腹水脫落細(xì)胞DNA倍體對良惡性腹水的診斷價值研究

馬 俊，王麗萍，黃 瑋，劉毅鵬，上官輝，張繼平 *，江 浩，何彩云，

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院佛山消化內(nèi)科，廣東佛山528000））

腹水是臨床上常見癥狀，多數(shù)患者以腹水為首發(fā)癥狀來就診。大部分的腹水由肝硬化、結(jié)核性腹膜炎及惡性腫瘤產(chǎn)生。不明原因的腹水中癌性腹水占比最大［1-2］。如何鑒別腹水性質(zhì)對明確診斷及指導(dǎo)后續(xù)治療意義重大［3］。腹水脫落細(xì)胞學(xué)病理診斷是良惡性腹水的重要診斷方法，但陽性率不高，僅30%［4］。近年來，發(fā)現(xiàn)DNA倍體的異型性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及臨床病理特點密切相關(guān)［5］，DNA含量的測定已廣泛應(yīng)用于宮頸癌、胃癌、口腔磷癌等腫瘤的診斷和預(yù)后判斷［6］。本文收集我院消化內(nèi)科、血液腫瘤科等收治患者的腹水脫落細(xì)胞，采用Feulgen染色及圖像分析儀技術(shù)（ICM），測定DNA含量及對倍體進(jìn)行分析，以分析其對良惡性腹水性質(zhì)的診斷價值，為臨床提供一種新的良惡性腹水的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2015年7月-2017年6月我院住院部117例患者腹水，其中經(jīng)組織病理或細(xì)胞學(xué)確診的良性腹水54例，惡性腹水63例；良性腹水中，男性30例，女性24例；年齡46-81歲，平均59.4±17.2歲；其中肝硬化腹水51例，結(jié)核性腹水3例；惡性腹水中，男性29例，女性34例，年齡34-83歲，平均年齡61.2±24.9歲，其中消化道腫瘤52例，婦科腫瘤11例。所有患者的診斷均通過胃腸鏡下組織病理、手術(shù)病理及腹水脫落細(xì)胞病理學(xué)檢查等明確診斷。兩組患者性別構(gòu)成、年齡均無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 DNA倍體檢測

1.2.1 腹水脫落細(xì)胞收集

收集所有患者腹水，最少200 ml，提取脫落細(xì)胞，分成兩部分：一部分行細(xì)胞學(xué)病理診斷，用來協(xié)助判斷腹水的性質(zhì)；一部分行脫落細(xì)胞的Feulgen染色進(jìn)行DNA定量分析。

1.2.2 腹水脫落細(xì)胞的處理與分析

在脫落細(xì)胞收集管（含30 ml固定液）中加入酶消化液，振蕩120 min（150次/分），離心5 min（800 rpm），50%乙醇清洗，離心2次，棄上清液，加固定液2～3 ml，振蕩，混勻，加200 μl細(xì)胞懸液入細(xì)胞離心管，離心、甩片5 min，制成液基薄層細(xì)胞片3張片，一張做常規(guī)染色，行常規(guī)病理檢查；兩張分別做巴氏染色和Feulgen DNA染色，行人工及計算機自動閱片。

所有Feulgen DNA染色片用AcCell全自動細(xì)胞DNA倍體分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析處理。根據(jù)AcCell系統(tǒng)診斷軟件所做出的細(xì)胞DNA倍體分析判定如下：陰性（-）：以2倍體細(xì)胞為主，未見異倍體細(xì)胞及異倍體細(xì)胞峰；弱陽性（+）：出現(xiàn)DNA指數(shù)（DI）＞2.5細(xì)胞及DI1-2的細(xì)胞數(shù)超過被測細(xì)胞總數(shù)的10%，其中DI＞2.5細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目在1-2個；陽性（++）：DI＞2.5細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目在3-5個；強陽性（+++）：DI＞2.5細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目≥6個。所有DI＞2.5的細(xì)胞玻片均由細(xì)胞學(xué)檢查醫(yī)師在顯微鏡下逐一進(jìn)行核實為惡性病例，以排除AcCell系統(tǒng)將破損和重疊的細(xì)胞核誤認(rèn)為是癌細(xì)胞和異常細(xì)胞；同時以病理細(xì)胞學(xué)核實結(jié)果為良惡性為金標(biāo)準(zhǔn)計算DNA倍體分析結(jié)果的診斷靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，連續(xù)型計量資料以x2±s表示，兩組間比較采用t檢驗；等級資料用秩和檢驗，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。診斷性試驗的評價指標(biāo)用診斷靈敏度、特異度、誤診率、漏診率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值來判定。

2 結(jié)果

2.1 脫落細(xì)胞DNA倍體分析

在63例惡性腹水中有53例（占84.13%）DNA倍體陽性，54例良性腹水中有8例（占14.81%）DNA倍體陽性。其中在惡性腹水組中，弱陽性病例數(shù)為29例、陽性為15例、強陽性者為9例，而在良性腹水組中，8例DNA倍體均為弱陽性，兩者等級資料的秩和檢驗比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（μ=7.53，p＜0.001）。

表1 腹水脫落細(xì)胞DNA倍體分析結(jié)果

2.2 脫落細(xì)胞DNA倍體診斷性試驗評價結(jié)果

如表2所示，63例惡性腹水中53例DNA倍體陽性，10例DNA倍體陰性；54例良性腹水中8例DNA倍體陽性，46例DNA倍體陰性；所有病例中DNA倍體陽性患者61例，DNA倍體陰性患者56例。其脫落細(xì)胞DNA倍體診斷靈敏度為84.13%，特異度為85.19%，漏診率為15.87%，誤診率為14.81%，陽性預(yù)測值為86.89%，陰性預(yù)測值為82.14%，見表2。

表2 脫落細(xì)胞DNA倍體診斷試驗表格

2.3 脫落細(xì)胞DNA倍體與脫落細(xì)胞病理學(xué)診斷比較

在惡性腹水中，脫落細(xì)胞病理學(xué)診斷為惡性的陽性例數(shù)共有24例，陰性例數(shù)為39例；脫落細(xì)胞DNA倍體檢測在惡性腹水中，陽性共53例，陰性例數(shù)10例；所有病理學(xué)診斷為惡性的患者，脫落細(xì)胞DNA倍體均為陽性，見表3，其靈敏度為100%，特異度為25.64%，漏診率為0%，誤診率為74.36%，陽性預(yù)測值為45.28%，陰性預(yù)測值為100%。這表明脫落細(xì)胞DNA倍體的診斷靈敏度高于脫落細(xì)胞病理學(xué)，具有一定的臨床推廣應(yīng)用價值。

表3 惡性腹水中脫落細(xì)胞DNA倍體與脫落細(xì)胞病理學(xué)診斷性試驗評價

3 討論

臨床上通常將腹水分為惡性腹水及良性腹水兩大類，臨床診斷中惡性腹水的診斷金標(biāo)準(zhǔn)腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查為最常用的方法，其診斷特異性為100%，但是敏感性僅有30%左右［4］，為臨床診斷帶來了一定困難，往往多次行腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查都很難找到癌細(xì)胞。本文擬為臨床尋找一種簡單方便、有效的指標(biāo)來提高腹水性質(zhì)的診斷。

DNA倍體的異型性出現(xiàn)與癌變率和癌前病變增生程度有高度相關(guān)性，是診斷癌前病變發(fā)生癌變的一個重要指標(biāo)；是鑒別良性與惡性腫瘤的特異性指標(biāo)；良性腫瘤和正常組織良性增生不出現(xiàn)DNA異型性，而惡性腫瘤可出現(xiàn)，以超三倍體或者多倍體居多。研究也表明，DNA倍體異型性不但與腫瘤密切相關(guān)，與患者預(yù)后也有明顯關(guān)系［7］。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，定量病理學(xué)計算機診斷得以實現(xiàn)，圖像分析儀技術(shù)（ICM）測定DNA含量已普遍應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如在婦科腫瘤中，通過DNA倍體分析，利于全面了解細(xì)胞生物學(xué)行為，從而有助于婦科腫瘤的及時診斷、治療和預(yù)后判斷［8］。在對早期胃癌的研究也發(fā)現(xiàn)，其與胃癌有密切關(guān)系，同時對于胃癌組織的惡性程度有重要的臨床鑒別診斷意義，同時有助于對腫瘤的動態(tài)觀察及預(yù)后判斷［9］。我科前期的研究中也發(fā)現(xiàn)脫落細(xì)胞DNA倍體對食管良惡性疾病有一定的鑒別診斷價值［10］。

本文研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腹水中，有10例DNA倍體為陰性，其余均為陽性，陽性率為84.13%；同時在惡性腹水中，24例病例患者脫落細(xì)胞病理學(xué)為陽性，這部分患者DNA倍體異型性均為陽性，靈敏度為100%，而在39例脫落細(xì)胞病理學(xué)為陰性的患者中，發(fā)現(xiàn)29例患者脫落細(xì)胞DNA倍體異型性為陽性，這提示DNA倍體的敏感性明顯高于病理細(xì)胞學(xué)。導(dǎo)致惡性腹水中DNA倍體異型性為陰性者，分析原因可能腫瘤細(xì)胞未脫落至漿膜腔、標(biāo)本中癌細(xì)胞聚集成團(tuán)以及存在高分化的二倍體腫瘤等因素有關(guān)；惡性腹水中有9例DNA倍體為強陽性，此9例患者均為腫瘤有廣泛腹腔轉(zhuǎn)移，包括肝、腹腔淋巴結(jié)、大網(wǎng)膜及腹膜轉(zhuǎn)移。DNA倍體異型性程度及數(shù)量是否與腫瘤的轉(zhuǎn)移部位及預(yù)后有關(guān)，仍需進(jìn)一步大樣本、多中心研究，本文研究結(jié)果同楊倩［11］的研究報道一致。

本文采用全自動圖像DNA分析儀技術(shù)來檢測DNA倍體含量，而傳統(tǒng)DNA倍體的檢測多采用流式細(xì)胞儀技術(shù)，此方法需要有一定經(jīng)驗的技術(shù)人員，多數(shù)僅在特殊條件的實驗室使用，且其重復(fù)性差，對脫落細(xì)胞數(shù)有一定要求，故多用于科研，很難在臨床上推廣。而ICM技術(shù)具有標(biāo)本處理簡單，能快速獲取大量DNA信息，準(zhǔn)確率高，并且標(biāo)本可重復(fù)檢測，減少了人為因素的影響，易于在臨床上廣泛開展。有報道對ICM進(jìn)行細(xì)胞核DNA測定有助于提高腹水陽性診斷率，在良、惡性腹水的鑒別診斷中較常規(guī)細(xì)胞學(xué)方法更加客觀、敏感［12］。因此，使用ICM方法進(jìn)行DNA測定，對良惡性腹水鑒別診斷有一定指導(dǎo)意義，可在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。

［1］TAMA C,LAPWORTH R.Biochemical analysis of ascetic(peritoneal)fluid:what should we measure［J］.Ann Clin Biochem,2010,47（5）:397

［2］徐玫麗,霍繼榮,劉德良.213例不明原因腹水的病因分析［J］.醫(yī)學(xué)臨床研究,2009,26（4）:590.

［3］于艷芳,段曉輝,裴志萍,等.CEA,CA199和CA125聯(lián)合檢測鑒別良惡性腹水82例價值分析［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志,2013,42（1）:63-65.

［4］CAO F,ZHANG H.Molecular biological diagnosis of serous cavity fluidify ［J］.Foreign Med Sci Oncol Sect,2005,32（3）:199-201.

［5］D’URSO V,COLLODORO A,MATTIOLI E,et al.Cytometry and DNA ploidy:clinical uses and molecular perspective in gastric and lungcancer［J］.J Cell Physiol,2010（222）:532-539.

［6］孫小蓉,李玉蘭,車東媛,等.用細(xì)胞DNA定量分析方法進(jìn)行宮頸癌及癌前病變普查的臨床研究［J］.診斷病理學(xué)雜志,2005,12（1）:12-16.

［7］周振英,朱月清,吳曉柳,等.惡性腫瘤DNA倍體分類與患者預(yù)后的關(guān)系［J］.腫瘤防治雜志,2000（5）:452-453.

［8］蘭雪麗,賀昕紅.DNA倍體分析技術(shù)在診斷婦科腫瘤中的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志,2017,46（5）:15-17.

［9］張雅君,劉春雷,關(guān)曉輝.DNA定量分析在早期胃癌診斷中的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志,2017,25（2）:172-177.

［10］王麗萍,馬俊,梁若玲,等.食管黏膜脫落細(xì)胞DNA倍體檢測在食管癌診斷中的價值［J］.廣東醫(yī)學(xué),2013,34（16）:2471-2474.

［11］楊倩.脫落細(xì)胞學(xué)檢查、DNA倍體分析與血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測診斷惡性胸腹水的價值［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,40（8）:1046-1048.

［12］李德昌,任力,李煒,等.全自動細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)在鑒別良惡性胸腹水中的應(yīng)用［J］.診斷病理學(xué)雜志,2011,18（2）:134-136.