毒胡蘿卜素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫功能的影響

馮珍珍，劉螢，董寧，于燕，馬濤，姚詠明

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊、生物合成、翻譯后修飾等。在應(yīng)激條件下，如鈣離子平衡紊亂、蛋白質(zhì)糖基化狀態(tài)改變、突變蛋白表達(dá)等引起ER腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集，導(dǎo)致ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡[1]，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)[2]。研究表明，ERS不僅是生理狀態(tài)下維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，也參與糖尿病、腎臟疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管系統(tǒng)疾病等病理生理過(guò)程[3-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ERS亦可影響巨噬細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)等免疫細(xì)胞的功能，參與對(duì)免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[6-8]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)作為一類具有顯著免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的CD4+T細(xì)胞亞群，在維持免疫穩(wěn)態(tài)、保持免疫耐受等方面發(fā)揮重要作用[9-11]。但ERS是否影響Treg介導(dǎo)的免疫功能，目前尚不清楚。本研究以ERS特異性誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)體外刺激小鼠脾臟Treg，分析對(duì)Treg免疫反應(yīng)及ERS相關(guān)信號(hào)通路的影響，探討ERS對(duì)Treg功能的調(diào)節(jié)效應(yīng)及可能的信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 6～8周雄性BALB/c小鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠臟器淋巴細(xì)胞分離液、RPMI 1640培養(yǎng)液均購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。TG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。純化抗CD3/CD28抗體、別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的抗小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)抗體、藻紅蛋白/青色素染料7(PE-Cy7)標(biāo)記的抗小鼠叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司?？蛊咸烟钦{(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)抗體、抗真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄啟始因子(eIF2α)抗體及抗磷酸化eIF2α(p-eIF2α)抗體、抗轉(zhuǎn)錄激活因子(ATF)4抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。Mini MACS磁性分離儀Treg分離磁珠為德國(guó)Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠脾臟細(xì)胞分離與單個(gè)核細(xì)胞的制備小鼠斷頸處死后無(wú)菌留取脾臟置于平皿中，加入3～5ml PBS緩沖液，剪刀剪碎，置于200目濾網(wǎng)上，5ml注射器活塞輕輕研磨，PBS緩沖液沖洗平皿和濾網(wǎng)，收集細(xì)胞濾液于15ml離心管中。1500r/min離心5min后棄上清，適量PBS緩沖液重懸細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，緩慢加入到2倍體積的小鼠淋巴細(xì)胞分離液中，3000r/min離心15min后吸取中間層絮狀物于15ml離心管中。適量PBS緩沖液離心洗滌2次，所得細(xì)胞即為小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2 Treg的分離與鑒定 采用Mini MACS免疫磁性分離系統(tǒng)分離Treg：①每1×107細(xì)胞加入30μl PBS和10μl生物素偶聯(lián)抗體雞尾酒液，4℃避光孵育10min；每1×107細(xì)胞加入20μl抗生物素磁珠及10μl PE標(biāo)記的抗CD25 抗體，4℃避光孵育15min；收集LD柱陰性分選后留出的細(xì)胞懸液，離心棄上清獲取CD4+T淋巴細(xì)胞。②每1×107細(xì)胞加入90μl PBS和10μl抗PE磁珠，4℃孵育15min；加入到MS柱中進(jìn)行第2次分選，收集留出的細(xì)胞懸液為T淋巴細(xì)胞，陽(yáng)性分選得Treg，細(xì)胞計(jì)數(shù)。取1×105細(xì)胞置于流式上樣管中，定容至100μl，加入抗CD4–FITC抗體(0.25μg/106)，避光孵育15min，定容至200μl，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)雙陽(yáng)性細(xì)胞的純度。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與TG刺激 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸Treg細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入抗CD3/CD28(抗CD3抗體2μg/ml，抗CD28抗體1μg/ml)抗體，接種于96孔板中，每孔200μl。TG刺激設(shè)0.05、0.1、0.2μmol/L(n=4)3個(gè)濃度，以0μmol/L為對(duì)照；設(shè)6、12、24h(n=4)3個(gè)刺激時(shí)間，以刺激0h為對(duì)照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg Foxp3及CTLA-4的表達(dá)

收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，100μl PBS重懸細(xì)胞，加入APC標(biāo)記的抗小鼠CTLA-4抗體。4℃避光孵育30min，2ml破膜緩沖液洗滌2次，加入1ml破膜液，4℃避光過(guò)夜。離心棄上清，細(xì)胞重懸于100μl破膜緩沖液中，加入PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Foxp3抗體，4℃避光45min，2ml破膜緩沖液洗滌2次，重懸細(xì)胞于破膜緩沖液中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg Foxp3及CTLA-4的表達(dá)水平。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)Treg中ERS信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá) Treg按每孔2×106個(gè)接種于6孔板中，每孔加入CD3/CD28刺激活化，實(shí)驗(yàn)組加入TG，使TG在細(xì)胞懸液中的濃度為0.1μmol/L，培養(yǎng)12h后收取細(xì)胞，提取蛋白，采用BCA法對(duì)總蛋白定量分析。各組細(xì)胞蛋白上樣量為30μg，SDS-PAGE電泳，電泳完成后進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜。一抗、二抗孵育醋酸纖維素膜，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG單克隆抗體(1:5000)，洗膜后進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)效應(yīng)T細(xì)胞(Teff)增殖活性在1ml Teff懸液中加入1μl CellTraceTM試劑室溫避光孵育20min；加入5倍體積的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37°孵育5min終止反應(yīng)。離心棄上清，PBS細(xì)胞重懸Teff，3×104個(gè)Teff與各組Treg 1:1共培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Teff增殖情況。

1.2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平 收集Treg單獨(dú)培養(yǎng)或與Teff共培養(yǎng)上清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)Treg單獨(dú)培養(yǎng)上清中白介素(IL)-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β及共培養(yǎng)上清中IL-4、干擾素(IFN)-γ、IL-2生成水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠Treg分離純度 小鼠單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)兩次MACS分選后，得到Teff的純度為88.2%，Treg純度為91.0%(圖1)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活性為97.0%。

2.2 TG刺激對(duì)Treg Foxp3及CTLA-4表達(dá)的時(shí)效-量效關(guān)系 與對(duì)照及刺激6h相比，TG(0.1μmol/L)作用12、24h均可誘導(dǎo)Treg Foxp3表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但刺激12h與刺激24h兩組間比較，F(xiàn)oxp3的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CTLA-4的表達(dá)在刺激各時(shí)間點(diǎn)的變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖2A)，與對(duì)照及0.05μmol/L濃度相比，TG濃度為0.1、0.2μmol/L時(shí)Foxp3的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，但兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CTLA-4的表達(dá)在各劑量組亦未見(jiàn)明顯變化(P＞0.05，圖2B)。依據(jù)Foxp3表達(dá)變化情況，選定TG 0.1μmol/L和12h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的刺激濃度和時(shí)間。

圖1 磁珠分選Treg純度Fig.1 Treg purity sorted by magnetic beads

圖2 TG刺激后Treg Foxp3及CTLA-4的表達(dá)Fig.2 Expressions of Foxp3 and CTLA-4 on Tregs after TG stimulation

2.3 Western blotting檢測(cè)TG刺激誘導(dǎo)的Treg ERS反應(yīng) 與對(duì)照組相比，0.1μmol/L TG刺激12h可誘導(dǎo)Treg中ERS信號(hào)通路蛋白GRP78、ATF4表達(dá)水平顯著上調(diào)，ERS信號(hào)通路關(guān)鍵性調(diào)節(jié)分子eIF2α磷酸化水平明顯增加，p-eIF2α/eIF2α比值增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 TG刺激誘導(dǎo)Treg中ERS信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)Fig. 3 Effect of TG on the expression of ERS signaling pathway-related molecules in Tregs (Western blotting)(1)P＜0.05 compared with control group

2.4 TG刺激對(duì)Treg細(xì)胞因子IL-10和TGF-β生成的影響 與對(duì)照組相比，TG刺激后Treg培養(yǎng)上清中IL-10及TGF-β的生成明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

2.5 TG刺激Treg對(duì)Teff增殖及Th1/Th2分化的影響與對(duì)照組相比，TG刺激組Treg可明顯抑制Teff增殖活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5A)。與對(duì)照組相比，TG刺激組共培養(yǎng)上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高，IL-2分泌水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5B)。

圖5 TG刺激Treg對(duì)Teff增殖活性及共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分泌情況的影響Fig.5 Effect of TG-stimulated Tregs on proliferative activity of Teff and secretion of cytokines in co-cultured supernatants

圖4 TG刺激Treg培養(yǎng)上清中IL-10及TGF-β的生成情況Fig.4 Effect of TG on the production of IL-10 and TGF-β in Treg culture supernatants

3 討 論

Treg細(xì)胞是一類具有特殊免疫學(xué)效應(yīng)的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，主要介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)，通過(guò)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然和特異免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)，在保持自身免疫耐受、免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。Treg數(shù)量和(或)功能的變化也被證實(shí)是移植耐受、過(guò)敏反應(yīng)、自身免疫病、感染免疫等疾病的重要病理生理基礎(chǔ)[9]。因此，研究Treg功能變化的機(jī)制對(duì)于免疫相關(guān)疾病的干預(yù)和治療具有重要意義。

ERS是ER在應(yīng)對(duì)多種生理或病理?xiàng)l件下引起的ER腔內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集的應(yīng)激性反應(yīng)。GRP78是ERS反應(yīng)的標(biāo)志性蛋白，應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78作為伴侶分子與ER上的跨膜蛋白解離，與腔內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白結(jié)合，促進(jìn)異常蛋白質(zhì)的修飾、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)；GRP78表達(dá)的增加提示ERS反應(yīng)的發(fā)生[12]，eIF2α和ATF4是ERS誘導(dǎo)PERK信號(hào)通路中的重要組分，eIF2α的磷酸化將減緩蛋白質(zhì)的合成，減輕ER蛋白合成負(fù)荷，同時(shí)上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子ATF4的表達(dá)，進(jìn)一步抑制ER內(nèi)蛋白質(zhì)的合成[13]。本研究使用ERS特異性誘導(dǎo)劑TG刺激Treg后，可以檢測(cè)到Treg中GRP78表達(dá)增強(qiáng)，磷酸化eIF2α表達(dá)增加，ATF4表達(dá)亦明顯上調(diào)，提示TG刺激后Treg發(fā)生明顯ERS反應(yīng)，以利于恢復(fù)或保持Treg內(nèi)ER穩(wěn)態(tài)。

近年來(lái)研究提示，ERS對(duì)免疫細(xì)胞的功能及活性有重要的調(diào)節(jié)作用。我們的既往研究顯示，HMGB1刺激可激活DC中ERS反應(yīng)，引起DC表面標(biāo)記分子表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子生成增加[8]；Solanki等[6]發(fā)現(xiàn)ERS相關(guān)信號(hào)通路的活化可明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗凋亡能力，加重動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病灶的進(jìn)展。本組資料中，我們采用TG刺激，不僅可以觀察到Treg中ERS反應(yīng)的活化，Treg介導(dǎo)的免疫功能也發(fā)生明顯改變。Foxp3是Treg最具特異性的分子標(biāo)志物，其表達(dá)水平高低是決定Treg功能活性的關(guān)鍵因素[14-15]。本研究結(jié)果顯示，TG刺激可明顯誘導(dǎo)Treg中Foxp3表達(dá)，且在0.1μmol/L TG刺激12h時(shí)表達(dá)明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TG刺激后Treg對(duì)Teff的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，并且共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-4/IFN-γ比值明顯增加，IL-2的分泌水平降低，Th1/Th2平衡向Th2方向分化。以上結(jié)果顯示，TG在誘導(dǎo)Treg發(fā)生 ERS反應(yīng)的同時(shí)，對(duì)Treg免疫功能也有確切的活化調(diào)節(jié)效應(yīng)。

目前已明確，Treg主要依靠細(xì)胞接觸依賴和非接觸依賴機(jī)制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[16]。CTLA-4組成性表達(dá)于Treg，可與Teff表面相應(yīng)受體結(jié)合，激活Teff內(nèi)相應(yīng)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制Teff的增殖活性及IL-2等細(xì)胞因子的表達(dá)，是Treg發(fā)揮細(xì)胞接觸依賴抑制效應(yīng)的重要分子[17]。但本研究結(jié)果顯示，不同濃度TG(0、0.05、0.1、0.2μmol/L)刺激不同時(shí)間(0、6、12、24h)，Treg上CTLA-4的表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)明顯變化，提示ERS增強(qiáng)Treg活性并非通過(guò)CTLA-4介導(dǎo)的細(xì)胞接觸依賴機(jī)制發(fā)揮作用，但本研究尚不能排除膜型TGF-β、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體等的作用。IL-10及TGF-β是Treg發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的重要細(xì)胞因子，可直接作用于免疫細(xì)胞，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)[18]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TG刺激后Treg培養(yǎng)上清中IL-10及TGF-β的生成明顯增加，提示TG誘導(dǎo)的ERS反應(yīng)可能通過(guò)增強(qiáng)Treg細(xì)胞因子的生成能力，以非接觸依賴機(jī)制發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，但具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步澄清。

研究證實(shí)，ERS作為細(xì)胞應(yīng)對(duì)應(yīng)激狀態(tài)的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)抑制早期蛋白質(zhì)的合成、增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的表達(dá)、加速未折疊蛋白及錯(cuò)誤折疊蛋白的降解促進(jìn)ER穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。本研究結(jié)果顯示，ERS不僅是作為細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制，而且在受到TG刺激后，Treg通過(guò)活化ERS相關(guān)信號(hào)通路，恢復(fù)Treg中ER穩(wěn)態(tài)的同時(shí)，對(duì)Treg的免疫反應(yīng)也具有明確的調(diào)節(jié)效應(yīng)。鑒于ERS參與包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、膿毒癥等病理生理過(guò)程[3-4,19]，闡釋ERS與Treg的關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制，可能為進(jìn)一步探討Treg介導(dǎo)免疫性疾病的干預(yù)及治療提供潛在靶點(diǎn)。

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