三株生防酵母菌對Botrytis cinerea防治效果研究

王傲雪，吳文鼎，關　鑫，張　瑤，陳秀玲

（1.東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱　150030；2.東北農業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱　150030）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）果肉多汁、口味酸甜，富含番茄紅素、有機酸、可溶性糖、多種氨基酸、維生素和礦物質，是我國主要蔬菜種類之一[1]。番茄灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的全球性病害，灰葡萄孢菌主要侵染番茄莖、葉、花，并在貯藏運輸過程中侵染番茄果實，導致果實腐爛病敗[2-3]。目前，應對果蔬采后病害主要有物理防治、化學防治和生物防治等方法，雖然物理和化學方法可高效防治果蔬采后病害，但物理方法成本較高、不易推廣，化學方法易使致病菌產生抗藥性，藥物殘留危害健康，利用生物方法防治果蔬采后病害已成為研究熱點[4]。生物防治所用拮抗菌包括細菌、小型絲狀真菌和酵母菌，其中酵母菌安全性高，生長繁殖迅速，對環(huán)境適應性強，受化學藥劑影響小，可配合化學藥劑共同施用，被廣泛用于果蔬采后病害防治。目前已發(fā)現(xiàn)多種對果蔬病害有防治效果的酵母菌，如抗蘋果青霉病的Trichosporon pullulans[5]，抗蘋果灰霉病的Candida saitoana[6]，抗草莓灰霉病和根霉病的Pichia caribbica[7]，抗柑橘綠霉病的Kloeckera apiculata[8]，抗哈密瓜細菌性果斑病的Pichia anomala[9]等。

本研究通過活體試驗方法，比較3株生防酵母菌對番茄灰霉病防治效果，結合生防酵母菌誘導番茄抗灰霉病防御相關酶活性及活性氧含量測定，探討生防酵母菌生防機制，為開發(fā)利用生防酵母菌防治番茄灰霉病提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌株

生防酵母菌 Ca63（Cryptococcus albidus）、Ca64（Cryptococcus albidus）、yett1006（Candida parapsilosis）和灰葡萄孢菌t08016b（Botrytis cinerea）均由東北農業(yè)大學園藝園林學院番茄課題組保存。

1.1.2供試番茄

供試番茄商品名為“小毛粉”，挑選尺寸顏色一致，平均單果重95 g，無病害及機械損傷番茄果實開展試驗。

1.2　方法

1.2.1供試酵母菌及病原菌懸液制備

將3株生防酵母菌分別接種YPD固體培養(yǎng)基活化，挑取其中單菌落接種NYDB液體培養(yǎng)基，28℃200 r·min-1振蕩培養(yǎng)20 h，將培養(yǎng)液以2%（V/V）比例接種100 mL NYDB培養(yǎng)基，28℃200 r·min-1振蕩培養(yǎng)20 h，將發(fā)酵后酵母菌液10 000 r·min-1離心10 min，收集菌體沉淀，0.85%無菌生理鹽水將菌體配制成試驗所需濃度菌懸液。

挑取灰葡萄孢菌t8016b菌絲接種PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7～14 d，至灰葡萄孢菌大量產孢，刮下灰葡萄孢菌并用無菌水（含0.05%Tween-20）沖洗菌體，雙層紗布過濾去除菌絲，并將濾液配制成試驗所需濃度孢子懸浮液。

1.2.2生防酵母菌對采后番茄果實貯藏效果影響

將番茄果實分別在1×108cfu·mL-13株生防酵母菌菌懸液中浸泡4 min（對照組浸泡無菌水），取出后自然晾干，套袋，于室溫貯藏20 d。貯藏過程中，每隔5 d觀察不同處理組番茄果實腐爛情況，貯藏期結束時，測定番茄果實各項品質指標：①可溶性固形物含量采用手持式折光儀測定；②可滴定酸含量采用酸堿滴定法測定；③維生素C含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定。每個處理重復3次。

1.2.3生防酵母菌對番茄灰霉病離體果實防治效果

番茄果實等距離打洞1 cm（直徑）×1 cm（深），設置對照組及4個處理組：A，只接種1×108cfu·mL-1生防酵母菌；B，先接種1×108cfu·mL-1生防酵母菌，5 h后接種1×106cfu·mL-1灰葡萄孢菌；C，先接種1×106cfu·mL-1灰葡萄孢菌，5 h后接種1×108cfu·mL-1生防酵母菌；D，只接種1×106cfu·mL-1灰葡萄孢菌；E，只接種無菌水（Control）。將處理后番茄套袋，于室溫貯藏，每天觀察統(tǒng)計番茄發(fā)病情況，每個處理重復3次。

以病斑擴展面積作為果實發(fā)病級別指標：0級，果實不發(fā)??；1級，病斑面積＜1/4；2級，1/4＜病斑面積＜1/2；3級，1/2＜病斑面積＜3/4；4級，病斑面積＞3/4。

光強度模塊BH1750FVI傳感器內置16bitAD轉換器直接數字輸出，接近于視覺靈敏度的分光特性可對廣泛的亮度進行1勒克斯的高精度測定，標準NXP IIC通信協(xié)議。

病情指數=100×∑（各級發(fā)病果實數量×相應級數）/（調查總數×最高發(fā)病級數）。

1.2.4生防酵母菌對番茄灰霉病誘導抗性

設置對照組及4個處理組，采用反復噴施方式接種番茄果實：A'，只接種1×108cfu·mL-1生防酵母菌；B'，先接種1×108cfu·mL-1生防酵母菌，晾干后接種1×107cfu·mL-1灰葡萄孢菌；C'，先接種1×107cfu·mL-1灰葡萄孢菌，晾干后接種1×108cfu·mL-1生防酵母菌；D'，只接種1×107cfu·mL-1灰葡萄孢菌；E'，只接種無菌水（Control）。將處理后番茄果實晾干，套袋，于室溫貯藏。處理后分別于1、2、3、4、5、6、7 d取果實檢測防御相關酶活性及信號分子。每個處理重復3次。

①苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定參照馬桂珍方法[10]。②多酚氧化酶（PPO）活性測定參照朱廣廉[11]方法。③過氧化物酶（POD）活性測定參照蒼晶等方法[12]。④過氧化氫（H2O2）含量測定采用過氧化氫（H2O2）測試盒（南京建成生物工程研究所）測定。⑤超氧陰離子（O2-）含量測定參照王愛國方法[13]。

2　結果與分析

2.1　生防酵母菌對采后番茄果實貯藏效果影響

由圖1可知，20 d貯藏期內，分別由3株生防酵母菌菌懸液浸泡處理的番茄果實腐爛率始終顯著低于對照組（P＜0.05）。至貯藏期結束，對照組番茄果實幾乎全部腐爛，而由3株生防酵母菌處理的番茄果實好果率約40%，其中菌株Ca64處理效果最好，好果率達45.83%。說明3株生防酵母菌均有較好貯藏防腐效果，其中菌株Ca64防腐效果最好。

至貯藏期結束，測定番茄果實相關品質指標，結果如圖2所示。隨貯藏時間延長，采后番茄水分散失和營養(yǎng)物質消耗逐漸加劇，至貯藏期結束，對照組番茄果實損耗率達16.08%，而由3株生防酵母菌處理的番茄果實損耗率僅為6%～8%，由3株生防酵母菌菌懸液浸泡處理的番茄果實損耗率顯著低于對照組（P＜0.05）。說明3株生防酵母菌均可抑制采后番茄自然損耗，延長番茄貯藏期。番茄營養(yǎng)品質重要指標包括可溶性固形物、可滴定酸和維生素C含量，至貯藏期結束，各處理組與對照組間3種營養(yǎng)成分含量并無顯著差異，說明3株生防酵母菌菌懸液浸泡處理并未對番茄果實內部營養(yǎng)品質產生不良影響。

2.2　生防酵母菌對番茄灰霉病離體果實防治效果

如圖3和表1、2所示，3株生防酵母菌均能在果實傷口處對番茄灰霉病菌產生較好抑制作用。同一生防酵母菌不同處理方式之間，病情指數和防治效果均差異顯著（P＜0.05）。處理B和處理C中，與生防酵母菌同孔生長的灰霉病菌生長狀態(tài)均弱于處理D，且病情指數顯著低于處理D（P＜0.05）。與處理C相比，處理B番茄果實病斑擴展速度較慢，病情指數較低，生防酵母菌對灰霉病菌防治效果顯著好于處理C（P＜0.05）。說明生防酵母菌與灰霉病菌之間存在競爭關系，生防酵母菌存在影響灰霉病菌生長繁殖，先接種生防酵母菌使其迅速生長繁殖，占據有利空間，從而抑制灰霉病菌生長。至貯藏期結束，處理A大部分番茄果實仍保持較好品質特征，而處理E番茄果實已嚴重腐敗，病情指數顯著高于處理A（P＜0.05）。3株生防酵母菌單一菌液處理對番茄傷口處灰霉病菌防治效果均達90%以上。說明生防酵母菌可在傷口處迅速增殖，形成致密菌膜，阻止其他病原菌入侵，顯著抑制番茄果實傷口處發(fā)生病害。

不同生防酵母菌處理番茄果實病情指數不同。處理B3株生防酵母菌之間病情指數差異顯著（P＜0.05），其中菌株Ca64病情指數最低；處理C菌株Ca63和Ca64病情指數顯著低于菌株yett1006（P＞0.05）。處理B和處理C中，3株生防酵母菌對番茄灰霉病防治效果并無顯著差異（P＞0.05），其中菌株Ca64防治效果略高于其他兩種菌株。

圖2　3株生防酵母菌對番茄果實貯藏品質影響Fig.2　Effects of the nutrition substance content of tomato fruits treated with three biocontrol yeasts

圖3　生防酵母菌對番茄灰霉病離體果實防治效果Fig.3　Effect of three biocontrol yeasts for controlling B.cinerea of tomato fruits in vivo

表1　病情指數Table 1　DI of tomato fruits

表2　 防治效果Table 2 Control effects of tomato fruits

2.3　生防酵母菌對番茄灰霉病誘導抗性

2.3.1苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性變化

由圖4可知，與對照組相比，各處理組番茄果實PAL活性總體呈上升趨勢，且均在第2天達峰值。處理D'PAL活性提高小于其他處理，貯藏期結束時基本與對照組相同。處理A'、B'、C'與對照組相比PAL活性顯著上升（P＜0.05），其中處理C'PAL活性高于其他兩組。說明接種灰霉病菌和噴施生防酵母菌均可誘導番茄果實提高PAL活性，接種灰霉病菌激發(fā)番茄果實本身防御機制，僅能短暫提高PAL活性，對提高番茄抗病能力無明顯作用，噴施生防酵母菌可提高番茄果實PAL活性，并使其維持較高水平，提高番茄抗病能力。單獨接種3株生防酵母菌時，菌株Ca64處理的PAL活性最高增加75%，對番茄果實PAL活性誘導高于其他兩種菌株。

圖4　不同處理對番茄果實PAL活性影響Fig.4　Effect of different treatments on PAL activities of tomato fruit

2.3.2多酚氧化酶（PPO）活性變化

由圖5可知，與對照組相比，各處理組番茄果實PPO活性總體呈上升趨勢，貯藏期第1天，各處理組PPO活性均表現(xiàn)出明顯提高，并在第2天達峰值且顯著高于對照組（P＜0.05）。處理D'PAL活性提高小于其他處理組，貯藏期結束時基本與對照組相同。處理A'、B'、C'整個貯藏期PPO活性顯著高于對照組和處理D'。說明接種灰霉病菌和噴施生防酵母菌均可誘導番茄果實提高PPO活性，接種灰霉病菌激發(fā)番茄果實防御機制，僅短暫提高PPO活性，對提高番茄抗病能力無明顯作用，噴施生防酵母菌可提高番茄果實PPO活性，并使其維持較高水平，進而提高番茄抗病能力。單獨接種3株生防酵母菌時，菌株Ca64處理的PPO活性比對照組提高87.5%，對番茄果實PPO活性誘導最顯著，菌株Ca63和yett1006分別提高75%和62.5%。

圖5　不同處理對番茄果實PPO活性影響Fig.5　Effect of different treatments on PPO activities of tomato fruit

2.3.3過氧化物酶（POD）活性變化

由圖6可知，與對照組相比，各處理組番茄果實POD活性呈上升趨勢，貯藏期第1天，各處理組POD活性均顯著高于對照組（P＜0.05），處理C'POD活性最高。處理A'、B'、C'第2天達峰值，處理D'第3天達峰值，對照組第4天達峰值。除貯藏期結束時處理D'POD活性略有上升外，其他時期處理D'POD活性始終低于處理A'、B'、C'。說明接種灰霉病菌和噴施生防酵母菌均可誘導番茄果實提高POD活性，接種灰霉病菌可逐漸提高番茄POD活性，使番茄果實貯藏期結束時POD活性維持較高水平，而噴施生防酵母菌則迅速提高番茄POD活性，增強番茄清除體內活性氧能力，提高其抗病能力。單獨接種3株生防酵母菌時，菌株Ca64處理的POD活性增加78.82%，對番茄果實POD活性誘導最顯著，菌株yett1006和Ca63分別提高61.41%和21.60%。

圖6　不同處理對番茄果實POD活性影響Fig.6　Effect of different treatments on POD activities of tomato fruit

2.3.4過氧化氫（H2O2）含量變化

由圖7可知，對照組未經處理的正常番茄果實H2O2含量較低，且相對穩(wěn)定，貯藏期后期H2O2含量緩慢升高。各處理組貯藏期前兩天H2O2含量相對穩(wěn)定但均高于對照組，第3天H2O2含量迅速升高，達峰值后持續(xù)降低，至貯藏期結束H2O2含量明顯低于對照組。處理C'H2O2含量顯著高于其他處理組（P＜0.05）。說明在貯藏期前期，接種灰霉病菌和噴施生防酵母菌均可誘導番茄果實提高H2O2含量，此時H2O2作為信號分子激發(fā)番茄對病菌防御能力，并對病菌產生抑制和毒害作用，至貯藏期后期，噴施生防酵母菌可誘導番茄果實提高抗氧化酶活性，清除番茄體內大量積累的H2O2，使番茄免受活性氧毒害。

圖7　不同處理對番茄果實H2O2影響Fig.7　Effect of different treatments on H2O2of tomato fruit

2.3.5超氧陰離子（O2-）含量變化

由圖8可知，對照組O2-含量始終處于較低水平，各處理組在貯藏期第1天O2-含量顯著高于對照組（P＜0.05），迅速降低至與對照組一致，后呈緩慢上升趨勢。說明在貯藏期前期，接種灰霉病菌和噴施生防酵母菌均可誘導番茄果實提高O2-含量，此時O2-作為信號分子可激發(fā)番茄對病菌防御能力，并對病菌產生抑制和毒害作用，隨后噴施生防酵母菌可誘導番茄果實提高抗氧化酶活性，清除番茄中大量積累的O2-，使番茄免受活性氧毒害。

圖8　不同處理對番茄果實O2-影響Fig.8　Effect of different treatments on O2-of tomato fruit

3　討論

已有離體試驗證明，3株生防酵母菌Cryptococcus albidus 63（Ca63）、Cryptococcus albidus 64（Ca64）和Candida parapsilosis yett1006對番茄灰霉病病原菌B.cinerea t08016b具有明顯抑制作用[14]。比較3株生防酵母菌對番茄灰霉病防治效果的活體試驗發(fā)現(xiàn)，3株生防酵母菌均可抑制番茄灰霉病發(fā)病，其中菌株Ca64防治效果最好，與離體試驗結果一致。

生防酵母菌誘導番茄抗灰霉病防御相關酶活性測定結果顯示，3株生防酵母菌均可誘導防御酶系如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性產生明顯提高，與已有研究結果一致[15-17]。當果蔬受病原菌侵染時，體內一系列防御反應被激活，誘導產生大量防御相關酶類，幫助果蔬抵御病原菌侵害，調控果蔬植物產生誘導抗性，增強果蔬植物抗病能力[18-19]。生防酵母菌誘導番茄抗灰霉病活性氧含量測定結果顯示，3株生防酵母菌均在初期誘導活性氧含量產生明顯提高，與已有研究結果一致[20]。正常狀態(tài)下，果蔬植物體內活性氧處于動態(tài)平衡，當果蔬植物受病原菌侵染時，出現(xiàn)氧迸發(fā)現(xiàn)象，以超氧陰離子和過氧化氫為主的活性氧含量迅速增加，在植物體內大量累積，加快果蔬植物老化[21]。活性氧在植物體遭受病原菌侵染初期激活植物體防御機制，作為信號傳遞中間體參與調控防御相關酶表達，活性氧對病原菌產生直接抑制和毒害作用，誘導合成植保素[22-23]。

3株生防酵母菌離體抑菌試驗結果表明，生防酵母菌主要作用機理是營養(yǎng)和空間競爭，生防酵母菌迅速生長繁殖，搶奪灰霉病菌孢子萌發(fā)和菌絲生長所需營養(yǎng)，占據有限生存空間，抑制病原菌生長繁殖，3株生防酵母菌活體試驗結果進一步證實此結論。3株生防酵母菌誘導防御酶系如多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性提高，并在初期誘導產生大量活性氧，提升番茄對灰霉病抗病能力。