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    母系遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤家系RB1基因分析與產(chǎn)前診斷

    2018-07-09 03:28:54蘭小平許無恨湯曉君葉海昀楊永臣宋小珍張泓
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2018年6期
    關(guān)鍵詞:檢測

    蘭小平,許無恨,湯曉君,葉海昀,楊永臣,宋小珍,張泓

    視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,RB;OMIM 180200)是一種來源于未成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞的惡性罕見腫瘤[1],是最早發(fā)現(xiàn)的由基因突變而導(dǎo)致的腫瘤,該致病基因被命名為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1(RB1),因此RB1也成為了第一個(gè)被成功克隆的人類抑癌基因[2]。已有研究表明,90%的雙眼和15%的單眼RB患者外周血基因組DNA中均能檢測到RB1基因致病性雜合突變[3]。本研究采用Sanger測序與多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)相結(jié)合的策略[4]對一個(gè)中國漢族雙眼RB家系開展了基因檢測,并以檢測結(jié)果為依據(jù)對該家系開展了兩次產(chǎn)前診斷?,F(xiàn)報(bào)告如下。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象 為我國一漢族家系,先證者(Ⅱ-1)男,4歲,9月齡發(fā)病。臨床診斷為雙眼RB,右眼C期,左眼D期,患兒足月順產(chǎn),無窒息、吸氧史,為該家系第一胎。父母均身體健康,非近親婚配,均無其他遺傳病史,眼底檢查均無異常。

    1.2 樣本采集及DNA提取 為進(jìn)一步確診和對其父母再生育時(shí)的產(chǎn)前診斷提供依據(jù),在簽署知情同意書和上海市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的情況下,采集先證者及父母EDTA抗凝外周靜脈血3~5ml,基因組DNA提取采用試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)進(jìn)行。產(chǎn)前診斷羊水的采集在具有相關(guān)資質(zhì)的婦產(chǎn)科醫(yī)院完成,羊水基因組DNA的提取采用改進(jìn)的外周血基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。

    1.3 基因檢測方法 RB1基因點(diǎn)突變及小的插入/缺失檢測采用Sanger測序法,具體過程是從UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/,GRCh37/hg19)獲取RB1基因(NM_000321.1)啟動(dòng)子區(qū)、27個(gè)外顯子編碼區(qū)及內(nèi)含子與外顯子交界區(qū)基因組DNA序列,采用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7.0設(shè)計(jì)PCR及測序引物。測序?qū)嶒?yàn)采用PCR產(chǎn)物割膠純化的方法,采用基因分析儀(ABI 3500DX Genetic Analyzer)完成,結(jié)果比對分析采用Mutation Surveyor 4.0(SoftGenetics)軟件完成。RB1基因外顯子拷貝數(shù)變異的檢測采用多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)法,探針(P047-D1)及試劑均來自MRC-Holland公司,實(shí)驗(yàn)操作按說明書標(biāo)準(zhǔn)操作流程(http://www.mlpa.com)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)在T100TMThermal Cycler(Bio-Rad)PCR擴(kuò)增儀上完成,片段分析采用基因分析儀(ABI 3500DX Genetic Analyzer)完成,結(jié)果分析采用GeneMarker V2.2.0(SoftGenetics)軟件完成。

    1.4 產(chǎn)前診斷方法 對本研究中RB1基因整體雜合缺失突變的產(chǎn)前診斷采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA),產(chǎn)前診斷中母體DNA污染的排除采用檢測STR位點(diǎn)的方法進(jìn)行,每次實(shí)驗(yàn)中均以胎兒父母DNA樣本分別作為陰性和陽性對照。

    2 結(jié) 果

    2.1 家系基因檢測結(jié)果 該家系包括2名產(chǎn)前診斷胎兒在內(nèi)共5名成員(圖1A),Sanger測序未檢測到先證者Ⅱ-1 RB1基因啟動(dòng)子區(qū)、27個(gè)外顯子及其外顯子兩端15bp內(nèi)含子區(qū)存在致病性點(diǎn)突變和小的插入/缺失突變。MLPA檢測結(jié)果顯示,先證者Ⅱ-1 RB1基因1-27號(hào)外顯子雜合缺失(圖1B),該缺失包含RB1基因上游的ITM2B基因和下游RCBTB2基因,但不包含上游的ENOX1基因和下游DLEU1和PCDH8基因,母親Ⅰ-2同樣存在該缺失突變(圖1C),父親Ⅰ-1拷貝數(shù)正常(圖1D),因此可確定先證者的缺失突變來自母親遺傳。

    2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果 針對該家系第一胎存在RB1基因1-27號(hào)外顯子雜合缺失的基因檢測結(jié)果,第二胎產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示,胎兒Ⅱ-2為該突變的男性攜帶者(圖1E),家長最后選擇終止妊娠;第三胎產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示,胎兒Ⅱ-3為RB1基因外顯子拷貝數(shù)正常的女性(圖1F),該胎兒出生后眼底檢查結(jié)果正常。由于MLPA檢測探針設(shè)計(jì)的特殊性,兩次產(chǎn)前診斷試驗(yàn)均可通過性別探針排除母體DNA污染的可能性,這一結(jié)果與STR位點(diǎn)檢測結(jié)果一致。

    圖1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤家系(A)和MLPA檢測結(jié)果(B-F)Fig.1 Pedigree of retinoblastoma (A) and MLPA detection results (B-F)

    3 討 論

    視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤多發(fā)于5歲之前的嬰幼兒,全世界新生兒發(fā)病率基本恒定在1/15 000~1/20 000,每年新增患者約9000例[5]。我國人口出生率高,每年新增患者數(shù)量在亞太地區(qū)排名第二,約為1103例,僅次于排名第一的印度(1468例)[6]。RB根據(jù)其患眼可分為單側(cè)發(fā)病和雙側(cè)發(fā)病,分別約占60%和40%,極少一部分雙側(cè)患兒合并顱中線上的松果體腫瘤,稱為三側(cè)性RB,約45%的患者血液DNA中存在RB1基因致病性雜合突變[7]。因此,利用外周血基因組DNA對RB患者及親屬開展基因檢測,對其早期確診、治療、再生育遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷具有重要意義。本研究中先證者為雙眼RB,RB1基因檢測結(jié)果表明該患者存在RB1基因的整體雜合缺失,而且父母檢測結(jié)果表明該缺失突變來自健康無病的母親,因此對該先證者父母再生育胎兒開展了產(chǎn)前基因診斷。

    截止2016年3月,人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)共收錄RB1基因與RB相關(guān)的各類突變980個(gè),包括錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變、可變剪接、插入/缺失及染色體重排,其中缺失突變占15.2%(149個(gè))。包含BR1基因在內(nèi)的染色體缺失片段大小與RB發(fā)生的相關(guān)性研究表明:當(dāng)缺失片段大于1Mb時(shí),個(gè)體通常為單眼發(fā)病RB患者或無RB癥狀攜帶者,但會(huì)出現(xiàn)特殊容貌、身材矮小、精神發(fā)育遲滯、肌張力低下、腦及心臟發(fā)育異常等綜合征特征;當(dāng)缺失范圍僅限于RB1基因及其兩端較小范圍時(shí),臨床表型與缺失片段所包含的基因直接相關(guān),缺失片段僅包含RB1及上游ITM2B基因時(shí),所有患者均為雙眼發(fā)病,而缺失片段同時(shí)包括RB1及上游ITM2B和MED4基因時(shí),患者通常為單眼發(fā)病,表明MED4基因的缺失具有抑制RB1發(fā)生的趨勢[8]。同樣有研究表明RB1基因下游PCDH8基因缺失與精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩有關(guān)[9]。由此可見,當(dāng)先證者出現(xiàn)RB1基因完全缺失時(shí),缺失片段的大小以及上下游缺失基因的種類對先證者臨床表型的評(píng)估具有重要的參考意義。本研究中的先證者為RB1基因的完全缺失,上游缺失包含了ITM2B基因,而未出現(xiàn)ENOX1基因的缺失,下游缺失包含了RCBTB2基因,而未到達(dá)PCDH8基因,這一結(jié)果與先證者僅出現(xiàn)雙眼RB,而無其他臨床癥狀的結(jié)果是一致的,由于本研究所用MLPA試劑盒未在ITM2B基因上游的MED4基因中設(shè)置檢測探針,因此無法確定MED4基因是否缺失。

    遺傳性RB的外顯率高達(dá)90%以上,RB1基因的移碼突變和無義突變通常為完全顯性,而錯(cuò)義突變、可變剪接突變、非移碼的插入/缺失及啟動(dòng)子區(qū)突變則會(huì)出現(xiàn)低外顯率的現(xiàn)象[10-11]。對于包含RB1基因全部外顯子在內(nèi)的染色體小片段缺失突變(<1Mb),國內(nèi)外已報(bào)道的病例均與本研究中的先證者臨床表型一致,為雙眼RB[8,12],尚未見到攜帶RB1基因全部外顯子缺失突變而無RB臨床癥狀的研究報(bào)道,本研究中的先證者母親攜帶了與先證者相同的缺失突變而無臨床癥狀的原因可能與以下兩個(gè)方面的因素有關(guān),一方面可能與RB1基因的“二次突變”過程有關(guān);另一方面可能與RB1基因的表觀遺傳學(xué)有關(guān),RB1基因作為母源性印記基因,其印記中心位于第二內(nèi)含子的CpG85,該印記區(qū)控制著RB1的正常表達(dá)[13],不同親本來源的RB1突變在外顯率方面存在差異[14],詳細(xì)的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

    RB1基因由于其突變類型的多樣化,在臨床基因檢測和產(chǎn)前診斷實(shí)踐中既要考慮點(diǎn)突變及小的插入/缺失突變,又要考慮外顯子及染色體大片段的拷貝數(shù)變異,甚至印記中心和啟動(dòng)子區(qū)的甲基化改變情況。因此,目前Sanger測序或二代測序結(jié)合MLPA或熒光定量PCR的檢測策略被國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室普遍采用[12]。

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