高尿酸血癥雞模型飼料中維生素A醋酸酯的含量測定

岑志芳，劉桂燕，陳麗純，官鎮(zhèn)城，李桂圻，蒙薜飛

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院（醫(yī)藥工程學(xué)院）藥學(xué)系，廣東佛山528000）

高尿酸血癥雞模型的建立旨在通過對蛋齡前雞喂以高蛋白高鈣低磷低維生素A的雞飼料，使雞的腎及尿路損傷導(dǎo)致尿液濃縮、尿排泄障礙，從而促進高尿酸血癥的生成。維生素A缺乏會引起腎小管、輸尿管上皮細胞代謝紊亂和角質(zhì)化生，使黏液分泌減少，尿酸鹽排泄受阻［1］。中國藥典歷來采用紫外-可見分光光度計測維生素A含量［2］，英國藥典2009版和歐洲藥典6.0版均收載了反相液相色譜法（RP-HPLC）測定維生素A含量，但是，相比于液相色譜法，紫外測定中供試液濃度較低，操作誤差較大，而反相色譜系統(tǒng)穩(wěn)定性好，受環(huán)境因素影響較小，可操作性強［3］。本次實驗采用反相液相色譜法測定雞飼料中維生素A的含量，旨在為高尿酸血癥雞模型的建立提供更準(zhǔn)確有效的方法及數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀；JJ300型電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；AS5150B超聲波清洗機：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；手提式高速中藥粉碎機（浙江溫嶺市銘大藥材機械設(shè)備有限公司，型號：DMF-4B）。

1.2 試藥

維生素A醋酸酯對照品（USP/EP，批號：127-47-9，阿拉?。?；基礎(chǔ)雞飼料（批號：20171022，江門市豐實飼料有限公司）；魚粉（批號：20170810，TECNOLOGICA DE ALIMENTOS S.A）；混合飼料：（自制，批號：20180201，20180202）；抗壞血酸（分析純，批號：20160107，廣東光華科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，批號：I754507441，默克股份科技兩合公司）；去離子水（實驗室自制）；無水乙醇（分析純，批號：160830，廣東光華科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合飼料的配制

用粉碎機分別粉碎500 g基礎(chǔ)飼料和500 g魚粉，過10目篩，再按1∶1的比例混合基礎(chǔ)飼料和魚粉，再過10目篩以混合均勻并按四分法直到所取混合飼料為200 g為止［4］。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取100 mg維生素A醋酸酯對照品置25 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解定容，搖勻，制得濃度為 800 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別精密吸取上述對照品溶液 0.5，1，2，3，4，5 mL 于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，即得。

2.3 樣品處理及供試品溶液制備

精密稱量混合飼料6.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加0.40 g抗壞血酸，無水乙醇40 mL，50%KOH水溶液10 mL，于86℃恒溫水浴鍋中水浴回流30分鐘，皂化完全為止。將上述皂化后溶液放冷減壓過濾后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水60 mL分三次洗滌燒瓶及殘余飼料，減壓過濾后將洗液并入分液漏斗中；取30 mL 95%乙醇分三次洗滌燒瓶及殘余飼料，減壓過濾后將濾液并入分液漏斗中；再取50 mL石油醚洗滌燒瓶及殘余飼料，減壓過濾后將濾液并入分液漏斗中，輕搖數(shù)次，靜置，分出水層。取30 mL石油醚與水層混合萃取。將水層棄去，石油醚層溶液合并于分液漏斗中，于分液漏斗中加入30 mL水洗滌石油醚，棄去水層。取20 mL 0.5 mol·L-1的氫氧化鉀溶液置于分液漏斗中，輕搖數(shù)次，靜置，棄去堿液；加水30 mL洗滌石油醚層，重復(fù)多次，至水層對酚酞指示劑顯中性。將上述已顯中性的石油醚層過無水硫酸鈉柱，再用20 mL石油醚洗滌分液漏斗及無水硫酸鈉柱，得到脫水石油醚液。蒸干石油醚液，殘渣用甲醇溶解定容至10 mL，得到供試品溶液。

2.4 色譜條件

流動相為甲醇-水（97∶3），流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25℃，紫外檢測波長為325 nm。用甲醇溶解樣品，進樣體積為20 μL。流動相使用前經(jīng)超聲波脫氣［5］。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗

分別精密吸取對照溶液與供試品溶液各20 μL，在2.3項的色譜條件下測定。結(jié)果色譜行為良好，維生素A與其他組分色譜峰可達到基線分離，供試品溶液與對照品溶液在同一保留時間的波峰出現(xiàn)，而陰性對照則無相應(yīng)的干擾峰，說明本方法具有良好的專屬性（見圖1-c）。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 檢測限

精密量取已知濃度的對照品溶液1 mL，進行一系列的稀釋過程，直至信噪比S/N=3，此時濃度為8 μg/mL。（結(jié)果見圖1-D）

圖1 維生素A醋酸酯HPLC色譜圖

2.6.2 線性關(guān)系的考察

將配好的對照品溶液注入液相色譜儀中，按色譜條件測定，記錄峰面積。以維生素A的濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得維生素A的回歸方程為A=3.1482*C+19.259（r＝0.999 9），維生素 A 在 40-800 μg·mL-1時線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度試驗

精密吸取維生素A對照品溶液，一天連續(xù)進樣6針，測定峰面積，計算RSD為1.84%。

表1 精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.6.4 加樣回收試驗

精密稱取等量的同一批號樣品（批號：20180202）6.0 g，按2.3制備方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定峰面積，然后分別加入相當(dāng)于樣品含量50%，100%，150%不同質(zhì)量濃度的維生素A醋酸酯對照品溶液，搖勻，再按上述色譜條件進樣分析，回收率為101.50%，RSD=2.43%。

表2 加樣回收率結(jié)果（n=9）

2.7 樣品測定

精密稱取2批樣品各6.0 g，按2.3制備方法制備供試品溶液，依上述色譜條件測定峰面積，并計算出混合飼料中維生素A的平均含量為59.06 μg·mL-1。

表3 混合飼料中維生素A含量測定結(jié)果

3 討論

維生素A中含有多個不飽和鍵，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被空氣中的氧或氧化劑氧化，易被紫外光裂解，在加熱和金屬離子存在時更易氧化變質(zhì)，而維生素A醋酸酯較維生素A穩(wěn)定，雞的基礎(chǔ)飼料及魚粉中的維生素A以其醋酸酯形式存在，但是雞飼料中維生素A醋酸酯含量很低，且飼料中雜質(zhì)較多，紫外-分光光度法測維生素A含量受雜質(zhì)影響較大，結(jié)果準(zhǔn)確性低，在實際工作中,紫外分光光度法無法排除其他色素、雜質(zhì)的干擾,不能正確檢驗和評價飼料產(chǎn)品質(zhì)量［6］，因此本實驗采用HPLC法測其含量，經(jīng)皂化反應(yīng)得到維生素A醇在波長為325 nm處有最大吸收，且響應(yīng)較好。

采用皂化法進行樣品處理時，由于維生素A性質(zhì)活潑、不穩(wěn)定，皂化時極易被空氣氧化，所以維生素A的皂化提取我們采用避光和加入抗壞血酸條件下迅速進行［7］。由于混合飼料經(jīng)皂化后所含雜質(zhì)較多且含不溶性固體，影響維生素A含量測定結(jié)果，因此需經(jīng)過濾操作除去濾渣并依次用蒸餾水、95%乙醇及石油醚洗滌燒瓶和濾渣。據(jù)文獻報道［8］，皂化樣品后用乙醚萃取，而本次實驗則用石油醚代替乙醚，因為此處乙醚用量較大，現(xiàn)乙醚屬于管控試劑，不易獲得，限制了實驗用量，且吸入高濃度乙醚蒸汽造成實驗員不適癥狀，石油醚極性更低，可更多的萃取皂化液中的維生素A，測定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

［1］馬冬梅,陶國棟,張煥春.雞痛風(fēng)發(fā)生的生理生化機制及防制措施［J］.中國畜牧獸醫(yī),2008（11）:128-129.

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