• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    母系遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤家系RB1基因分析與產(chǎn)前診斷

    2018-07-09 03:28:54蘭小平許無恨湯曉君葉海昀楊永臣宋小珍張泓
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:檢測

    蘭小平,許無恨,湯曉君,葉海昀,楊永臣,宋小珍,張泓

    視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB;OMIM 180200)是一種來源于未成熟視網(wǎng)膜細胞的惡性罕見腫瘤[1],是最早發(fā)現(xiàn)的由基因突變而導(dǎo)致的腫瘤,該致病基因被命名為視網(wǎng)膜母細胞瘤基因1(RB1),因此RB1也成為了第一個被成功克隆的人類抑癌基因[2]。已有研究表明,90%的雙眼和15%的單眼RB患者外周血基因組DNA中均能檢測到RB1基因致病性雜合突變[3]。本研究采用Sanger測序與多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)相結(jié)合的策略[4]對一個中國漢族雙眼RB家系開展了基因檢測,并以檢測結(jié)果為依據(jù)對該家系開展了兩次產(chǎn)前診斷?,F(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象 為我國一漢族家系,先證者(Ⅱ-1)男,4歲,9月齡發(fā)病。臨床診斷為雙眼RB,右眼C期,左眼D期,患兒足月順產(chǎn),無窒息、吸氧史,為該家系第一胎。父母均身體健康,非近親婚配,均無其他遺傳病史,眼底檢查均無異常。

    1.2 樣本采集及DNA提取 為進一步確診和對其父母再生育時的產(chǎn)前診斷提供依據(jù),在簽署知情同意書和上海市兒童醫(yī)院倫理委員會批準的情況下,采集先證者及父母EDTA抗凝外周靜脈血3~5ml,基因組DNA提取采用試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)進行。產(chǎn)前診斷羊水的采集在具有相關(guān)資質(zhì)的婦產(chǎn)科醫(yī)院完成,羊水基因組DNA的提取采用改進的外周血基因組DNA提取試劑盒進行。

    1.3 基因檢測方法 RB1基因點突變及小的插入/缺失檢測采用Sanger測序法,具體過程是從UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/,GRCh37/hg19)獲取RB1基因(NM_000321.1)啟動子區(qū)、27個外顯子編碼區(qū)及內(nèi)含子與外顯子交界區(qū)基因組DNA序列,采用引物設(shè)計軟件Oligo 7.0設(shè)計PCR及測序引物。測序?qū)嶒灢捎肞CR產(chǎn)物割膠純化的方法,采用基因分析儀(ABI 3500DX Genetic Analyzer)完成,結(jié)果比對分析采用Mutation Surveyor 4.0(SoftGenetics)軟件完成。RB1基因外顯子拷貝數(shù)變異的檢測采用多重連接探針擴增(MLPA)法,探針(P047-D1)及試劑均來自MRC-Holland公司,實驗操作按說明書標準操作流程(http://www.mlpa.com)進行,實驗在T100TMThermal Cycler(Bio-Rad)PCR擴增儀上完成,片段分析采用基因分析儀(ABI 3500DX Genetic Analyzer)完成,結(jié)果分析采用GeneMarker V2.2.0(SoftGenetics)軟件完成。

    1.4 產(chǎn)前診斷方法 對本研究中RB1基因整體雜合缺失突變的產(chǎn)前診斷采用多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA),產(chǎn)前診斷中母體DNA污染的排除采用檢測STR位點的方法進行,每次實驗中均以胎兒父母DNA樣本分別作為陰性和陽性對照。

    2 結(jié) 果

    2.1 家系基因檢測結(jié)果 該家系包括2名產(chǎn)前診斷胎兒在內(nèi)共5名成員(圖1A),Sanger測序未檢測到先證者Ⅱ-1 RB1基因啟動子區(qū)、27個外顯子及其外顯子兩端15bp內(nèi)含子區(qū)存在致病性點突變和小的插入/缺失突變。MLPA檢測結(jié)果顯示,先證者Ⅱ-1 RB1基因1-27號外顯子雜合缺失(圖1B),該缺失包含RB1基因上游的ITM2B基因和下游RCBTB2基因,但不包含上游的ENOX1基因和下游DLEU1和PCDH8基因,母親Ⅰ-2同樣存在該缺失突變(圖1C),父親Ⅰ-1拷貝數(shù)正常(圖1D),因此可確定先證者的缺失突變來自母親遺傳。

    2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果 針對該家系第一胎存在RB1基因1-27號外顯子雜合缺失的基因檢測結(jié)果,第二胎產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示,胎兒Ⅱ-2為該突變的男性攜帶者(圖1E),家長最后選擇終止妊娠;第三胎產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示,胎兒Ⅱ-3為RB1基因外顯子拷貝數(shù)正常的女性(圖1F),該胎兒出生后眼底檢查結(jié)果正常。由于MLPA檢測探針設(shè)計的特殊性,兩次產(chǎn)前診斷試驗均可通過性別探針排除母體DNA污染的可能性,這一結(jié)果與STR位點檢測結(jié)果一致。

    圖1 視網(wǎng)膜母細胞瘤家系(A)和MLPA檢測結(jié)果(B-F)Fig.1 Pedigree of retinoblastoma (A) and MLPA detection results (B-F)

    3 討 論

    視網(wǎng)膜母細胞瘤多發(fā)于5歲之前的嬰幼兒,全世界新生兒發(fā)病率基本恒定在1/15 000~1/20 000,每年新增患者約9000例[5]。我國人口出生率高,每年新增患者數(shù)量在亞太地區(qū)排名第二,約為1103例,僅次于排名第一的印度(1468例)[6]。RB根據(jù)其患眼可分為單側(cè)發(fā)病和雙側(cè)發(fā)病,分別約占60%和40%,極少一部分雙側(cè)患兒合并顱中線上的松果體腫瘤,稱為三側(cè)性RB,約45%的患者血液DNA中存在RB1基因致病性雜合突變[7]。因此,利用外周血基因組DNA對RB患者及親屬開展基因檢測,對其早期確診、治療、再生育遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷具有重要意義。本研究中先證者為雙眼RB,RB1基因檢測結(jié)果表明該患者存在RB1基因的整體雜合缺失,而且父母檢測結(jié)果表明該缺失突變來自健康無病的母親,因此對該先證者父母再生育胎兒開展了產(chǎn)前基因診斷。

    截止2016年3月,人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)共收錄RB1基因與RB相關(guān)的各類突變980個,包括錯義突變、無義突變、移碼突變、可變剪接、插入/缺失及染色體重排,其中缺失突變占15.2%(149個)。包含BR1基因在內(nèi)的染色體缺失片段大小與RB發(fā)生的相關(guān)性研究表明:當缺失片段大于1Mb時,個體通常為單眼發(fā)病RB患者或無RB癥狀攜帶者,但會出現(xiàn)特殊容貌、身材矮小、精神發(fā)育遲滯、肌張力低下、腦及心臟發(fā)育異常等綜合征特征;當缺失范圍僅限于RB1基因及其兩端較小范圍時,臨床表型與缺失片段所包含的基因直接相關(guān),缺失片段僅包含RB1及上游ITM2B基因時,所有患者均為雙眼發(fā)病,而缺失片段同時包括RB1及上游ITM2B和MED4基因時,患者通常為單眼發(fā)病,表明MED4基因的缺失具有抑制RB1發(fā)生的趨勢[8]。同樣有研究表明RB1基因下游PCDH8基因缺失與精神運動發(fā)育遲緩有關(guān)[9]。由此可見,當先證者出現(xiàn)RB1基因完全缺失時,缺失片段的大小以及上下游缺失基因的種類對先證者臨床表型的評估具有重要的參考意義。本研究中的先證者為RB1基因的完全缺失,上游缺失包含了ITM2B基因,而未出現(xiàn)ENOX1基因的缺失,下游缺失包含了RCBTB2基因,而未到達PCDH8基因,這一結(jié)果與先證者僅出現(xiàn)雙眼RB,而無其他臨床癥狀的結(jié)果是一致的,由于本研究所用MLPA試劑盒未在ITM2B基因上游的MED4基因中設(shè)置檢測探針,因此無法確定MED4基因是否缺失。

    遺傳性RB的外顯率高達90%以上,RB1基因的移碼突變和無義突變通常為完全顯性,而錯義突變、可變剪接突變、非移碼的插入/缺失及啟動子區(qū)突變則會出現(xiàn)低外顯率的現(xiàn)象[10-11]。對于包含RB1基因全部外顯子在內(nèi)的染色體小片段缺失突變(<1Mb),國內(nèi)外已報道的病例均與本研究中的先證者臨床表型一致,為雙眼RB[8,12],尚未見到攜帶RB1基因全部外顯子缺失突變而無RB臨床癥狀的研究報道,本研究中的先證者母親攜帶了與先證者相同的缺失突變而無臨床癥狀的原因可能與以下兩個方面的因素有關(guān),一方面可能與RB1基因的“二次突變”過程有關(guān);另一方面可能與RB1基因的表觀遺傳學(xué)有關(guān),RB1基因作為母源性印記基因,其印記中心位于第二內(nèi)含子的CpG85,該印記區(qū)控制著RB1的正常表達[13],不同親本來源的RB1突變在外顯率方面存在差異[14],詳細的機制還有待進一步的研究。

    RB1基因由于其突變類型的多樣化,在臨床基因檢測和產(chǎn)前診斷實踐中既要考慮點突變及小的插入/缺失突變,又要考慮外顯子及染色體大片段的拷貝數(shù)變異,甚至印記中心和啟動子區(qū)的甲基化改變情況。因此,目前Sanger測序或二代測序結(jié)合MLPA或熒光定量PCR的檢測策略被國內(nèi)外實驗室普遍采用[12]。

    [1] Wang Q, Du LQ, Wang Y, et al. Inhibitory effect of Rb94 gene combined with radiotherapy on growth of esophageal carcinoma cells of tumor-bearing nude mice[J]. J Jilin Univ (Med Ed),2017, 43(2): 220-224. [王芹, 杜利清, 王彥, 等. Rb94基因聯(lián)合放射治療對荷瘤裸小鼠食管癌細胞生長的抑制作用[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2017, 43(2): 220-224.]

    [2] Friend SH, Bernards R, Rogelj S, et al. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma[J]. Nature, 1986, 323(6089): 643-646.

    [3] Dimaras H, Gallie BL. Genetics of retinoblastoma and genetic counseling[M]//Rodriguez-Galindo C, Wilson MW.Retinoblastoma. Boston, MA: Springer US; 2010: 41-54.

    [4] Wang LN, Zhou SY, Zhang H, et al. Application of MLPA in prenatal diagnosis of 22q11.2 microdeletion syndrome[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2015, 50(1): 52-54. [王莉娜, 周世媛, 張華, 等. MLPA技術(shù)在22q11.2微缺失綜合征產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2015, 50(1): 52-54.]

    [5] Dimaras H, Kimani K, Dimba EA, et al. Retinoblastoma[J].Lancet, 2012, 379(9824): 1436-1446.

    [6] Usmanov RH, Kivela T. Predicted trends in the incidence of retinoblastoma in the Asia-Pacific region[J]. Asia Pac J Ophthalmol (Phila), 2014, 3(3): 151-157.

    [7] Dimaras H, Corson TW, Cobrinik D, et al. Retinoblastoma[J].Nat Rev Dis Primers, 2015, 1: 15021.

    [8] Mitter D, Ullmann R, Muradyan A, et al. Genotype-phenotype correlations in patients with retinoblastoma and interstitial 13q deletions[J]. Eur J Hum Genet, 2011, 19(9): 947-958.

    [9] Castera L, Dehainault C, Michaux D, et al. Fine mapping of whole RB1 gene deletions in retinoblastoma patients confirms PCDH8 as a candidate gene for psychomotor delay[J]. Eur J Hum Genet, 2013, 21(4): 460-464.

    [10] Xue K, Wu JH, Ren H, et al. Analysis of gene mutation in a Chinese family with low penetrance retinoblastoma[J]. Chin J Ocul Fundus Dis, 2015, 31(6): 553-555. [薛康, 吳繼紅, 任慧,等. 視網(wǎng)膜母細胞瘤低外顯率一家系基因研究[J]. 中華眼底病雜志, 2015, 31(6): 553-555.]

    [11] Du Q, Wang YH, Brenda L. Low-penetrance retinoblastoma due to exons 24 and 25 deletions in the Rb1 gene[J]. ChinJ Med Genet, 2002, 19(5): 7-11. [杜琴, 江悅?cè)A, L.Galli B. Rb1基因第24和25外顯子缺失導(dǎo)致低外顯性視網(wǎng)膜母細胞瘤[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2002, 19(5): 7-11.]

    [12] He MY, An Y, Gao YJ, et al. Screening of RB1 gene mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype-phenotype correlations[J]. Mol Vis,2014, 20: 545-552.

    [13] Kanber D, Berulava T, Ammerpohl O, et al. The human retinoblastoma gene is imprinted[J]. PLoS Genetics, 2009,5(12): e1000790.

    [14] Klutz M, Brockmann D, Lohmann DR. A parent-of-origin effect in two families with retinoblastoma is associated with a distinct splice mutation in the RB1 gene[J]. Am J Hum Genet, 2002,71(1): 174-179.

    猜你喜歡
    檢測
    QC 檢測
    “不等式”檢測題
    “一元一次不等式”檢測題
    “一元一次不等式組”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    “角”檢測題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測題
    “有理數(shù)”檢測題
    “角”檢測題
    “幾何圖形”檢測題
    少妇精品久久久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看| tube8黄色片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 狂野欧美激情性xxxx| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品少妇久久久久久888优播| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久久久久人人人人人| 免费少妇av软件| 深夜精品福利| 老司机靠b影院| 午夜福利视频精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色a级毛片大全视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产av国产精品国产| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 99国产精品一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 女同久久另类99精品国产91| 欧美日韩av久久| netflix在线观看网站| 大片免费播放器 马上看| 国产成人精品久久二区二区免费| 大片免费播放器 马上看| 香蕉久久夜色| 国产成+人综合+亚洲专区| 丰满少妇做爰视频| 不卡av一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 热99国产精品久久久久久7| 九色亚洲精品在线播放| 国产一区二区三区视频了| 妹子高潮喷水视频| 人妻一区二区av| 夜夜爽天天搞| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日本黄色日本黄色录像| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久精品国产综合久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 国产三级黄色录像| 十分钟在线观看高清视频www| 黑人操中国人逼视频| 久久久久久人人人人人| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 十八禁网站免费在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| av在线播放免费不卡| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产单亲对白刺激| 制服诱惑二区| 亚洲精品自拍成人| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品av久久久久免费| 最近最新免费中文字幕在线| 69精品国产乱码久久久| 日韩中文字幕视频在线看片| 在线看a的网站| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久久欧美国产精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲美女黄片视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 热99国产精品久久久久久7| 午夜激情av网站| 热re99久久精品国产66热6| 中文字幕制服av| 亚洲成人免费av在线播放| 成年动漫av网址| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99国产综合亚洲精品| 电影成人av| 99热网站在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产av国产精品国产| 亚洲国产成人一精品久久久| 叶爱在线成人免费视频播放| 中文字幕色久视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲人成电影免费在线| 热99国产精品久久久久久7| 一区福利在线观看| 香蕉国产在线看| 黄色a级毛片大全视频| 999精品在线视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 超碰成人久久| 国产伦理片在线播放av一区| 99热国产这里只有精品6| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 丰满迷人的少妇在线观看| 黄频高清免费视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 色综合婷婷激情| 在线观看免费视频日本深夜| 嫩草影视91久久| 国产精品久久久av美女十八| 18禁国产床啪视频网站| 90打野战视频偷拍视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 女警被强在线播放| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 69av精品久久久久久 | 国产免费现黄频在线看| 另类精品久久| 亚洲全国av大片| 精品久久久久久久毛片微露脸| 99热网站在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人精品在线电影| 在线播放国产精品三级| 亚洲专区中文字幕在线| 国产一区二区 视频在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产免费av片在线观看野外av| 在线观看免费日韩欧美大片| 丝袜美足系列| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产麻豆69| av不卡在线播放| 考比视频在线观看| 极品人妻少妇av视频| 在线 av 中文字幕| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲国产欧美在线一区| 妹子高潮喷水视频| 免费高清在线观看日韩| 欧美精品av麻豆av| 免费看a级黄色片| 欧美激情高清一区二区三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久免费观看电影| 黑人操中国人逼视频| 久久亚洲精品不卡| 三级毛片av免费| 不卡av一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 十八禁网站网址无遮挡| 久久久久视频综合| 又紧又爽又黄一区二区| 成人亚洲精品一区在线观看| 高清在线国产一区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久免费观看电影| 一区二区三区国产精品乱码| 精品人妻在线不人妻| 后天国语完整版免费观看| 亚洲av成人一区二区三| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 最新的欧美精品一区二区| 看免费av毛片| 国产淫语在线视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美精品啪啪一区二区三区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产成人啪精品午夜网站| 另类精品久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99国产精品99久久久久| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美精品av麻豆av| 国产福利在线免费观看视频| 黄色 视频免费看| 亚洲精品在线观看二区| 他把我摸到了高潮在线观看 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久中文看片网| 亚洲视频免费观看视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产男女超爽视频在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 男女边摸边吃奶| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产麻豆69| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品高清国产在线一区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 五月开心婷婷网| 男人操女人黄网站| 大码成人一级视频| 午夜福利视频精品| 午夜福利影视在线免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产免费现黄频在线看| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| av天堂久久9| 精品卡一卡二卡四卡免费| 成年人午夜在线观看视频| 蜜桃国产av成人99| 久久狼人影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产99久久九九免费精品| netflix在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| 嫩草影视91久久| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲av第一区精品v没综合| 免费看十八禁软件| 国产区一区二久久| 亚洲成人手机| 999精品在线视频| 91精品三级在线观看| 青草久久国产| 免费av中文字幕在线| 成年人午夜在线观看视频| 丝袜喷水一区| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久这里只有精品19| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲久久久国产精品| 久9热在线精品视频| 脱女人内裤的视频| 日韩视频在线欧美| 免费不卡黄色视频| 国产高清视频在线播放一区| 男女之事视频高清在线观看| 久久免费观看电影| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲少妇的诱惑av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久午夜亚洲精品久久| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲视频免费观看视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 夜夜夜夜夜久久久久| av网站在线播放免费| 手机成人av网站| 久久狼人影院| 亚洲黑人精品在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 久久香蕉激情| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美午夜高清在线| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产成人av激情在线播放| av欧美777| 夜夜夜夜夜久久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 久久性视频一级片| 欧美精品亚洲一区二区| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品国产av在线观看| 成人国产av品久久久| 看免费av毛片| 丁香六月天网| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩一区二区三区影片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产成人精品久久二区二区免费| 美女高潮到喷水免费观看| 制服人妻中文乱码| 另类亚洲欧美激情| 欧美成人免费av一区二区三区 | 国产xxxxx性猛交| 99香蕉大伊视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 成在线人永久免费视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美日本中文国产一区发布| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品一二三| 大片电影免费在线观看免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| 午夜老司机福利片| 亚洲全国av大片| 国产av又大| 黄色成人免费大全| 久久精品91无色码中文字幕| 国产精品免费视频内射| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品福利观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 国产成人免费观看mmmm| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲国产av影院在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 悠悠久久av| a在线观看视频网站| 热99国产精品久久久久久7| 成在线人永久免费视频| 午夜日韩欧美国产| 久热这里只有精品99| 欧美精品一区二区大全| 国产深夜福利视频在线观看| avwww免费| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩视频在线欧美| 51午夜福利影视在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 啦啦啦 在线观看视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产一卡二卡三卡精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 日韩有码中文字幕| 手机成人av网站| 大香蕉久久网| 亚洲avbb在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 69av精品久久久久久 | 91字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲专区字幕在线| 欧美午夜高清在线| 一本色道久久久久久精品综合| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久国产精品麻豆| 777米奇影视久久| 超碰成人久久| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美精品av麻豆av| 日本五十路高清| 久久国产精品大桥未久av| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产1区2区3区精品| 午夜福利视频在线观看免费| av网站免费在线观看视频| 色视频在线一区二区三区| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 热99久久久久精品小说推荐| 大香蕉久久成人网| 午夜激情久久久久久久| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费在线观看日本一区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久 | 午夜日韩欧美国产| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久免费观看电影| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲综合色网址| tube8黄色片| 婷婷丁香在线五月| 久热这里只有精品99| 高清在线国产一区| 精品少妇黑人巨大在线播放| xxxhd国产人妻xxx| 高清视频免费观看一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 老司机福利观看| 2018国产大陆天天弄谢| 五月天丁香电影| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产单亲对白刺激| 精品国产亚洲在线| 纵有疾风起免费观看全集完整版| xxxhd国产人妻xxx| 久久狼人影院| 亚洲国产av新网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 人妻一区二区av| www.精华液| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 中亚洲国语对白在线视频| 久久99热这里只频精品6学生| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av国产av综合av卡| 后天国语完整版免费观看| 成人国产av品久久久| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美国产精品一级二级三级| 免费少妇av软件| 日本一区二区免费在线视频| 国产亚洲一区二区精品| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品久久久久成人av| av有码第一页| 91老司机精品| 两个人免费观看高清视频| 在线av久久热| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 又大又爽又粗| 亚洲一区中文字幕在线| 免费观看人在逋| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲国产欧美在线一区| 99国产极品粉嫩在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 九色亚洲精品在线播放| 国产有黄有色有爽视频| 99精品在免费线老司机午夜| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 无人区码免费观看不卡 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 我要看黄色一级片免费的| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产男女内射视频| 国产精品影院久久| tocl精华| 激情视频va一区二区三区| 一级片免费观看大全| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 大陆偷拍与自拍| 午夜福利视频精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成人18禁在线播放| 国产xxxxx性猛交| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲伊人色综图| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av第一区精品v没综合| 一本久久精品| 国产精品九九99| 国产精品电影一区二区三区 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国精品久久久久久国模美| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 黑人操中国人逼视频| 精品福利永久在线观看| 超碰97精品在线观看| aaaaa片日本免费| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品一区二区免费欧美| 日韩视频一区二区在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产av又大| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产男女内射视频| 啦啦啦 在线观看视频| 又黄又粗又硬又大视频| 黄片大片在线免费观看| 午夜免费成人在线视频| www.熟女人妻精品国产| 岛国毛片在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| a在线观看视频网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲欧洲日产国产| 国产午夜精品久久久久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| a在线观看视频网站| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 国产一区二区激情短视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 大香蕉久久成人网| 精品亚洲成国产av| 久久国产精品人妻蜜桃| 叶爱在线成人免费视频播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 人妻 亚洲 视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产福利在线免费观看视频| 老司机靠b影院| 老司机午夜福利在线观看视频 | 大片电影免费在线观看免费| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一本大道久久a久久精品| 超色免费av| av线在线观看网站| 一级毛片电影观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲一区中文字幕在线| 最黄视频免费看| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产99久久九九免费精品| 欧美激情高清一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 桃花免费在线播放| 精品乱码久久久久久99久播| 午夜91福利影院| 视频在线观看一区二区三区| 精品人妻1区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成年版毛片免费区| 三级毛片av免费| 考比视频在线观看| 亚洲午夜理论影院| 中国美女看黄片| 亚洲精品在线观看二区| 搡老乐熟女国产| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲熟女毛片儿| 国产97色在线日韩免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品免费大片| 五月开心婷婷网| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人av教育| 热99久久久久精品小说推荐| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费人妻精品一区二区三区视频| 少妇精品久久久久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 国产成人精品无人区| 悠悠久久av| 欧美中文综合在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 女人精品久久久久毛片| 91精品三级在线观看| 国产精品国产高清国产av | 中文字幕高清在线视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线观看人妻少妇| 午夜免费鲁丝| 久久亚洲真实| 另类精品久久| 人人妻人人澡人人看| tube8黄色片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产高清激情床上av| 成人影院久久| a级片在线免费高清观看视频| 黄色a级毛片大全视频| 十八禁网站免费在线| 国产精品电影一区二区三区 | 亚洲性夜色夜夜综合| 我要看黄色一级片免费的| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| a在线观看视频网站| 免费在线观看影片大全网站| 99热国产这里只有精品6| 免费看a级黄色片| 国产成人免费观看mmmm| 免费在线观看完整版高清| 高清欧美精品videossex| 亚洲天堂av无毛| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国精品久久久久久国模美| 电影成人av| 日本五十路高清| 人人澡人人妻人| 51午夜福利影视在线观看| 午夜视频精品福利| 成人18禁在线播放| 极品教师在线免费播放| 激情视频va一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 女人久久www免费人成看片| 在线观看免费视频日本深夜| 99久久精品国产亚洲精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成年人午夜在线观看视频| 热99re8久久精品国产| a级片在线免费高清观看视频| 超碰成人久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产日韩欧美视频二区| 狂野欧美激情性xxxx| 国产免费现黄频在线看| 妹子高潮喷水视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频|