綠絨蒿屬藏藥植物ndhF和rbcL序列片段特征分析

（西南林業(yè)大學(xué) 園林植物與觀賞園藝省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 園林學(xué)院，云南 昆明 650224）

綠絨蒿屬M(fèi)econopsis Vig.是著名的觀賞植物，共49種，1種產(chǎn)于西歐，其他產(chǎn)于亞洲溫帶的中南部，以喜馬拉雅及我國(guó)西南部為分布中心，東達(dá)湖北西部。我國(guó)約有38種，西藏產(chǎn)約27種[1-3]。在我國(guó)藏族集居地區(qū)，自古以來(lái)就有記載綠絨蒿屬部分種類(lèi)可以入藥，如公元八世紀(jì)的《月王藥診》[4]，以及后世的《四部醫(yī)典》[5]、《晶珠本草》[6]等[7]。本屬植物的分布范圍局限、生境狹窄，且在西藏不同地區(qū)作為藏藥使用的種僅靠花色區(qū)分，存在同名異物的問(wèn)題，易于混淆。藏藥“歐貝”有清熱解毒、利尿消炎、止痛的功效[8]。而在藏醫(yī)學(xué)中又認(rèn)為不同花色的綠絨蒿具有不同的治療功效，因此在“歐貝”下又分了藍(lán)色花的“歐貝完?！保ㄎ迕}綠絨蒿M.quintuplinervia、毛瓣綠絨蒿M.torquata、長(zhǎng)葉綠絨蒿M.lancifolia）、紅色花的“歐貝瑪保”（紅花綠絨蒿M.punicea）和黃色花的“歐貝賽?！?全緣葉綠絨蒿M.integrifolia)，但是在花干以后很難辨別起品種。局部地區(qū)也將滇西綠絨蒿作“歐貝完保”使用，將尼泊爾綠絨蒿、錐花綠絨蒿作“歐貝賽保”的替代品使用[3]。藏藥“刺兒恩”有更統(tǒng)一的來(lái)源認(rèn)知（總狀綠絨蒿M.racemosa和多刺綠絨蒿M.horridula）有活血化瘀和止痛的功效[9]。

由于藏藥來(lái)源渠道的多樣性以及傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)鑒別方法的局限性，需要更準(zhǔn)確的鑒別方法來(lái)對(duì)藥材進(jìn)行鑒別。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，DNA條形碼被大量應(yīng)用于不同物種。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)短的DNA片段，當(dāng)前獲得普遍接受的是葉綠體的rbcL（ribulose-15-bisphosphate carboxylase/oxygenase large）、trnL-F、matK（maturase K）、ndhF（NADH dehydrogenase）和psbA-trnH序列，以及核基因的ITS（internal transcribed spacer）序列[10-13]。已有學(xué)者應(yīng)用葉綠體psbA-trnH序列結(jié)合核基因ITS進(jìn)行綠絨蒿屬藏藥植物的鑒別[13]。DNA條形碼因其能準(zhǔn)確、快速的鑒別物種，被大量應(yīng)用于藥材的鑒別，對(duì)解決長(zhǎng)久以來(lái)的植物辨識(shí)錯(cuò)誤具有明顯的優(yōu)勢(shì)。rbcL和ndhF序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度適宜，比對(duì)容易，而且表現(xiàn)出較高水平的遺傳變異。但至目前為止，還沒(méi)有學(xué)者利用葉綠體ndhF片段結(jié)合rbcL片段進(jìn)行綠絨蒿屬藏藥植物的鑒別。

本實(shí)驗(yàn)采集了“歐貝”和“刺兒恩”不同種的基原植物材料，通過(guò)ndhF和rbcL序列擴(kuò)增測(cè)序并分析差異，以期為藏藥植物的分子鑒別方法提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

本實(shí)驗(yàn)所需材料為哈佛大學(xué)標(biāo)本館采集的標(biāo)本和野外采集的野生植物樣本，材料來(lái)源如表1所示。

表1 樣品來(lái)源與標(biāo)本憑證Table 1 Sample sources and voucher specimens

1.2 方 法

取樣品材料放入1.5 mL離心管中，加液氮冷凍樣本，用手持勻漿機(jī)快速研磨至樣品成粉末狀，然后用Omega試劑盒進(jìn)行總DNA的提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取結(jié)果，并用分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度和純度。rbcL序列的引物參考五脈綠絨蒿M.quintuplinervia FJ626613.1和虞美人（apaver rhoeas L.DQ912900.1；ndhF序列的引物參考五脈綠絨蒿M.quintuplinervia JX087831.1和磚紅罌粟JX087813 Papaver lateritium JX087813。所用PCR反應(yīng)試劑為上海近岸科技有限公司所生產(chǎn)的2×Power Taq PCR MasterMix，總反應(yīng)體系為50 uL：2×MasterMix 25 uL；DNA模板1 uL；上游引物2 uL；下游引物2 uL；ddH2O 20 uL。PCR 條件為 98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 10 s，72 ℃10 s，72 ℃5 min，4 ℃終止保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

rbcL序列的邊界根據(jù)GenBank 中的近緣種五脈綠絨蒿FJ626613.1和虞美人DQ912900.1的序列來(lái)確定；ndhF序列的邊界根據(jù)GenBank 中的近緣種五脈綠絨蒿JX087831.1和磚紅罌粟JX087813的序列來(lái)確定。用DNAstar中的EditSeq軟件進(jìn)行序列編輯，所得DNA序列經(jīng)ClustalX進(jìn)行多重對(duì)比排列，對(duì)測(cè)序議誤讀和漏讀的個(gè)別堿基進(jìn)行人工校對(duì)，調(diào)整減少排列所需的gap的數(shù)目。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入MEGA6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類(lèi)分析，計(jì)算各序列間的Kimura2遺傳距離，以遺傳距離距陣為基礎(chǔ)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)并且計(jì)算轉(zhuǎn)換/顛換率。

2 結(jié)果與分析

2.1 六種綠絨蒿序列長(zhǎng)度與GC含量分析

2.1.1 rbcL序列長(zhǎng)度與GC含量分析

綠絨蒿rbcL序列長(zhǎng)度與GC含量，如表2所示。

表2 8個(gè)分類(lèi)群rbcL序列長(zhǎng)度和GC含量Table 2 8 taxa of rbcL sequence length and GC content

2.1.2 ndhF序列長(zhǎng)度與GC含量分析

綠絨蒿ndhF序列長(zhǎng)度與GC含量，如表3所示。

表3 4個(gè)分類(lèi)群ndhF序列長(zhǎng)度和GC含量Table 3 4 taxa of ndhF sequence length and GC content

2.2 遺傳距離

rbcL序列和ndhF序列成對(duì)比較時(shí)不同分類(lèi)群間存在能明顯區(qū)分各分類(lèi)群的變異位點(diǎn)，差異位點(diǎn)如表4和表5上三角區(qū)所示。

表4 8個(gè)分類(lèi)群rbcL序列成對(duì)比較時(shí)的遺傳距離（上三角：變異位點(diǎn)；下三角：遺傳距離）Table 4 8 taxa rbcL genetic distance (the upper triangle: mutation; triangle: genetic distance)

表5 7個(gè)分類(lèi)群ndhF序列成對(duì)比較時(shí)的遺傳距離（上三角：變異位點(diǎn)；下三角：遺傳距離）?Table 5 7 taxa ndhF genetic distance (the upper triangle: mutation; triangle: genetic distance)

2.3 變異位點(diǎn)分析

2.3.1 rbcL序列變異位點(diǎn)分析

8個(gè)分類(lèi)群和2個(gè)外類(lèi)群rbcL序列末端截齊后總長(zhǎng)度為761 bp，成對(duì)比較后共有個(gè)729保守位點(diǎn)，保守位點(diǎn)占總位點(diǎn)的95.79%；除去外類(lèi)群有31個(gè)變異位點(diǎn)（表6所示）。任意兩組比較，均有位點(diǎn)變異情況。其中全緣葉綠絨蒿兩個(gè)居群間存在5個(gè)不相同的變異位點(diǎn)，總狀綠絨蒿兩個(gè)居群間存在5個(gè)不相同的變異位點(diǎn)。

2.3.2 ndhF序列變異位點(diǎn)分析

7個(gè)分類(lèi)群和2個(gè)外類(lèi)群ndhF序列末端截齊后總長(zhǎng)度為949 bp，成對(duì)比較后共有918個(gè)保守位點(diǎn)，保守位點(diǎn)占總位點(diǎn)的96.73%；除兩個(gè)外類(lèi)群外共有31個(gè)變異位點(diǎn)，6個(gè)缺失位點(diǎn)。除多刺綠絨蒿與總狀綠絨蒿（居群2）無(wú)差異外，任意兩組比較，均有位點(diǎn)變異情況。

表6 8個(gè)分類(lèi)群rbcL序列成對(duì)比較時(shí)的變異位點(diǎn)值?Table 6 8 taxa rbcL sequence mutation

表7 7個(gè)分類(lèi)群ndhF序列成對(duì)比較時(shí)的變異位點(diǎn)值Table 7 7 taxa ndhF sequence mutation

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

rbcL聚類(lèi)樹(shù)如圖1所示，外類(lèi)群罌粟屬植物虞美人首先分離為一枝，表現(xiàn)出與綠絨蒿屬有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；總狀綠絨蒿居群2與多刺綠絨蒿聚為一枝，與總狀綠絨蒿居群1聚類(lèi)；紅花綠絨蒿與長(zhǎng)葉綠絨蒿分別單獨(dú)為一枝；尼泊爾綠絨蒿與五脈綠絨蒿聚為一枝，與全緣葉綠絨蒿居群1和居群2聚類(lèi)，表現(xiàn)出了更近的親緣關(guān)系。

如圖2所示，外類(lèi)群罌粟屬植物磚紅罌粟首先分離為一枝，表現(xiàn)出與綠絨蒿屬有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；多刺綠絨蒿與總狀綠絨蒿（居群1）聚為一枝，與總狀綠絨蒿（居群2）和長(zhǎng)葉綠絨蒿聚為一類(lèi)；紅花綠絨蒿與五脈綠絨蒿聚為一枝；全緣葉綠絨蒿居群1與全緣葉綠絨蒿居群2聚為一枝；五脈綠絨蒿、紅花綠絨蒿和全緣葉綠絨蒿之間表現(xiàn)出了更近的親緣關(guān)系。

圖1 基于rbcL序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（鄰聚法）Fig.1 The phylogenetic tree of rbcL gene (Neighber-joining)

圖2 基于ndhF序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（鄰聚法）Fig.2 The phylogenetic tree of ndhF gene (Neighber-joining)

3 結(jié)論與討論

本次實(shí)驗(yàn)的主要目的是通過(guò)比對(duì)6種藏藥綠絨蒿基源植物的rbcL和ndhF序列的特征和差異，為準(zhǔn)確的進(jìn)行綠絨蒿屬常見(jiàn)藥材鑒別提供依據(jù)。為了獲得更加準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從GenBank下載了五脈綠絨蒿、虞美人與磚紅罌粟三個(gè)近緣物種的rbcL和ndhF序列與之共同進(jìn)行比對(duì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同種植物不同居群之間GC含量和遺傳距離存在一定差異；在對(duì)任意兩組序列進(jìn)行變異位點(diǎn)比較時(shí)，均能通過(guò)位點(diǎn)變異的情況進(jìn)行區(qū)分；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建可以更直觀的看出藏藥歐貝和刺兒恩之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，歐貝完保、歐貝賽保、歐貝瑪保分別聚為一枝，可以通過(guò)聚類(lèi)分析進(jìn)行區(qū)分。運(yùn)用rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中尼泊爾綠絨蒿與藏藥“歐貝”有比較近的親緣關(guān)系，運(yùn)用rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中尼泊爾綠絨蒿單獨(dú)聚為一枝，與藏藥“歐貝”、“刺兒恩”有較明顯的差異。

倪梁紅等學(xué)者[10]在利用核基因序列ITS和葉綠體片段psbA-trnH進(jìn)行綠絨蒿屬藏藥鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)，ITS分析顯示多刺綠絨蒿和總狀綠絨蒿的序列一致，結(jié)合葉綠體片段psbA-trnH可將兩者有效區(qū)分。有學(xué)者基于ITS序列的分析[14]，建議多刺綠絨蒿應(yīng)與總狀綠絨蒿合并為一個(gè)種，或結(jié)合形態(tài)學(xué)差異，將其中一個(gè)處理為另一個(gè)的變種。本實(shí)驗(yàn)中的總狀綠絨蒿居群1與居群2和多刺綠絨蒿rbcL序列有不同的變異位點(diǎn)，由于樣品采集生境的不同，不確定是否是環(huán)境影響導(dǎo)致出現(xiàn)變異位點(diǎn)；ndhF序列中總狀綠絨蒿居群1與多刺綠絨蒿無(wú)明顯差異，這一結(jié)果將對(duì)兩者的分類(lèi)地位提供有價(jià)值的參考。

從同一藥材的不同產(chǎn)地來(lái)看，總狀綠絨蒿居群1采自青海省，總狀綠絨蒿居群2采自云南省，其不同居群間仍然存在位點(diǎn)變異。全緣葉綠絨蒿不同居群之間也存在位點(diǎn)差異，這些差異可能是因?yàn)樯鷳B(tài)環(huán)境、標(biāo)本采集年份等造成的影響。因此，這還需要進(jìn)一步進(jìn)行居群的采樣和藥材產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境的分析。

本實(shí)驗(yàn)選用的rbcL序列是穩(wěn)定性較好的常用DNA條形碼，而ndhF基因比其他葉綠體編碼基因的堿基替代速率高、進(jìn)化速率快。但由于綠絨蒿屬雜交頻繁，染色體多倍化現(xiàn)象較為普遍，因此后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)行葉綠體DNA片段的有效篩選，再適當(dāng)增加用于分析的葉綠體片段數(shù)目，采用多片段聯(lián)合分析的方法將更有利于綠絨蒿屬鑒別。同時(shí)，應(yīng)該注意的是，葉綠體采用單親遺傳，且相對(duì)保守，可用于系統(tǒng)發(fā)育重建的信息有限。近年來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得具有單拷貝或低拷貝的直系同源的核基因已被廣泛用于科及科以下的親緣關(guān)系分析，如有學(xué)者從17種十字花科植物中得到了5個(gè)編碼蛋白的單核拷貝基因序列，重建了它們之產(chǎn)的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，這些基因能提供更多的信息位點(diǎn)[15]。因此，后續(xù)研究可以通過(guò)獲得核基因，結(jié)合葉綠體片段聯(lián)合分析，將更加全面深入地為綠絨蒿屬的分類(lèi)及系統(tǒng)發(fā)育提供借鑒。

根據(jù)文獻(xiàn)記載，在西藏部分地區(qū)，尼泊爾綠絨蒿作為“歐貝賽?！比壢~綠絨蒿的代替品使用，具有清熱止咳的療效。rbcL序列聚類(lèi)分析結(jié)果顯示尼泊爾綠絨蒿與五脈綠絨蒿聚為一枝，藏藥“歐貝”一般按照花色進(jìn)行分類(lèi)使用，尼泊爾綠絨蒿花為藍(lán)色，作為“歐貝賽?！笔褂眠€是作為“歐貝完?！笔褂酶鼮楹线m還需進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證?，F(xiàn)今藏藥基源植物與典籍記載的傳統(tǒng)來(lái)源有不少出入，品種較多、來(lái)源較復(fù)雜直接降低了藏藥鑒別的準(zhǔn)確性，利用多片段相結(jié)合，如核基因序列ITS與葉綠體基因序列（rbcL、matK、trnL-F、psbL-psbK、psbA-trnH等）相結(jié)合[16-18]，可以更為快速準(zhǔn)確的對(duì)物種進(jìn)行鑒別，對(duì)未來(lái)種間和種內(nèi)的遺傳變異和遺傳多樣性研究[19-21]提供科學(xué)準(zhǔn)確的物種信息有著重要意義，對(duì)綠絨蒿屬藏藥植物的合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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