pH值、控溫、發(fā)酵液中的溶解氧情況、消泡劑的添加量和一些促進(jìn)面包酵母生長(zhǎng)的促進(jìn)因子如Mg2+都會(huì)決定面包酵母是否能夠進(jìn)行高密度培養(yǎng)[18-24]。首先在50 L自吸式發(fā)酵罐中采用溶氧反饋流加的碳源流加工藝進(jìn)行發(fā)酵，在現(xiàn)有工藝的基礎(chǔ)上改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)源流加工藝，采用稱量補(bǔ)料的方式對(duì)酵母培養(yǎng)中流加的碳源、氮源及磷源通過(guò)酵母生成量精確補(bǔ)料，有效提高面包酵母培養(yǎng)中的最大菌體濃度，并通過(guò)多次重復(fù)對(duì)該工藝進(jìn)行了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程中不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)水平，對(duì)比酵母生長(zhǎng)曲線，確定了面包酵母培養(yǎng)過(guò)程中的最適乙醇體積分?jǐn)?shù)，通過(guò)一系列流加工藝的優(yōu)化，解除面包酵母發(fā)酵過(guò)程中的底物抑制，達(dá)到面包酵母高密度培養(yǎng)的目的，面包酵母為制備活性干酵母實(shí)驗(yàn)菌種，通過(guò)高含海藻糖菌株的篩選及高密度培養(yǎng)工藝的研究，為下游活性干酵母的制備提供了良好的耐受菌種及高質(zhì)量的發(fā)酵液，為活性干酵母工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及試劑

安琪高活性干酵母由安琪酵母股份有限公司提供；面包酵母即釀酒酵母CICC 1532由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心提供。

海藻糖酶（303 000 U/g） 上海普邁生物科技有限公司；海藻糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糖蜜柳州市金黔灣糖蜜有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固體培養(yǎng)基）：葡萄糖2 g/100 mL，酵母膏1 g/100 mL，蛋白胨2 g/100 mL，瓊脂1.5～1.7 g/100 mL。

搖瓶培養(yǎng)基（YPD液體培養(yǎng)基）：葡萄糖2 g/100 mL，蛋白胨2 g/100 mL，酵母膏1 g/100 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1）溶氧反饋流加：處理稀釋后含糖量25%的甘蔗糖蜜37%，尿素（含氮量10 g/100 mL）14%，磷酸二氫銨（含磷量以P2O5計(jì)）1.2%，MgSO47.5 g，VB10.2 g，VB50.2 g，VB60.2 g，生物素0.1 g。2）稱質(zhì)量流加：糖蜜的處理：將甘蔗糖蜜稀釋至23～25 °Bx，用硫酸調(diào)節(jié)pH值至5左右，加熱煮沸至95 ℃，通風(fēng)30 min后，保溫70～80 ℃，靜置8～12 h，使用前121 ℃，滅菌20 min；尿素：將尿素稀釋為含氮量10 g/100 mL的溶液；磷酸二氫銨：將磷酸二氫銨稀釋為以P2O5計(jì)含磷量10 g/100 mL的溶液；維生素及生物素的添加：在對(duì)發(fā)酵罐（含底水12.5 L）進(jìn)行實(shí)消后添加VB10.2 g，VB50.2 g，VB60.2 g，生物素0.1 g。

1.2 儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津制作所；TGL-20B高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；50 L機(jī)械攪拌玻璃發(fā)酵罐 南京匯科生物工程設(shè)備有限公司；ZQWY-200全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠；M1-L213B微波爐 美的微波爐制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母內(nèi)海藻糖的測(cè)定方法（酶-DNS法）的建立

首先利用DNS法進(jìn)行葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[25]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得到回歸方程：y=0.804 8x-0.044 3，R2=0.999 3，其線性高度顯著。根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定0.1%的海藻糖溶液分解后葡萄糖質(zhì)量濃度為1.29 g/mL，代入換算式可知海藻糖分解后產(chǎn)生的葡萄糖量為原海藻糖含量的1.29 倍（n=1.29）。

1.3.2 酵母內(nèi)海藻糖的酶-DNS法測(cè)定

稱取1 g海藻糖存放在表面皿中，在110 ℃烘箱中烘干2 h。配制0.1 g/L海藻糖溶液。在25 mL定容比色管中加入0.1 g/L海藻糖溶液0.25 mL、海藻糖酶3.03 U及0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 5.6）0.25 mL，混合均勻后置于40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后加入0.75 mL DNS溶液、0.5 mL蒸餾水，沸水浴中精確反應(yīng)5 min，冷卻到室溫，定容至25 mL，以蒸餾水代替海藻糖作為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，對(duì)照DNS法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到生成的葡萄糖含量，換算得出海藻糖含量。

酶-DNS法測(cè)定活性干酵母胞內(nèi)海藻糖實(shí)驗(yàn)步驟：活性干酵母微波-浸提處理后，測(cè)得酶解前葡萄糖質(zhì)量濃度，利用海藻糖酶酶解酵母胞內(nèi)海藻糖測(cè)得酶解后葡萄糖質(zhì)量濃度，計(jì)算增加的葡萄糖質(zhì)量濃度，由下式得出海藻糖質(zhì)量濃度：

式中：CT為海藻糖質(zhì)量濃度；C1、C2為酶解前、后的葡萄糖質(zhì)量濃度；n為比例系數(shù)。

1.3.3 活性干酵母的胞內(nèi)海藻糖提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)1.5 g活性干酵母胞內(nèi)海藻糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置5 個(gè)微波功率，分別為119、231、385、539、700 W（微波時(shí)間40 s、三氯乙酸濃度0.5 mol/L、三氯乙酸體積60 mL、浸提溫度40 ℃、浸提時(shí)間120 min）；5 個(gè)微波時(shí)間水平，分別為20、40、60、80、100 s（微波功率231 W、三氯乙酸濃度0.5 mol/L、三氯乙酸體積60 mL、浸提溫度40 ℃、浸提時(shí)間120 min）；5 個(gè)三氯乙酸濃度水平，分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L（微波功率231 W、微波時(shí)間40 s、三氯乙酸體積60 mL、浸提溫度40 ℃、浸提時(shí)間120 min），5 個(gè)三氯乙酸體積水平，分別為20、40、60、80、100 mL（微波功率231 W、微波時(shí)間40 s、三氯乙酸濃度0.5 mol/L、浸提溫度40 ℃、浸提時(shí)間120 min）；5 個(gè)浸提溫度水平，分別為10、25、40、55、70 ℃（微波功率231 W、微波時(shí)間40 s、三氯乙酸濃度0.5 mol/L、三氯乙酸體積60 mL、浸提時(shí)間120 min）；5 個(gè)浸提時(shí)間水平，分別為30、60、90、120、150 min（微波功率231 W、微波時(shí)間40 s、三氯乙酸濃度0.5 mol/L、三氯乙酸體積60 mL、浸提溫度40 ℃）。按照設(shè)定條件分別對(duì)1.5 g活性干酵母中的海藻糖進(jìn)行提取，對(duì)比得到的海藻糖含量。設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了進(jìn)一步優(yōu)化海藻糖提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行五因素三水平的正交試驗(yàn)，選取微波功率、微波時(shí)間、三氯乙酸濃度、三氯乙酸體積、浸提溫度5 個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平，以在活性干酵母中提取的海藻糖含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)置3 次重復(fù)，各因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Levels of independent variables used for orthogonal array design

1.3.4 高產(chǎn)海藻糖面包酵母菌株的篩選

將斜面保藏的面包酵母菌種在超清工作臺(tái)中用接種環(huán)接于YPD固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)2 d，挑取10 株單菌落進(jìn)行斜面保藏，分別接種于裝液量為40.0 mL的250 mL的裝有YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，30 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的面包酵母菌種液10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，分別稱取1.5 g離心后酵母乳，使用優(yōu)化后的微波-浸提工藝進(jìn)行海藻糖提取，并測(cè)定其中海藻糖含量并進(jìn)行對(duì)比。

1.3.5 50 L自吸式發(fā)酵罐溶氧反饋流加工藝

取一環(huán)斜面保藏的面包酵母菌種于一級(jí)種子培養(yǎng)基，以30 ℃、200 r/min YPD液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)24 h為條件制備一級(jí)種子液；取一級(jí)種子液以接種量10%以30 ℃、200 r/min YPD液體培養(yǎng)基制備二級(jí)種子液2.5 L，將二級(jí)種子液接于50 L自吸式發(fā)酵罐中，以溶氧反饋流加方式，即當(dāng)溶氧量快速上升為時(shí)間節(jié)點(diǎn)流加糖蜜，發(fā)酵26 h后，每2 h取樣測(cè)定酵母濕質(zhì)量濃度，繪制酵母發(fā)酵曲線。

1.3.6 50 L自吸式發(fā)酵罐稱量補(bǔ)料高密度培養(yǎng)工藝

用1 L搖瓶以麥芽汁液體培養(yǎng)基（pH 4.8）培養(yǎng)，搖瓶裝液量8.4%，接種量7.4%，搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)10～12 h，至酵母濕質(zhì)量濃度為35～37 g/L，制備二級(jí)種子液2.5 L；將上述種子液接種進(jìn)含有12.5 L底水（VB10.2 g，VB50.2 g，VB60.2 g，生物素0.1 g）的50 L自吸式發(fā)酵罐中，以接種前一刻標(biāo)定溶氧電極溶氧量為100%；糖蜜流加量按照發(fā)酵罐中當(dāng)前酵母干質(zhì)量的2.3倍添加，發(fā)酵結(jié)束前2 h，將糖蜜添加量減少50%～60%，直至發(fā)酵結(jié)束停止流加，尿素流加量為8 g/h，20 h后停止流加，磷酸二氫銨流加量為3 g/h，16 h后停止流加，每8 h加入25 g MgSO4，共加入3 次；發(fā)酵過(guò)程中通風(fēng)量前9 h控制為以300 L/h為初始通風(fēng)量，逐漸增加至2 400 L/h，直至發(fā)酵結(jié)束前1 h，減少至1 800 L/h；發(fā)酵過(guò)程中0～16 h發(fā)酵溫度控制在31 ℃，16～21 h控制在32 ℃，22～24 h控制在33 ℃；發(fā)酵過(guò)程中前8 h，pH值控制在4.3～4.8之間，發(fā)酵中期控制在4.5～4.8之間，發(fā)酵結(jié)束前2 h控制在5.0～5.2之間；發(fā)酵26 h停止發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中每2 h測(cè)定酵母濕質(zhì)量濃度（10 000 r/min離心10 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶氧量、殘?zhí)橇俊?/p>

1.3.7 面包酵母高密度培養(yǎng)工藝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將上述稱質(zhì)量補(bǔ)料流加工藝在50 L自吸式發(fā)酵罐中進(jìn)行5 批次重復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)酵后最大酵母濕質(zhì)量濃度，考察工藝穩(wěn)定性。

1.3.8 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)面包酵母高密度培養(yǎng)的影響

設(shè)定高密度培養(yǎng)過(guò)程中12 h后控制乙醇體積分?jǐn)?shù)的不同水平，考察酵母的生長(zhǎng)情況。將乙醇體積分?jǐn)?shù)水平分別維持在4%、3%、2%、1.5%、1.0%、0.7%的水平線上每2 h測(cè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)及酵母濕質(zhì)量濃度，對(duì)比酵母生長(zhǎng)曲線。

1.3.9 發(fā)酵過(guò)程中參數(shù)測(cè)定

酵母濕質(zhì)量濃度測(cè)定：離心稱質(zhì)量法；殘?zhí)橇繙y(cè)定：DNS法；乙醇含量測(cè)定：蒸餾法；菌體數(shù)、發(fā)酵力測(cè)定：參照GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》；溶氧量通過(guò)發(fā)酵罐中溶氧電極測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波-浸提法提取活性干酵母內(nèi)海藻糖工藝優(yōu)化

2.1.1 微波功率對(duì)海藻糖含量的影響

圖1 微波功率對(duì)海藻糖含量的影響Fig. 1 Effect of microwave power on the yield of trehalose

由圖1可知，當(dāng)微波功率為231 W時(shí)，可測(cè)得的活性干酵母中海藻糖含量最高，當(dāng)微波功率小于231 W時(shí)，海藻糖含量逐漸減少，當(dāng)功率大于231 W時(shí)，海藻糖含量隨著功率的增加而降低。這可能是由于功率較小時(shí)無(wú)法破碎酵母細(xì)胞釋放出海藻糖，而微波功率過(guò)大會(huì)導(dǎo)致酵母胞內(nèi)海藻糖成分被破壞。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)海藻糖含量的影響

圖2 微波時(shí)間對(duì)海藻糖含量的影響Fig. 2 Effect of microwave treatment duration on the yield of trehalose

由圖2可知，微波時(shí)間為40 s時(shí)，測(cè)定得到活性干酵母內(nèi)的海藻糖含量最高，微波時(shí)間小于40 s，海藻糖含量隨著時(shí)間的推移而提高，當(dāng)時(shí)間超過(guò)40 s時(shí)，海藻糖含量隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。由此確定微波時(shí)間為40 s。

2.1.3 三氯乙酸濃度對(duì)海藻糖含量的影響

圖3 三氯乙酸濃度對(duì)海藻糖含量的影響Fig. 3 Effect of trichloracetic acid concentration on the yield of trehalose

由圖3可以看出，三氯乙酸濃度對(duì)海藻糖含量的影響表現(xiàn)為先升高后減少，當(dāng)使用0.5 mol/L的三氯乙酸進(jìn)行提取時(shí)，測(cè)得的海藻糖含量最高，因此確定最適三氯乙酸濃度為0.5 mol/L。所使用的三氯乙酸溶液的濃度較大時(shí)，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)完全分離，海藻糖的滅酶效果也更加顯著，但是三氯乙酸濃度過(guò)大，會(huì)出現(xiàn)酵母細(xì)胞壁發(fā)生皺縮的現(xiàn)象，降低海藻糖的溶出量，測(cè)得的海藻糖含量減少[26]。

2.1.4 三氯乙酸體積對(duì)海藻糖含量的影響

圖4顯示，當(dāng)提取出1.5 g活性干酵母中的海藻糖時(shí)，加入60 mL三氯乙酸，得到海藻糖含量最大。當(dāng)使用超過(guò)60 mL的三氯乙酸時(shí)，海藻糖提取量開(kāi)始減少。由此確定最佳的三氯乙酸體積為60 mL。使用的三氯乙酸體積過(guò)少，無(wú)法充分提取出酵母中的海藻糖，但是三氯乙酸用量過(guò)大，會(huì)對(duì)海藻糖的提取產(chǎn)生抑制作用。

圖4 三氯乙酸體積對(duì)海藻糖含量的影響Fig. 4 Effect of trichloracetic acid volume on the yield of trehalose

2.1.5 浸提溫度對(duì)海藻糖含量的影響

圖5 浸提溫度對(duì)海藻糖含量的影響Fig. 5 Effect of extraction temperature on the yield of trehalose

由圖5可知，當(dāng)浸提溫度逐漸提高時(shí)，從活性干酵母中提取的海藻糖含量先增加之后又開(kāi)始降低，分析可知伴隨浸提溫度的提高，加速了海藻糖從細(xì)胞中的溶出速度，但是過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)破壞其中結(jié)構(gòu)；當(dāng)浸提溫度為40 ℃時(shí)，測(cè)得的海藻糖含量最高。因此，最佳浸提溫度為40 ℃。

2.1.6 浸提時(shí)間對(duì)海藻糖含量的影響

圖6 浸提時(shí)間對(duì)海藻糖含量的影響Fig. 6 Effect of extraction time on the yield of trehalose

根據(jù)圖6，根據(jù)浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，海藻糖的含量呈現(xiàn)隨時(shí)間推移而增加的態(tài)勢(shì)。當(dāng)浸提時(shí)間在120～150 min范圍內(nèi)，海藻糖的含量已基本保持不變，曲線上升趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)槲⒉ㄌ幚頃?huì)破碎酵母的細(xì)胞壁，提高了海藻糖的釋放速率。因此，最佳浸提時(shí)間確定為150 min。

2.1.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化微波-浸提法提取酵母胞內(nèi)的海藻糖提取工藝

確定以微波功率、微波時(shí)間、三氯乙酸濃度、三氯乙酸體積、浸提溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)，因?yàn)榻釙r(shí)間在120～150 min范圍內(nèi)對(duì)海藻糖的提取含量影響不大，所以選取150 min為最佳浸提時(shí)間。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可以看出，對(duì)海藻糖提取工藝最大的影響因素是微波功率，之后為微波時(shí)間、三氯乙酸濃度、三氯乙酸體積，影響最小的因素是浸提溫度。最優(yōu)組合為A2B2C3D1E3，最優(yōu)條件為：微波功率231 W、微波時(shí)間40 s、三氯乙酸濃度0.7 mol/L、三氯乙酸體積40 mL、浸提溫度55 ℃、浸提時(shí)間150 min。該工藝條件下得到的海藻糖含量為280.15 mg/g，比優(yōu)化前提高15.2%。

2.2 高產(chǎn)海藻糖面包酵母菌株的篩選

圖7 10 株面包酵母菌株高產(chǎn)海藻糖篩選Fig. 7 Comparison of intracellular trehalose contents in 10 baker’s yeast

根據(jù)圖7可以得出，7號(hào)面包酵母菌株胞內(nèi)海藻糖含量相對(duì)高于其他菌株，海藻糖含量增高可確保面包酵母下游工藝的順利進(jìn)行，因此確定7號(hào)菌株為最佳菌種并進(jìn)行斜面保藏，為下一步高密度培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)菌種。

2.3 50 L自吸式發(fā)酵罐溶氧反饋流加工藝

圖8 面包酵母50 L自吸式發(fā)酵罐中溶氧反饋流加Fig. 8 Wet yeast biomass during fed-batch fermentation with feedback control of dissolved oxygen concentration

如圖8所示，采用糖蜜溶氧反饋流加的發(fā)酵工藝用于50 L自吸式發(fā)酵罐培養(yǎng)面包酵母，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中只對(duì)碳源進(jìn)行流加，其他營(yíng)養(yǎng)源、維生素、生物素均進(jìn)行一次性補(bǔ)料。采用溶氧反饋流加的方式在溶氧快速上升的節(jié)點(diǎn)代表發(fā)酵罐中的酵母的呼吸作用開(kāi)始減弱，發(fā)酵液中的殘?zhí)菬o(wú)法保證發(fā)酵的順利進(jìn)行，此時(shí)開(kāi)始流加糖蜜，恰好可以對(duì)碳源進(jìn)行補(bǔ)充，給酵母生長(zhǎng)提供足夠的能量，在加入糖蜜后，可以觀察到溶氧量再次回到20%～30%之間的水平上，酵母的代謝情況正常，殘?zhí)橇颗c乙醇體積分?jǐn)?shù)也在正常允許范圍之內(nèi)，這種補(bǔ)料方式充分考慮到了酵母對(duì)于殘?zhí)堑睦脝?wèn)題，避免了殘?zhí)沁^(guò)多或者殘?zhí)遣蛔阍斐傻慕湍赴l(fā)生無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酒精的問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)證明，在50 L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)過(guò)程中殘?zhí)橇?、乙醇體積分?jǐn)?shù)小于1.5%，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后發(fā)酵液中的溶氧量保持在20%～30%內(nèi)。發(fā)酵完成時(shí)最大酵母濕質(zhì)量濃度為198.34 g/L。

2.4 50 L自吸式發(fā)酵罐稱量補(bǔ)料高密度培養(yǎng)

圖9 面包酵母稱質(zhì)量補(bǔ)料流加中酵母濕質(zhì)量濃度與溶氧情況Fig. 9 Wet yeast biomass and dissolved oxygen concentration during fed-batch fermentation with nutrient feeding

由圖9可以看出，溶氧反饋流加可以得到較大的酵母濕質(zhì)量濃度，但是如果需要進(jìn)一步提高菌體濃度，就應(yīng)探索新的流加方式，單一流加碳源已無(wú)法滿足面包酵母的生長(zhǎng)所需，尿素及磷酸二氫銨作為面包酵母的主要營(yíng)養(yǎng)源同樣應(yīng)該準(zhǔn)確的進(jìn)行流加補(bǔ)料，而通過(guò)溶氧反饋流加發(fā)現(xiàn)，溶氧量每小時(shí)都會(huì)有一次的快速上升。所以在溶氧反饋流加的基礎(chǔ)上提出了稱質(zhì)量流加補(bǔ)料工藝，該工藝是利用稱質(zhì)量系統(tǒng)將補(bǔ)料罐中的糖蜜、尿素、磷酸二氫銨按每小時(shí)已設(shè)定好的添加量進(jìn)行自動(dòng)流加，通過(guò)該工藝更加精確地控制了每小時(shí)酵母所需要的營(yíng)養(yǎng)源的質(zhì)量，充分消除了酵母發(fā)酵過(guò)程中的Crabtree效應(yīng)[27-30]。在培養(yǎng)過(guò)程中同樣測(cè)定殘?zhí)橇颗c乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酵母的代謝進(jìn)行側(cè)面評(píng)價(jià)。從圖9可以看出，面包酵母發(fā)酵過(guò)程中的溶氧量從接種進(jìn)發(fā)酵罐時(shí)開(kāi)始快速下降，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期之后溶氧量穩(wěn)定維持在20%～30%內(nèi)，酵母的有氧呼吸情況良好，菌體在培養(yǎng)22 h之后進(jìn)入平衡期，最大酵母濕質(zhì)量濃度為264.82 g/L，相比于溶氧反饋流加最佳菌體濕質(zhì)量濃度得到了進(jìn)一步的提高，同時(shí)酵母接入發(fā)酵罐后的適應(yīng)期相對(duì)減少，更快速的進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

圖10 面包酵母稱質(zhì)量補(bǔ)料流加中殘?zhí)橇颗c乙醇體積分?jǐn)?shù)變化Fig. 10 Changes in residual sugar and alcohol content during fedbatch fermentation with nutrient feeding

圖11 面包酵母稱質(zhì)量補(bǔ)料流加中通氣量變化Fig. 11 Change in oxygen flow rate during fed-batch fermentation with nutrient feeding

面包酵母發(fā)酵過(guò)程中的乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)橇孔兓€如圖10所示，可以看出面包酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后，殘?zhí)橇恳恢本S持在1.5%之內(nèi)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期，殘?zhí)橇拷咏?，這是由于面包酵母在此時(shí)菌體濕質(zhì)量濃度開(kāi)始大幅度增加，從發(fā)酵罐中也可以觀察到發(fā)酵液表面產(chǎn)生了一層濃密的泡沫，不斷有大的氣泡出現(xiàn)，酵母生長(zhǎng)旺盛，糖蜜的流加量達(dá)到最大。乙醇體積分?jǐn)?shù)雖然在4～12 h有小幅增加，但是一直可以控制在1.5%之內(nèi)，在發(fā)酵后期保持一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)可以提高酵母發(fā)酵力，對(duì)后期制備活性干酵母有一定的輔助效果。通氣量變化見(jiàn)圖11，在酵母處于遲滯期時(shí)，通氣量不宜過(guò)大，有可能造成發(fā)酵液的蒸發(fā)和菌體的損傷。在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后，由于酵母呼吸旺盛，為了保證溶氧足夠，將通氣量維持2 500 L/h，確保能為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的面包酵母供給足夠的氧氣。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，面包酵母的濕質(zhì)量濃度達(dá)到260 g/L以上，發(fā)酵液中的菌體數(shù)量為4.56×109CFU/mL，發(fā)酵力可達(dá)到675 mL/h，已可以初步達(dá)到面包酵母工業(yè)化發(fā)酵水平，因此將稱質(zhì)量補(bǔ)料流加方法作為面包酵母的高密度發(fā)酵方法作進(jìn)一步的研究。

2.5 面包酵母高密度培養(yǎng)工藝穩(wěn)定性

為確?，F(xiàn)有高密度培養(yǎng)工藝的可重復(fù)性與可行性，現(xiàn)進(jìn)行5 個(gè)批次的相同工藝的重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確定該工藝的穩(wěn)定性。如圖12所示，發(fā)酵過(guò)程中酵母最大濕質(zhì)量濃度平均為250 g/L，有良好的可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性較強(qiáng)，可以達(dá)到面包酵母高密度培養(yǎng)要求，能夠?qū)γ姘湍父呙芏扰囵B(yǎng)工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)給予一定的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

圖12 面包酵母高密度發(fā)酵工藝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig. 12 Stability of the high density fermentation process

2.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)水平對(duì)面包酵母高密度培養(yǎng)的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)是判斷面包酵母發(fā)酵過(guò)程中代謝情況的一個(gè)重要參考。維持低的乙醇體積分?jǐn)?shù)可以確定酵母進(jìn)行正常的有氧呼吸從而進(jìn)行大量的繁殖，但是在對(duì)數(shù)平衡期保持酵母液中含有一定的乙醇可以避免成熟的面包酵母發(fā)生老化，從而導(dǎo)致發(fā)酵力降低的問(wèn)題。由于面包酵母是用作生產(chǎn)活性干酵母的菌種，所以為確?；钚愿山湍傅馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，就應(yīng)充分保證酵母液中的酵母乳的質(zhì)量較高，才可以在下游的干燥造粒等工藝后仍然有良好的發(fā)酵力。目前已提高的面包酵母的細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量可從一方面保證其在下游工藝中的活性不受到太大損失。在高密度發(fā)酵階段如何確定菌體濕質(zhì)量濃度最大的同時(shí)，不造成發(fā)酵力的降低是一個(gè)新的問(wèn)題[31-33]。

圖13 高密度培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中不同乙醇體積分?jǐn)?shù)水平Fig. 13 High density culture experiments with different fixed levels of alcohol at 12 h

圖14 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)水平下面包酵母生長(zhǎng)情況對(duì)比Fig. 14 Comparison of wet yeast biomass at different alcohol levels

如圖13所示，控制12 h后乙醇體積分?jǐn)?shù)在設(shè)定值附近。由圖14可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)在1.0%以上時(shí)酵母最大濕質(zhì)量濃度均低于240 g/L，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在0.7%～1.0%之間，菌體最大濕質(zhì)量濃度可維持250 g/L，同時(shí)測(cè)定發(fā)酵力，發(fā)現(xiàn)面包酵母發(fā)酵力在0.7%和1.0%的乙醇體積分?jǐn)?shù)水平線上分別為653 mL/h和679 mL/h，均可達(dá)到質(zhì)量要求，其他水平上酵母發(fā)酵力均小于600 mL/h，效果不理想。因此實(shí)驗(yàn)中可控制發(fā)酵過(guò)程中乙醇體積分?jǐn)?shù)為0.7%～1.0%，可有效提高最大酵母濕質(zhì)量濃度在250 g/L左右，并且可以確保面包酵母發(fā)酵后的發(fā)酵力達(dá)到650 mL/h以上。

面包酵母在50 L自吸式發(fā)酵罐中培養(yǎng)，通過(guò)稱質(zhì)量補(bǔ)料的高密度培養(yǎng)方法最大酵母濕質(zhì)量濃度從198.34 g/L進(jìn)一步提高到264.82 g/L，流加工藝的改進(jìn)優(yōu)化有效提高了酵母的菌體產(chǎn)量，相比于最初的發(fā)酵工藝最大菌體濕質(zhì)量濃度提高了33.52%。

3 結(jié) 論

提高酵母胞內(nèi)海藻糖含量可有效提高活性干酵母在下游干燥造粒過(guò)程中對(duì)于高溫和迅速脫水等情況的耐受性。陳麗君等[34]通過(guò)對(duì)比不同海藻糖含量的面包酵母菌體的耐高溫性能、耐酒精性能、抗凍性能等，研究發(fā)現(xiàn)海藻糖含量越高的酵母菌耐受性越高。宋曉麗[35]通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母中海藻糖提取工藝，得到最優(yōu)酵母中海藻糖得率為251.86 mg/g。酵母的高密度培養(yǎng)一直是發(fā)酵工業(yè)中的一個(gè)研究重點(diǎn)，趙曉麗等[36]通過(guò)對(duì)釀酒酵母進(jìn)行高密度有氧發(fā)酵研究，發(fā)酵結(jié)束后酵母干質(zhì)量濃度為9.63 g/L。榮博涵等[37]研究了對(duì)比了釀酒酵母中殘?zhí)欠答伔峙a(bǔ)料與連續(xù)流加補(bǔ)料方式對(duì)釀酒酵母高密度發(fā)酵的影響，通過(guò)控制不同方殘?zhí)翘荻?，發(fā)酵30 h后，最大酵母干質(zhì)量濃度為29.29 g/L。將高產(chǎn)海藻糖酵母菌株與高密度發(fā)酵相結(jié)合進(jìn)行研究，能一定程度上提高活性干酵母的產(chǎn)品質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用單因素及正交試驗(yàn)方法優(yōu)化了微波-浸提法提取酵母胞內(nèi)海藻糖的工藝參數(shù)，確定了具體的工藝條件為：微波功率231 W、微波時(shí)間40 s、三氯乙酸濃度0.5 mol/L、三氯乙酸體積40 mL、浸提溫度40 ℃、浸提時(shí)間150 min。該工藝條件下得到的海藻糖含量為280.15 mg/g，比優(yōu)化前提高15.2%。以酶-DNS法測(cè)定提取后的海藻糖含量，通過(guò)菌種篩選出一株高產(chǎn)海藻糖菌株并對(duì)其進(jìn)行高密度培養(yǎng)工藝的研究，以稱質(zhì)量流加作為面包酵母在50 L自吸式發(fā)酵罐中的高密度培養(yǎng)方式，發(fā)酵后的面包酵母最大濕質(zhì)量濃度為264.82 g/L，相比于溶氧反饋流加培養(yǎng)后的最大濕質(zhì)量濃度提高了33.52%。且該工藝穩(wěn)定性良好，發(fā)酵過(guò)程中將乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在0.7%～1.0%之間，將有效提高酵母濕質(zhì)量濃度且保證其發(fā)酵力在650 mL/h以上，發(fā)酵液中的菌體數(shù)量為4.56×109CFU/mL，最大酵母干質(zhì)量濃度可達(dá)到58.32 g/L，可達(dá)到目前國(guó)內(nèi)面包酵母高密度培養(yǎng)較高水平。

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