花青素與大豆分離蛋白非共價/共價作用對其界面功能性質(zhì)的影響

李 楊，孫紅波，董濟萱，劉英杰，畢 爽，張巧智，江連洲，隋曉楠*

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是目前研究報道中唯一含有9 種必需氨基酸且含量滿足人體需求的植物蛋白，是一種公認的全價蛋白質(zhì)[1-2]，由于其具有豐富的營養(yǎng)價值與優(yōu)良的功能特性，大豆分離蛋白被廣泛地應用于乳化劑、起泡劑等不同食品加工領域中。為拓寬其應用前景與開發(fā)價值，大豆分離蛋白的天然改性目前已經(jīng)成為學者們的研究熱點[3-4]?；ㄇ嗨刈鳛橐环N黃酮類植物色素，由于其具有抗氧化、抗炎等多種性質(zhì)，有助于預防心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)問題等疾病[5-6]。由于花青素是一種天然小分子活性化合物，可以將其引入蛋白質(zhì)中發(fā)生相互作用，形成具有重要功能性質(zhì)的復合體系，進而影響蛋白物化功能[7]。事實上，在食品加工、生產(chǎn)等環(huán)節(jié)中，蛋白質(zhì)等生物大分子都不可避免的受到來自這類小分子物質(zhì)的影響。蛋白可與多酚發(fā)生相互作用，其結(jié)合方式主要為共價/非共價結(jié)合。非共價作用主要包括疏水相互作用，范德華力和氫鍵等這些相對較弱的作用類型[8-9]。酚類物質(zhì)與蛋白之間的共價作用主要是在堿性條件下，通過酚類化合物的氧化形成相應的醌類[10]，這種醌類會進一步與蛋白質(zhì)鏈中的氨基酸殘基反應[11]。目前已有文獻對多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用體系進行了部分研究，但未能清晰地解釋復合體系結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)之間的變化規(guī)律。多酚與蛋白質(zhì)的非共價作用有助于不同的生物活性，并改變蛋白的界面性質(zhì)與起泡穩(wěn)定性[12-13]。Jia Zhenbao等[14]研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白可以在堿性條件下與兒茶素共價交聯(lián)，酚類基團可以引起蛋白二級及三級結(jié)構(gòu)的變化，并改善蛋白起泡和乳化性能。張冬[15]探究了矢車菊素-3-葡萄糖苷與牛血清白蛋白相互作用的機制，研究發(fā)現(xiàn)這種類黃酮物質(zhì)易被蛋白“綁定”，從而提高植物蛋白的生理活性。茶多酚與大豆分離蛋白之間較強的相互作用會引起大豆分離蛋白構(gòu)象發(fā)生改變[16]。然而，針對大豆蛋白與花青素相互作用對其功能特性的影響尚不清楚。

因此，本實驗主要研究對比花青素與大豆分離蛋白經(jīng)非共價結(jié)合/共價交聯(lián)機制對其復合體系功能特性的影響，從而最大限度地發(fā)揮復合體系中大豆分離蛋白的功能特性。本實驗采用2 種作用條件使大豆分離蛋白與花青素復合對起泡及乳化特性進行對比分析，對大豆蛋白在食品領域中的應用具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白由實驗室自制；葵花油 市購；花青素黑米提取物 山西太極唐代科技有限公司；大豆哈爾濱高科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠；正己烷（分析純） 天津北科化學品有限責任公司；所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器有限公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；JJ-1增力電動攪拌器 江蘇金城國勝儀器廠；Allegra64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；BX41正置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；E2695高效液相色譜 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考Speroni等[17]的制備方法。將脫脂豆粕分散在去離子水中（1∶10，m/m），用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 8，經(jīng)攪拌2 h后，將懸浮液9 500×g離心30 min，取其上清液用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物水洗3 次后，經(jīng)6 500×g離心30 min，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至蛋白溶液中性即可，將此蛋白溶液凍干并研磨，即可獲得大豆分離蛋白。

1.3.2 花青素的純化與定量

根據(jù)Sui Xiaonan等[18]的方法進行花青素的純化。首先將黑米提取物溶解在蒸餾水中，抽濾除去溶液中的不溶性雜質(zhì)。隨后將溶液通過固相萃取使花青素溶液被完全吸附，分別用2 個柱體積酸化水和2 個柱體積的乙酸乙酯去除糖、酸和多酚類化合物（如酚酸和黃酮），然后用酸化的甲醇洗脫吸附柱從而獲得花青素溶液。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去溶液中的甲醇，即可得到純化的花青素提取物。利用高效液相色譜法測定花青素的含量[19]，將純化的花青素提取物過0.45 μm濾膜使用C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行高效液相色譜分析，流量為1 mL/min，溫度為25 ℃，梯度洗脫程序參考Sadilova等[20]的方法測定花青素質(zhì)量分數(shù)為25%（為方便計算，本實驗統(tǒng)一使用黑米中含量較多的矢車菊素-3-葡萄糖苷相對分子質(zhì)量為花青素的相對分子質(zhì)量近似處理）。

1.3.3 樣品的配制

參考Nagy等[9]的方法稍作修改，將大豆分離蛋白粉末完全溶解于磷酸鹽緩沖液中（10 μm，pH 7.4）配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，將花青素質(zhì)量濃度（0.5、1、2 mg/mL）按比例分別溶于蛋白溶液在室溫條件下混合絕氧攪拌2 h，由此可得大豆分離蛋白-花青素非共價結(jié)合復合物。參考Kroll等[21]的方法稍作修改，將大豆分離蛋白粉末完全溶解于磷酸鹽緩沖液中（10 μm，pH 7.4）配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的大豆分離蛋白溶液，用0.5 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，將花青素質(zhì)量濃度（0.5、1、2 mg/mL）按比例分別溶于蛋白溶液在室溫條件下混合攪拌24 h，由此可得大豆分離蛋白-花青素共價交聯(lián)復合物。其中，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白溶液作為空白對照，各樣品處理條件見表1。

表1 花青素與大豆分離蛋白復合物Table 1 SPI and anthocyanin complexes

1.3.4 起泡性及起泡穩(wěn)定性

參照Aewsiri等[22]的方法測定起泡性能并稍作修改。樣品依次用高速均質(zhì)機以17 500 r/min連續(xù)均質(zhì)3 次，每次30 s，將泡沫迅速轉(zhuǎn)入量筒中記錄初始泡沫體積，在室溫條件下靜止10、20、30 min后記錄其泡沫體積。其中所有實驗平均測量3 次。其起泡特性和起泡穩(wěn)定性按公式（1）、（2）計算：

式中：V為均質(zhì)前溶液體積/mL；V0為均質(zhì)后初始泡沫體積/mL；Vt為靜止10、20、30 min后泡沫體積/mL。

1.3.5 乳化性及乳化穩(wěn)定性

參考Pearce等[23]的方法稍作修改。將上述樣品溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋（10 mmol/L，pH 7.0）至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，將稀釋的樣品以3∶1（V/V）溶解于葵花油中，使用高剪切均質(zhì)機以10 000 r/min均質(zhì)1 min形成乳狀液，立即從其乳狀液底部提取50 μL的乳液分散于0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液稀釋至100 倍。經(jīng)旋渦振蕩后用分光光度法在波長500 nm處測定樣品的吸光度A500nm，用相同濃度十二烷基硫酸鈉溶液作為空白對照。經(jīng)10 min后再次測量其吸光度。其中所有實驗平均測量3 次。

乳化特性和乳化穩(wěn)定性按公式（3）和（4）計算：

式中：DF為稀釋倍數(shù)（100）；θ為油相體積分數(shù)（1/4）；L為比色杯厚度（1 cm）；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（10 g/mL）；A0、A10為乳狀液在0、10 min的吸光度；T10-T0＝10 min。

1.3.6 正置顯微鏡觀察

樣品乳液制備后，用膠頭滴管吸取一滴新鮮復合乳液樣品，置于顯微鏡載物臺上，將載玻片用乙醇浸泡后固定樣品，在100 倍正置光學顯微鏡下進行觀察，用CCD照相機截取圖像，利用電腦數(shù)字圖像軟件處理圖片。

1.3.7 巰基含量的測量

根據(jù)Ellman等[24]的方法稍做改動。在0.5 mL的樣品溶液中加入2.5 mL含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖液和0.02 mL含有1% 5,5’-二硫雙-2-硝基苯甲酸的Tris-甘氨酸緩沖液，將其置于40 ℃水浴中保溫25 min。利用雙光束分光光度計在波長412 nm處測定吸光度。Tris-甘氨酸緩沖液作為空白對照。參考文獻[25]計算巰基含量。

1.3.8 三維熒光光譜分析

大豆分離蛋白與花青素之間的相互作用利用三維熒光光譜測定，參照Zhang Yezhong等[26]的方法，將樣品分別稀釋50 倍，使蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，取稀釋樣品分別置于石英比色皿中測定。其中，三維熒光光譜的連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長（λEm）為200～500 nm，起始激發(fā)波長（λEx）為200 nm，增長間隔為10 nm，掃描16 條曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

實驗中每組數(shù)據(jù)重復3 次，利用Origin 8.0軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS V17.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析及相關(guān)性分析，其中P值小于0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 起泡特性與起泡穩(wěn)定性

圖1 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對蛋白起泡特性與起泡穩(wěn)定性的影響Fig. 1 Effects of anthocyanin binding to SPI on its foam expansion and foam stability

蛋白質(zhì)溶液經(jīng)快速打攪使大量氣體進入溶液中，降低其表面張力后形成泡沫的能力稱作蛋白的起泡性[27]。如圖1所示，花青素的加入，對其起泡性和起泡穩(wěn)定性都發(fā)生了顯著的影響。未加入花青素的蛋白溶液其起泡特性和起泡穩(wěn)定性較低，在非共價結(jié)合（pH 7.4、2 h）和共價交聯(lián)（pH 9.0、24 h）處理條件下，隨著花青素質(zhì)量濃度的增大，復合液中蛋白的起泡特性和起泡穩(wěn)定性均表現(xiàn)出一定程度的升高。該結(jié)果與Odríguez等[13]的研究結(jié)果類似，蛋白-多酚復合物可以表現(xiàn)出更高的固有黏度由此有效地降低排水速度，產(chǎn)生更穩(wěn)定的泡沫。多酚類物質(zhì)的加入降低了蛋白界面的表面壓力，使得蛋白結(jié)構(gòu)展開，并且與蛋白發(fā)生相互作用，使得界面薄膜變得更加穩(wěn)定[27]。此外，樣品6的起泡特性比樣品3提高了16.52%，這可能是由于共價交聯(lián)結(jié)構(gòu)可以有效地提高蛋白在氣/液表面的展開，形成更多泡沫網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)并提高界面彈性，通過抑制蛋白聚集和歧化增強了泡沫的形成[28-29]。蛋白質(zhì)分子顆粒的大小是影響起泡特性的關(guān)鍵因素之一，適當分子質(zhì)量的可溶性聚合物有助于改善起泡特性[14]。

2.2 乳化特性與乳化穩(wěn)定性

圖2 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對蛋白乳化特性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig. 2 Effects of anthocyanin binding to SPI on its emulsifying properties and emulsion stability

大豆分離蛋白的乳化特性是最重要的功能性質(zhì)之一，主要包括乳化活性和乳化穩(wěn)定性。乳化活性指蛋白質(zhì)-花青素復合物在形成油水界面上促進形成穩(wěn)定界面的能力，乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)-花青素復合物乳狀液維持形成小液滴的抗應變能力，可分別用乳化特性和乳化穩(wěn)定性表達其測定結(jié)果[30]。如圖2所示，與未經(jīng)處理的蛋白溶液相比，在非共價結(jié)合（pH 7.4、2 h）和共價交聯(lián)（pH 9.0，24 h）處理條件下，復合液的乳化特性明顯逐步升高，其中，樣品6的乳化特性相比于空白組增大了71.94 %，樣品3的乳化特性相比于空白組增大64.93%，表明由于花青素的加入提升了溶液的乳化活性。這與胡思等[31]的研究結(jié)果一致，適量茶多酚的添加可增強小麥面筋蛋白在O/W界面上的牢固性，形成較穩(wěn)定的界面膜。部分活化的多酚羥基與蛋白質(zhì)殘基結(jié)合從而提高了蛋白的乳化能力。并且在堿性條件下酚類小分子的出現(xiàn)，可以減少油相和水相之間的界面張力[14]。以上結(jié)果表明花青素可能改變了蛋白質(zhì)表面性質(zhì)，并且不可逆的共價結(jié)合更有助于多酚類物質(zhì)對蛋白質(zhì)的綁定，由此導致了相應乳化特性的提高。此外，花青素的加入使得乳化穩(wěn)定性指數(shù)在不同程度上有所增加，這顯示了花青素-蛋白復合物比空白樣具有更好的乳化穩(wěn)定性。多酚的加入會掩蓋部分蛋白的解折疊，限制了蛋白質(zhì)的運動，提高乳液穩(wěn)定性并延長貯藏時間[32]。

2.3 復合物乳液光學顯微鏡結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

圖3 復合物乳液光學顯微鏡結(jié)構(gòu)圖Fig. 3 Microstructure of composite emulsions

如圖3所示，未加入花青素的蛋白乳液體系中乳滴大小分布不均，圖3中有部分乳滴發(fā)生聚集，這可能是在該條件下蛋白質(zhì)在水相溶液中乳滴較大，極易產(chǎn)生不溶性聚集體。樣品1、2、4乳液體系中乳滴形狀相比于空白蛋白乳液體系有所減小，但仍有部分不均一的乳滴存在。樣品3乳液體系中乳滴較為均一，但部分乳狀液未被油脂包裹分散在外。樣品5、6乳液體系中乳滴大小分散均勻且均一，油脂包裹乳液情況良好，乳液穩(wěn)定?；ㄇ嗨氐募尤胧沟脧秃衔镏械鞍兹榈瘟綔p小，分布均勻，顯示出了較好的乳化能力，有助于提高乳液的穩(wěn)定性[33]。復合乳液體系微觀結(jié)構(gòu)的改變與乳化活性和穩(wěn)定性的結(jié)果一致。

2.4 巰基含量的分析

表2 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對蛋白巰基含量的影響Table 2 Effect of anthocyanin binding to SPI on its sulfhydryl content

巰基作為蛋白質(zhì)中的重要功能基團之一，具有較高的生物活性，對蛋白質(zhì)在面筋、凝膠的形成中起著重要的作用[34]。由表2可知，蛋白質(zhì)中巰基含量經(jīng)2 種相互作用隨著花青素含量的增加而有所改變。與未加入花青素的蛋白相比，花青素的引入降低了大豆分離蛋白中的巰基含量，花青素作為水溶性物質(zhì)含有大量的羥基基團，蛋白中的巰基基團可以與花青素中的羥基相結(jié)合，改變蛋白的化學結(jié)構(gòu)[35]。并且在所有樣品中，樣品4～6復合物中的巰基含量下降尤為明顯。隨著花青素的加入，巰基基團含量不斷下降，這可能是由于部分巰基被氧化成二硫鍵或是二硫鍵相互轉(zhuǎn)換。此外，花青素與蛋白在堿性處理條件下產(chǎn)生的醌類物質(zhì)也可直接與巰基發(fā)生相互作用形成C—S共價鍵，從而極大的降低了巰基在蛋白中的含量[36]。

2.5 三維熒光光譜分析

圖4 花青素與大豆分離蛋白結(jié)合對蛋白影響的三維熒光光譜分析圖Fig. 4 Three dimensional fluorescence spectral analysis of the effect of anthocyanin binding to SPI on protein structure

三維熒光光譜可以通過表達蛋白的熒光信息，從而對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行研究[37]。峰a（λEx=λEm）為瑞利散射峰，峰b（λEm=2λEx）是二階散射峰[38]。由圖4可知，在λEx=280 nm，λEm=340 nm處主要是蛋白質(zhì)中色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）殘基的特征峰（峰1）[39]。加入花青素后特征峰處的顏色變淺，等高線逐漸稀疏，與未加入花青素的蛋白溶液相比，樣品1的峰1處熒光強度降低了78.51%，樣品4在此處的熒光強度降低了87.43%。這表示大豆分離蛋白熒光強度隨著花青素的加入逐漸降低。該結(jié)果表明大豆分離蛋白和花青素之間具有較強的結(jié)合能力。表明蛋白質(zhì)與花青素之間的相互作用在不斷增強，蛋白質(zhì)中部分Trp和Tyr殘基的疏水基團被掩埋在花青素-花青素復合物的疏水區(qū)域中。此外，樣品4～6中復合物對大豆分離蛋白的猝滅能力比樣品1～3表現(xiàn)的更強，該結(jié)果表明花青素經(jīng)堿性氧化生產(chǎn)的醌類物質(zhì)與部分氨基酸殘基結(jié)合，導致了大豆分離蛋白與花青素發(fā)生了額外的共價交聯(lián)作用。此外，峰2（λEx=230 nm，λEm=350 nm），它主要代表了多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的特征峰[39]。在添加花青素后復合物中該區(qū)域的面積逐漸減小，表明該復合物使得蛋白質(zhì)多肽鏈解折疊隨之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。以上2 個特征峰熒光強度的降低表明多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用可以誘導蛋白質(zhì)多肽鏈的輕微解折疊[26]。

3 結(jié) 論

采用共價及非共價處理手段探究其對大豆分離蛋白與花青素相互作用及復合物功能性質(zhì)的影響。采用起泡特性及起泡穩(wěn)定性、乳化特性及乳化穩(wěn)定性分析方法，從宏觀上測定蛋白質(zhì)-花青素復合體系的功能性質(zhì)，通過光學顯微鏡的觀察微觀分析復合乳化體系的結(jié)構(gòu)，巰基含量的測定和三維熒光光譜分析對解析復合體系結(jié)構(gòu)提供了重要的指導信息。

研究得出以下結(jié)論：花青素的加入能夠改善大豆分離蛋白復合體系的乳化特性與起泡特性等功能性質(zhì)，且大豆分離蛋白部分功能特性在共價處理條件下的提高程度高于非共價處理條件。復合乳液乳滴大小分散均勻，油脂包裹乳液情況有所改善，乳液均一穩(wěn)定，提高了乳液的乳化穩(wěn)定性。結(jié)果表明花青素的加入改變蛋白界面特性，使界面薄膜變得更加穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)巰基基團結(jié)果表明，復合物中巰基含量經(jīng)非共價/共價作用影響隨著花青素質(zhì)量濃度的增加而提高，并且在共價作用下產(chǎn)生的醌類物質(zhì)極大降低了巰基在蛋白中的巰基含量。

隨著花青素質(zhì)量濃度的增加，復合物溶液的熒光強度明顯降低。結(jié)果表明蛋白質(zhì)與花青素之間的相互作用在不斷增強，使得發(fā)色基團被不斷猝滅，蛋白質(zhì)多肽鏈解折疊隨之結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

以上結(jié)果表示多酚類物質(zhì)對植物蛋白的起泡及乳化特性有不可忽視的影響。對于植物蛋白改性與深加工都有重要意義。參考文獻：

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